來自小麥的糖級(jí)分、分離方法以及發(fā)明的應(yīng)用領(lǐng)域的制作方法
【專利摘要】描述了從發(fā)芽的且浸漬在水中的小麥種子提取的級(jí)分，該級(jí)分具有包括在3和30千道爾頓之間的分子量。
【專利說明】來自小麥的糖級(jí)分、分離方法以及發(fā)明的應(yīng)用領(lǐng)域

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及天然提取物、特別是來自谷物的提取物的領(lǐng)域，并且涉及用于它們的 分離的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前，蛋白質(zhì)型（諸如例如生長(zhǎng)因子）或甘氨酸型（諸如例如透明質(zhì)酸、未處理 的淀粉或水解的淀粉及其級(jí)分、其它GAG、葡胺聚糖等等）的大分子以及從各種植物（例 如，蘆薈（Aloe vera)、積雪草（Centellaasiatica)等等）得到的化學(xué)上不確定的提取物 (chemically undefined extract)的臨床應(yīng)用和化妝品應(yīng)用已變得普遍化，這些產(chǎn)品廣泛 地應(yīng)用于例如包括表皮組織的疾?。ɡ鐐诨驖儯┲谢蛘哂糜诨瘖y品目的。
[0003] 在EP 743 323(以相同 申請(qǐng)人:的名義）中，例如，描述了從淀粉得到的糖級(jí)分。
[0004] 在一些研宄中，參見例如，D'Agostino 等人的 "A fraction purified from Triticumvulgare has trophic effects on Ca⑶-2" [GASTROENTEROLOGY, ELSEVIE R，PHILADELPHIA, vol. 104,n。4,Suppl, IJanuary 1993,pp.819]和在 Fiore 等人的 "Differential activities of Triticumvulgare extract and its fractions in mouse fibroblasts"[ACTA THERAPEUTICA Vol. 19，n。2, 1993pages 151 - 162]中，描述了獲得的 糖級(jí)分而未具體說明用于使植物發(fā)芽和生長(zhǎng)的方法，且其還含有肽級(jí)分、己糖和己糖胺。
[0005] 這些提取物用作上皮再生階段的刺激劑且由此的疤痕形成的刺激劑，諸如皮膚刺 激情況下的安撫劑，例如潤(rùn)膚劑，并且一般用于皮膚和粘膜的所有非感染性紊亂。
[0006] 還針對(duì)上面提到的類型的新化合物的分離進(jìn)行研宄，不僅用以擴(kuò)寬產(chǎn)物用于上面 提到的目的的可用性，而且用以分離具有增強(qiáng)的活性的化合物，而且用以在沒有過高成本 的情況下得到產(chǎn)物，諸如例如，生長(zhǎng)因子和上述的多種葡萄糖材料。
[0007] 然而，正如已經(jīng)述說的，上述的所有天然提取物（包括小麥提取物）皆由不確定且 增大的數(shù)量的各種類型的物質(zhì)和/或大分子組成，它們的大多數(shù)還未被鑒定；然而，把活性 歸因于任何經(jīng)鑒定的成分并不總是可能的。
[0008] 這也是用于得到植物材料和可以任選地從其純化的級(jí)分的方法未以標(biāo)準(zhǔn)化方式 進(jìn)行完全描述的原因。
[0009] 相反，且出人意料地，作為本發(fā)明的主題以及被鑒定且化學(xué)表征的級(jí)分，表現(xiàn)出總 提取物的所有活性并由此代表負(fù)責(zé)提供總提取物的作用的要素。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1表示通過分別分析參考空白（水）、根據(jù)本發(fā)明的級(jí)分（在圖中被標(biāo)記為CP 級(jí)分）和從中分離根據(jù)本發(fā)明的方法的第（d)段中所得到的級(jí)分的、在圖中被指定為TVE 的級(jí)分而得到的色譜圖。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 描述了從在水中浸漬的小麥的胚芽提取的級(jí)分，該級(jí)分具有3至30千道爾頓范圍 內(nèi)的分子量。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 本發(fā)明涉及從在水中浸漬的小麥的胚芽得到的提取物的級(jí)分，其具有生長(zhǎng)因子典 型的許多生物學(xué)特征，只是它明顯地是植物來源和動(dòng)物來源，并且具有多糖而非蛋白質(zhì)的 化學(xué)結(jié)構(gòu)；所述完全非預(yù)期的特性使得該級(jí)分對(duì)制備可用于治療傷口和潰瘍的藥物和產(chǎn)品 而言特別有益。
[0013] 更具體而言，本發(fā)明涉及在如關(guān)于現(xiàn)有技術(shù)所述的上文所描述的一般用于得到已 經(jīng)已知的類似提取物的條件下從發(fā)芽的小麥的種子得到的級(jí)分，其具有3至30千道爾頓范 圍內(nèi)的分子量。
[0014] 應(yīng)當(dāng)牢記在心，根據(jù)本發(fā)明的級(jí)分不存在于未發(fā)芽的種子中，并且只有或主要是 該級(jí)分（即，在3-30千道爾頓范圍內(nèi)的級(jí)分）具有上述性能。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，該方法提供根據(jù)已知方法從發(fā)芽的小麥得到的原始提取物的制備和 后續(xù)的活性級(jí)分的純化。
[0016] 上面提到的方法包括下列步驟：
[0017] a)使小麥種子在水中和/或在惰性的天然或人工生長(zhǎng)支持物上在任何光（優(yōu)選在 黑暗中）、濕度（優(yōu)選在超過60%的濕度）、溫度（優(yōu)選在5_20°C)條件下發(fā)芽，優(yōu)選產(chǎn)出 生長(zhǎng)至高度為3-15cm的芽；
[0018] b)在85_125°C范圍內(nèi)的溫度下加熱得到的植物材料（任選地預(yù)防性地壓碎成小 尺寸，并且添加水），任選地添加水，以準(zhǔn)備下一個(gè)步驟并且防止微生物生長(zhǎng)；
[0019] C)浸漬得到的材料，將其放在水中（優(yōu)選在pH 2-4)并且任選地留置使其在低溫 下浸漬（最高10°c);
[0020] d)借助于過濾、壓制或者借助于諸如提取器的其它等同系統(tǒng)清除固體殘澄，以得 到可被滅菌的第一澄清溶液（理解為原始提取物）；
[0021] e)從上文提到的溶液純化具有3, 000至30, 000道爾頓之間的分子量的級(jí)分，從而 得到具有提高的百分比含量的活性級(jí)分的第二溶液；
[0022] f)從上文提到的第二溶液分離特征為3, 000至30, 000范圍內(nèi)分子量的純化的活 性級(jí)分。
[0023] 若需要，則可以在步驟a)之前利用純化水使種子潤(rùn)濕。
[0024] 根據(jù)常規(guī)技術(shù)優(yōu)選在高壓滅菌器中進(jìn)行步驟b)和步驟d)中提到的滅菌。
[0025] 步驟c)優(yōu)選在2和4之間的pH下進(jìn)行，優(yōu)選持續(xù)1-72小時(shí)。
[0026] 步驟c)和步驟d)中固體殘澄的清除可以以卷制（curling)方法進(jìn)行。在這種情 況下，將步驟d)中得到的溶液替代步驟c)中的水添加至根據(jù)步驟b)的發(fā)芽的新幼苗，并 且重復(fù)步驟c-d。這樣可得到更高的產(chǎn)率。
[0027] 具有低于3000的分子量的級(jí)分和高于30, 000的分子量的級(jí)分的清除（步驟e) 可以通過本領(lǐng)域?qū)＜乙阎某Ｒ?guī)方法進(jìn)行，例如借助于凝膠過濾或超濾。
[0028] 照此類推，感興趣的級(jí)分借助于上文提到的技術(shù)被分離。
[0029] 迄今為止所提到的分子量意圖指用于純化作為本發(fā)明的主題的級(jí)分的超濾膜： 此類值涉及球狀蛋白質(zhì)且因此僅被視作指示自其分離的級(jí)分的真實(shí)分子量：用以選擇所 討論的級(jí)分的所有更多的理由（all the more reason to select the fraction under discussion)，其是糖類型并且具有直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)，因此恰恰不是球狀。
[0030] 在其最終形式中，作為本發(fā)明的主題的級(jí)分可以使用常規(guī)方法干燥或凍干，或優(yōu) 選地以已知且預(yù)定的濃度留在水溶液中；任選地添加防腐劑和/或被滅菌。
[0031] 通過下列具體實(shí)施例將更清晰地說明上文一般描述的方法：
[0032] 實(shí)施例
[0033] L 發(fā)芽
[0034] 將5kg潤(rùn)濕的木纖維素分配至一系列合適的鋼罐內(nèi)；在其上，接下來使預(yù)先用水 潤(rùn)濕的2. 4kg小麥種子分散；在空調(diào)室中允許該種子在黑暗中發(fā)芽數(shù)天（4-10天）直至得 到高度為5-15cm的幼苗。生長(zhǎng)期間，通過添加足量的水來每天潤(rùn)濕支持物。
[0035] 該室的溫度維持在5_20°C的范圍內(nèi)；且相對(duì)濕度為彡60%。
[0036] 2.加熱
[0037] 將罐的內(nèi)容物放在合適的、氣密封的容器中，然后在1大氣壓（~ 121°C )下高壓 滅菌1小時(shí)。
[0038] 3.浸漬和提取
[0039] 然后，將材料轉(zhuǎn)移至合適容量的鋼容器內(nèi)，并添加1001含有120ml的10% v/v硫 酸和60ml的10% v/v鹽酸的純化水?？梢允菇n進(jìn)行1-72小時(shí)。然后在300大氣壓的壓 力下提取水相，并且清除耗盡的固相。
[0040] 使由此得到的液體（定義為"第一壓制"）補(bǔ)充120ml 10% v/v硫酸和60ml 10% v/v鹽酸，并且與其它罐的另外的等同數(shù)量的內(nèi)容物（the contents of a further equivalent number of other tanks)混合。然后重復(fù)被描述為"第一壓制"的程序，由此 得到"第二壓制"。
[0041] 再次重復(fù)相同的操作，由此得到"第三壓制"和"第四壓制"。
[0042] 當(dāng)將液相放置成與植物材料接觸以進(jìn)行提取時(shí)，使液相有力地混合并且接下來在 冷處（5-9°C )保持約24-72小時(shí)。
[0043] 也可以使最終的液體在冷處（5-9°C )保持大約24至72小時(shí)。
[0044] 4.過濾和滅菌
[0045] 來自第四壓制的液體通過常規(guī)方法來過濾；然后，在合適的容器中，在1大氣壓下 通過施加相當(dāng)于1小時(shí)的周期來高壓滅菌該液體。
[0046] 5.超濾
[0047] 使用具有3千道爾頓的截?cái)嘀档臑V筒的合適的超濾儀器，將上文得到的液體超濾 至該儀器所允許的最大值；將水添加至剩余的液體，并重復(fù)超濾2-3次以棄掉洗脫相中所 含有的較低分子量。
[0048] 然后，使用相同的方法但是用具有30千道爾頓的截?cái)嘀档钠渌鼮V筒取代該濾筒， 進(jìn)一步超濾含有大于3, 000道爾頓的分子量的殘?jiān)喝欢?，在這種情況下剩余的殘?jiān)?大于30, 000千道爾頓的分子量并且被棄掉，同時(shí)洗脫相含有具有3, 000至30, 000道爾頓 范圍內(nèi)的分子量的活性級(jí)分。
[0049] 然后，照原樣或在合適的支持物上凍干（或干燥）含有活性級(jí)分的溶液；或者使其 滅菌（照原樣，添加防腐劑，例如2% w/w苯氧乙醇）。
[0050] A.關(guān)于活性級(jí)分的化學(xué)數(shù)據(jù)
[0051] 1.該級(jí)分的色譜分析
[0052] 選擇連接有PAD檢測(cè)器（脈沖安培檢測(cè)器）的、尤其是標(biāo)明用于碳水化合物分析 的HPAE (高壓陰離子交換）色譜系統(tǒng)。
[0053] 色譜系統(tǒng)具有下列特征：
[0054] -具備具有二元梯度的線性洗脫的泵的系統(tǒng)
[0055] 洗脫液 1 :0· 5M NaOH
[0056] 洗脫液2 :0· 5M NaOH中IM醋酸鈉
[0057] 梯度通過下列線性程序來施加（恒流等于I. Oml/min)，其中％ 2表示關(guān)于泵2的 洗脫液相對(duì)于總混合物的百分比：
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于制備從發(fā)芽的小麥種子得到的級(jí)分的方法，所述級(jí)分具有3, 000至30, 000 道爾頓范圍內(nèi)的分子量，所述方法提供： -使小麥種子在水上或在天然或人工支持物上發(fā)芽，直至得到幼苗； -熱處理所述幼苗； -在水溶液中浸潰得到的材料； -清除固體殘?jiān)敝恋玫降谝怀吻迦芤?，所述第一澄清溶液被滅菌? -清除具有低于3, 000道爾頓的分子量的級(jí)分和具有高于30, 000道爾頓的分子量的級(jí) 分，實(shí)現(xiàn)具有3, 000至30, 000范圍內(nèi)的分子量的級(jí)分的純化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)在水上或在惰性的人工生長(zhǎng)支持 物上在任何光（優(yōu)選在黑暗中）、濕度（優(yōu)選超過60% R. H)、溫度（優(yōu)選在5-20°C )條件 下進(jìn)行，產(chǎn)出優(yōu)選高至3-15cm的高度的幼苗。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其特征在于，步驟b)在高溫巧5-150°C )、任選地添 加水、且持續(xù)25-120分鐘來進(jìn)行；W及該步驟對(duì)所得到的原樣或壓碎至減小的尺寸的大小 的植物材料進(jìn)行。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的方法，其特征在于，步驟C)在2和7之間的抑和在低溫 (2-10°C )進(jìn)行。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的方法，其特征在于，步驟d)使用合成膜、紙濾器、壓機(jī)或液 體-固體提取器來進(jìn)行。
6. 糖級(jí)分，所述糖級(jí)分是借助于根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的方法可得到的，并是任何純 化等級(jí)的。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的借助于方法可得到的糖級(jí)分，其特征在于，所述方法通過超 濾來得到并且它給出了如圖1所示的色譜圖。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的得到的級(jí)分的用途，作為用于制備可W用于治療皮膚上或粘 膜上的潰瘍、傷口，或者至少用于治療皮膚的素亂的藥用物質(zhì)、醫(yī)療設(shè)備、化妝品的活性要 素或者至少作為成分。
9. 藥物組合物，其含有與賦形劑和常規(guī)載體物質(zhì)混合的有效量的權(quán)利要求5所述的溶 液和/或權(quán)利要求6所述的級(jí)分。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，是W小瓶、洗液、乳膏、軟膏、凝膠、溶液、藥物、栓 劑、胚珠劑、皂、泡沫、片劑、粉末、乳狀物的形式。
11. 化妝品組合物，其含有與賦形劑和常規(guī)載體物質(zhì)混合的有效量的權(quán)利要求5所述 的總提取物和/或權(quán)利要求6所述的級(jí)分。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，是W小瓶、洗液、乳膏、軟膏、凝膠、溶液、藥物、栓 劑、胚珠劑、皂、泡沫、片劑、粉末、乳狀物的形式。
【文檔編號(hào)】A61K36/899GK104470528SQ201380029302
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月4日
【發(fā)明者】魯?shù)婪颉だ飭? 申請(qǐng)人:達(dá)莫爾制藥公司