用于治療致癌病毒多肽陽性腫瘤的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本文件涉及編碼誘導對致癌病毒多肽的免疫應答的抗原性多肽的多核苷酸。還提供了包含編碼抗原性多肽的多核苷酸的組合物及使用方法。在提供的方法中，所述病毒可以是人乳頭瘤病毒。在一些實施方案中，提供一種用于殺死受試者中表達第一致癌病毒多肽的細胞的方法。所述方法包括以足以啟動針對所述第一致癌病毒肽的免疫應答的量對所述受試者施用組合物，所述組合物包含藥學可接受載體和本文中提供的多核苷酸，且所述免疫應答在所述細胞中有效引起細胞毒性效應。在一些實施方案中，所述多核苷酸包含編碼第二抗原性多肽的第二核苷酸序列。第一致癌病毒多肽可以是E6，且第二致癌病毒多肽可以是E7。
【專利說明】用于治療致癌病毒多肽陽性腫瘤的多核苷酸
[0001] 對相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年1月24日提交的臨時申請No. 61/590,089的優(yōu)先權(quán)，其通過 提及完整收入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本文中公開的各個實施方案涉及病毒疫苗。具體地，各個實施方案涉及用于治療 癌癥的病毒疫苗。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 已知一些病毒，諸如乳頭狀瘤病毒（例如HPV16，HPV18)，逆轉(zhuǎn)錄病毒（例如HTLV， 貓白血病病毒），皰疹病毒（例如埃巴病毒），和肝炎病毒（例如HBV)引起人類和其它動物 的癌癥。雖然利用病毒外殼蛋白或病毒樣顆粒的疫苗在預防感染方面經(jīng)常是成功的，但是 需要治療建立的疾病和病毒相關(guān)癌癥的療法。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 在一些實施方案中，提供了分離的多核苷酸。分離的多核苷酸可以包含編碼第一 抗原性多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一抗原性多肽包含與第一致癌病毒多肽的氨基 酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，能夠在免疫感受態(tài)宿主中啟動對所述第一 致癌病毒多肽的免疫應答；及在所述免疫感受態(tài)宿主中是非致癌的。在一些實施方案中，所 述多核苷酸包含編碼第二抗原性多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二抗原性多肽包含與 第二致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，能夠在免疫感受 態(tài)宿主中啟動對所述第二致癌病毒多肽的免疫應答；及在所述免疫感受態(tài)宿主中是非致癌 的。
[0008] 病毒可以是人乳頭瘤病毒。第一致癌病毒多肽可以是E6,且第二致癌病毒多肽可 以是E7。
[0009] 所述第一核苷酸序列可以編碼具有特定突變的SEQ ID N0:2,例如L50處的點突變 或缺失，E148處的點突變或缺失，T149處的點突變或缺失，Q150處的點突變或缺失，和L151 處的點突變或缺失。第一核苷酸序列可以編碼SEQ ID N0:29。
[0010] 所述第二核苷酸序列可以編碼具有特定突變的SEQ ID N0:4,例如H2處的點突變 或缺失，C24處的點突變或缺失，E46處的點突變或缺失，和L67處的點突變或缺失。第二核 苷酸序列可以編碼SEQ ID N0:30。
[0011] 在一些實施方案中，提供了組合物。組合物包含藥學可接受載體和本文中提供的 多核苷酸。多核苷酸可以包含編碼第一抗原性多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一抗原 性多肽包含與第一致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，能 夠在免疫感受態(tài)宿主中啟動對所述第一致癌病毒多肽的免疫應答；及在所述免疫感受態(tài)宿 主中是非致癌的。在一些實施方案中，所述多核苷酸包含編碼第二抗原性多肽的第二核苷 酸序列，其中所述第二抗原性多肽包含與第二致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70%序 列同一性的氨基酸序列，能夠在免疫感受態(tài)宿主中啟動對所述第二致癌病毒多肽的免疫應 答；及在所述免疫感受態(tài)宿主中是非致癌的。
[0012] 提供的組合物中的病毒可以是人乳頭瘤病毒。在提供的組合物中，第一致癌病毒 多肽可以是E6,且第二致癌病毒多肽可以是E7。
[0013] 提供的組合物中第一核苷酸序列可以編碼具有特定突變的SEQ ID N0:2,例如L50 處的點突變或缺失，E148處的點突變或缺失，T149處的點突變或缺失，Q150處的點突變或 缺失，和L151處的點突變或缺失。組合物中提供的第一核苷酸序列可以編碼SEQ ID N0:29。
[0014] 提供的組合物中第二核苷酸序列可以編碼具有特定突變的SEQ ID N0:4,例如H2 處的點突變或缺失，C24處的點突變或缺失，E46處的點突變或缺失，和L67處的點突變或缺 失。組合物中提供的第二核苷酸序列可以編碼SEQ ID N0:30。
[0015] 在提供的組合物的一些實施方案中，提供的組合物中的藥學可接受載體可以是腺 病毒包膜。
[0016] 在一些實施方案中，提供了用于殺死受試者中表達第一致癌病毒多肽的細胞的方 法。該方法包括以足以啟動針對所述第一致癌病毒肽的免疫應答的量對所述受試者施用組 合物，其中組合物包含藥學可接受載體和本文中提供的多核苷酸，且免疫應答在所述細胞 中有效引起細胞毒性效應。多核苷酸可以包含編碼第一抗原性多肽的第一核苷酸序列，其 中所述第一抗原性多肽包含與第一致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70%序列同一性 的氨基酸序列，能夠在免疫感受態(tài)宿主中啟動對所述第一致癌病毒多肽的免疫應答，及在 所述免疫感受態(tài)宿主中是非致癌的。在一些實施方案中，所述多核苷酸包含編碼第二抗原 性多肽的第二核苷酸序列，其中所述第二抗原性多肽包含與第二致癌病毒多肽的氨基酸序 列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列，能夠在免疫感受態(tài)宿主中啟動對所述第二致癌 病毒多肽的免疫應答；及在所述免疫感受態(tài)宿主中是非致癌的。
[0017] 在提供的方法中，病毒可以是人乳頭瘤病毒。在提供的方法中，第一致癌病毒多肽 可以是E6,且第二致癌病毒多肽可以是E7。
[0018] 在提供的方法中，所述第一核苷酸序列可以編碼具有特定突變的SEQ ID N0:2,例 如L50處的點突變或缺失，E148處的點突變或缺失，T149處的點突變或缺失，Q150處的點 突變或缺失，和L151處的點突變或缺失。在提供的方法中，第一核苷酸序列可以編碼SEQ ID N0:29。
[0019] 在提供的方法中，所述第二核苷酸序列可以編碼具有特定突變的SEQ ID N0:4,例 如H2處的點突變或缺失，C24處的點突變或缺失，E46處的點突變或缺失，和L67處的點突 變或缺失。在提供的方法中，第二核苷酸序列可以編碼SEQ ID N0:30。
[0020] 在提供的方法的一些實施方案中，藥學可接受載體可以是腺病毒包膜。
[0021] 在提供的方法的一些實施方案中，所述細胞可以是新生物（neoplasia)的一部 分。在提供的方法的一些實施方案中，所述細胞可以是惡性新生物的一部分。
[0022] 雖然公開了多個實施方案，從顯示和描述本發(fā)明的例示性實施方案的以下詳細描 述看，其它實施方案仍然會對本領(lǐng)域技術(shù)人員變得顯而易見。因而，圖和詳細描述視為本質(zhì) 上例示的而非限制的。
[0023] 附圖簡述
[0024] 圖1是顯示HPV16 E6和E7中突變的示意圖。
[0025] 圖2顯示用對照逆轉(zhuǎn)錄病毒，編碼野生型E6/E7的逆轉(zhuǎn)錄病毒，和編碼突變體E6/ E7的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的細胞中腫瘤阻抑蛋白表達（A)，HPV16 E6/E7表達（B)，和相對端粒 末端轉(zhuǎn)移酶活性（RTA) (C)。
[0026] 圖3顯示了用對照逆轉(zhuǎn)錄病毒（A)，編碼野生型E6/E7的逆轉(zhuǎn)錄病毒（B)，和編碼 突變體E6/E7的逆轉(zhuǎn)錄病毒（C)感染的細胞的生長特征。
[0027] 圖4顯示了用對照逆轉(zhuǎn)錄病毒（LXSN)，編碼野生型E6/E7的逆轉(zhuǎn)錄病毒，和編碼突 變體E6/E7的逆轉(zhuǎn)錄病毒（B)感染的細胞的生長速率（A)和p53表達。
[0028] 圖5顯示了用對照逆轉(zhuǎn)錄病毒，編碼野生型E6/E7的逆轉(zhuǎn)錄病毒，和編碼突變體 E6/E7的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的細胞的生長速率。
[0029] 圖6顯示了暴露于指定抗原的用緩沖液對照，對照腺病毒（載體對照），或編碼突 變體E6/E7的腺病毒免疫的小鼠的脾細胞的干擾素 ga_a應答。
[0030] 圖7顯示了暴露于指定抗原的用緩沖液對照，對照腺病毒（載體對照），或編碼突 變體E6/E7的腺病毒免疫的小鼠的脾細胞的IL-2應答。
[0031] 圖8顯示了用對照腺病毒（載體對照），編碼突變體E6/E7的腺病毒，或編碼野生 型E6/E7的腺病毒接種疫苗的小鼠中的HPV+腫瘤生長。每條線標示個體小鼠中的腫瘤生 長。
[0032] 圖9顯不了植入有HPV+癌細胞并且用對照腺病毒（Ad5 [El-, E2b_]-null)，或編碼 突變體E6/E7的腺病毒（Ad5[El-，E2b-]-E6VE7A)接種疫苗的小鼠的存活。
[0033] 發(fā)明詳述
[0034] 本文中公開的各個實施方案涉及抗原性多肽，其在免疫感受態(tài)宿主中啟動對致癌 病毒多肽的免疫應答，但是在免疫感受態(tài)宿主中是非致癌的。本文中還提供了包含編碼此 類抗原性多肽的序列的多核苷酸，包含此類多核苷酸的組合物，和使用方法。
[0035] 如本文中使用的，致癌病毒多肽是由病毒基因組編碼的多肽，所述病毒基因組在 宿主細胞中表達時轉(zhuǎn)化細胞。致癌病毒多肽包括但不限于HPV(人乳頭瘤病毒）16 E6，HPV16 E7, HPV18 E6, HPV18 E7, HBV (乙肝病毒）HBXAg，HCV (丙肝病毒）核心蛋白，HCV NS5A， HTLV(人T細胞親淋巴病毒）TAX，EBV(埃巴病毒）EBNA，和EBV LMP-1。在一些實施方案中， 致癌病毒多肽（例如HPV E6)足以單獨轉(zhuǎn)化宿主細胞。在其它實施方案中，致癌病毒多肽 僅在存在一種或多種別的特定輔因子（例如其它病毒癌基因，宿主細胞基因突變）的情況 下轉(zhuǎn)化宿主細胞。例如，HPV E6可以永生化具有ErbB2突變的細胞，該突變可以誘導一些 細胞的侵入性生長。
[0036] 如本文中使用的，抗原性多肽是在免疫感受態(tài)宿主中存在時引發(fā)免疫應答的多 肽。如本文中使用的，免疫感受態(tài)宿主是能夠產(chǎn)生導致細胞毒性（例如細胞毒性T細胞介 導的細胞毒性或抗體介導的細胞毒性）的免疫應答的動物。
[0037] 本文中提供的抗原性多肽源自致癌病毒多肽，并且與衍生其的致癌病毒多肽相比 含有至少一處突變（例如一個或多個氨基酸的取代，缺失，或添加）。本文中提供的抗原性 多肽含有至少一處突變，其在衍生其的致癌病毒多肽轉(zhuǎn)化宿主細胞的相同條件下使其為非 致癌的。使致癌病毒多肽為非致癌的突變包括那些失活致癌功能，諸如但不限于破壞對腫 瘤阻抑蛋白的結(jié)合，破壞活化域，和破壞對DNA的結(jié)合的。例如，源自HPV16 E6的抗原性多 肽可以包含破壞P53結(jié)合位點，端粒末端轉(zhuǎn)移酶活化位點，PDZ結(jié)合域，或其組合的突變。在 另一個例子中，源自HPV16 E7的抗原性多肽可以包含破壞Rb蛋白結(jié)合位點，Μ?2β結(jié)合位 點，或其組合的突變。
[0038] 本文中提供的抗原性多肽與致癌病毒多肽具有至少70%序列同一性（例如至少 72 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少95 %，至少96 %，至少98 %，至少99 %，至少 99. 5%，或至少99. 7%序列同一性，或70%至99%，75%至99%，80%至99%，或88%至 99. 9%序列同一性），并且對表達致癌病毒多肽的細胞引發(fā)細胞毒性免疫應答。在一些實 施方案中，抗原性多肽和衍生其的致癌病毒多肽是約95. 9%相同的，約96. 7%相同的，約 96. 9 %相同的，約97. 2 %相同的，約97. 9 %相同的，約98. 6 %相同的，約99 %相同的，或約 99. 3%相同的?？乖远嚯牡睦影?SEQ ID N0:23, SEQ ID N0:24, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26，SEQ ID N0:27，SEQ ID N0:28，SEQ ID N0:29，SEQ ID N0:30,和 SEQ ID N0:31。
[0039] "百分比序列同一性"指任何給定的致癌病毒多肽序列，例如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4,和自其衍生的抗原性多肽序列之間的序列同一性程度?？乖远嚯耐ǔ＞哂醒?生其的致癌病毒多肽的全長的70%至130%百分比，例如衍生其的致癌病毒多肽的全長的 71 %, 74 %, 75 %, 77 %, 80 %, 82 %, 85 %, 87 %, 89 %, 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 %, 100 %, 105 %，110 %，115 %，120 %，或130 %的長度。可以如下測定任何抗原性多肽相對于衍生其 的致癌病毒多肽的百分比同一性。將致癌病毒多肽（例如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4) 與一種或多種候選序列比對，其在商業(yè)名稱ClustalW(第1.83版，缺省參數(shù)）可購得的計 算機程序進行，該計算機程序容許核酸或多肽序列在其整個長度間實施比對（全局比對）。 Chema 等，Nucleic Acids Res.，31 (13) : 3497-500 (2003)。
[0040] ClustalW計算參照（例如致癌病毒多肽）和一種或多種候選序列（例如源自致 癌病毒多肽的抗原性多肽）間的最佳匹配，并且比對它們使得可以檢測同一性，相似性和 差異?？梢詫⒁粋€或多個殘基的缺口插入?yún)⒄招蛄?，候選序列，或者兩者中，從而使序列比 對最大化。對于核酸序列的快速成對比對，使用以下缺省參數(shù)：字大?。? ;窗大小：4 ;評分 方法：百分比；頂部對角線的數(shù)目：4 ;和缺口罰分：5。對于核酸序列的多序列比對，使用以 下參數(shù)：缺口打開罰分：1〇· 0 ;缺口延伸罰分：5· 0 ;和權(quán)重轉(zhuǎn)變（weight transition):是。 對于蛋白質(zhì)序列的快速成對比對，使用以下參數(shù)：字大?。? ;窗大?。? ;評分方法：百分 比；頂部對角線的數(shù)目：5 ;缺口罰分：3。對于蛋白質(zhì)序列的多比對，使用以下參數(shù)：權(quán)重矩 陣：blosum ;缺口打開罰分：10. 0 ;缺口延伸罰分：0. 05 ;親水性缺口 ：開；疏水性殘基：Gly， Pro, Ser，Asn，Asp, Gin, Glu，Arg，和Lys ;殘基特異性缺口罰分：開。ClustalW輸出是反映 序列間關(guān)系的序列比對。ClustalW可以例如萬維網(wǎng)上的歐洲生物信息學研究所站點（ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/)運行，或者從例如萬維網(wǎng)上的 Clustal. org站點（clustal. org/clustal2/)下載。
[0041] 為了測定抗原性多肽與致癌病毒多肽的百分比同一性，使用ClustalW比對序列， 用比對中相同匹配的數(shù)目除以參照序列的長度，并且將結(jié)果乘以100。注意百分比同一性 數(shù)值可以四舍五入到最近的十分位。例如，78. 11，78. 12, 78. 13,和78. 14向下四舍五入到 78. 1，而 78. 15,78· 16,78· 17,78· 18,和 78. 19 向上四舍五入到 78. 2。
[0042] 本文中提供的多核苷酸（例如SEQ ID N0:34)包括包含編碼本文中提供的抗原性 多肽的核苷酸序列的雙鏈或單鏈，線性或環(huán)形DNA或RNA。在一些實施方案中，本文中提供 的多核苷酸包括超過一種核苷酸序列，其各編碼抗原性多肽。在一些實施方案中，多核苷酸 可以包含編碼相同抗原性多肽的核苷酸序列的多聯(lián)體（concatamer)。
[0043] 本文中提供的多核苷酸還包含與編碼抗原性多肽的核苷酸序列可操作連接的一 種或多種核苷酸序列，其促進從其中含有的抗原性多肽核苷酸序列表達蛋白質(zhì)。此類序列 包括但不限于啟動子、增強子、RNA穩(wěn)定序列、內(nèi)部核糖體進入位點（IRES)、和蛋白質(zhì)穩(wěn)定 序列。適合于在提供的多核苷酸中使用的啟動子包括但不限于SV40早期啟動子，CMV立 即早期啟動子，逆轉(zhuǎn)病毒長末端重復（LTR)，可調(diào)節(jié)啟動子（例如四環(huán)素或IPTG響應啟動 子），和RSV啟動子。
[0044] 在本文中提供的多核苷酸中包含多個編碼抗原性多肽的核苷酸序列時，自其表達 的多肽可以以分開的蛋白質(zhì)表達，例如經(jīng)由分開的啟動子或者通過使用IRES，或者它們可 以以融合蛋白表達。
[0045] 在一些實施方案中，本文中提供的多核苷酸包含編碼蛋白質(zhì)標簽（例如myc標簽 或FLAG標簽）的核苷酸序列，其與抗原性多肽核苷酸序列可操作連接，使得標簽在表達時 附接于抗原性多肽。如本文中使用的，為了測定與衍生抗原性多肽序列的致癌病毒多肽的 百分比序列同一性，其中不包含蛋白質(zhì)標簽。
[0046] 在一些實施方案中，本文中提供的多核苷酸包含標志物序列，其促進多核苷酸和/ 或多核苷酸的蛋白質(zhì)表達的檢測。在一些實施方案中，標志物序列可以編碼標志物蛋白質(zhì)， 諸如熒光標志物（例如GFP，RFP，或YFP)以促進從多核苷酸表達蛋白質(zhì)的檢測。在其它實 施方案中，標志物序列不編碼蛋白質(zhì)，但是可以使用核酸檢測技術(shù)，諸如聚合酶鏈式反應檢 測。在一些實施方案中，可以使用標志物序列破壞致癌病毒多肽中促成致癌病毒多肽的致 癌活性的區(qū)域以生成抗原性多肽。在此類情況中，為了測定與衍生抗原性多肽序列的致癌 病毒多肽的百分比序列同一性，其中不包含標志物序列，并且剩余的序列可以與衍生其的 致癌病毒多肽保留100%序列同一性。
[0047] 本文中提供的多核苷酸可以使用已知的方法生成，諸如致癌病毒多肽編碼多核苷 酸（例如 SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:3,和 SEQ ID N0:5)的定點誘變。
[0048] 可以將本文中提供的任何多核苷酸摻入藥學可接受載體中。合適的藥學可接受載 體包括但不限于病毒包膜、陽離子脂質(zhì)載體、自體細胞、質(zhì)粒載體、和病毒載體。在將本文 中提供的多核苷酸摻入病毒包膜中時，它可以包含一種或多種支持對包膜的摻入的包裝序 列。
[0049] 在某些實施方案中，將包含本文中提供的多核苷酸和藥學可接受載體的組合物配 制以導入（例如腸，經(jīng)皮，靜脈內(nèi)，皮下，或肌肉內(nèi)）免疫感受態(tài)宿主中。在使用中，對有風 險被其基因組編碼致癌病毒多肽的病毒感染的免疫感受態(tài)宿主施用組合物。在一些實施方 案中，對免疫感受態(tài)宿主施用組合物，所述免疫感受態(tài)宿主已經(jīng)用此類病毒感染，或者表達 致癌病毒多肽的細胞（例如癌細胞）。
[0050] 在依照一個實施方案對免疫感受態(tài)宿主施用時，本文中提供的組合物引發(fā)對表達 致癌病毒多肽的細胞的細胞毒性免疫應答。在一些實施方案中，本文中提供的組合物的施 用可以用于治療，改善，和/或預防受試者中與致癌病毒多肽表達有關(guān)的癌癥。在一些實 施方案中，本文中提供的組合物的施用可以導致表達致癌病毒多肽的細胞群體的減少。可 以使用任何合適的手段，諸如例如測量包含表達致癌病毒多肽的細胞的腫瘤的大小變化， 或測量表達致癌病毒多肽的循環(huán)癌細胞的數(shù)目變化測量表達致癌病毒多肽的細胞群體的 減少。在一些實施方案中，與已經(jīng)類似治療，但是不施用本文中提供的組合物的對照群體相 t匕，具有與致癌病毒多肽表達有關(guān)的癌癥的受試者群體施用本文中提供的組合物可以導致 更長的平均存活。
[0051] 在一些實施方案中，本文中提供的組合物可以與一種或多種標準療法（例如放 射，手術(shù)或化學療法）組合使用以治療具有與致癌病毒多肽表達有關(guān)的癌癥的受試者。在 與標準療法組合使用時，可以在施用標準療法之前，期間或之后施用本文中提供的組合物。 在一些實施方案中，可以調(diào)節(jié)本文中提供的組合物和/或標準療法的施用時機以提高組合 物或標準療法之一或兩者的效力。例如，本文中提供的組合物可以以初始劑量施用，接著隨 時間用額外的加強劑量以提高免疫應答。在另一個例子中，可以在化學療法前或在從化學 療法的免疫恢復后施用本文中提供的組合物以提高足夠免疫應答的可能性。
[0052] 可以以足以引發(fā)細胞毒性免疫應答的量將本文中提供的組合物給藥?？梢哉{(diào)節(jié)劑 量以引發(fā)免疫應答，但不誘導對組合物中載體的系統(tǒng)性不利反應。例如，在使用腺病毒載體 時，合適的劑量可以在每劑約1〇 8至1〇12個顆粒的范圍中。在一些實施方案中，劑量的量和 /或劑量數(shù)目可以隨著用于促進編碼抗原性多肽的表達的序列類型，受試者中的免疫應答 強度，或使用的藥學可接受載體的類型而調(diào)節(jié)。
[0053] 本文中提供的組合物可以包裝為預先混合的配制劑或為可以在使用前混合的分 開組分。在一些實施方案中，本文中提供的組合物可以在單獨的劑量中包裝。在其它實施方 案中，本文中提供的組合物可以在含有施用前測量的多劑的容器中包裝。在一些實施方案 中，可以將本文中提供的組合物配制為施用前稀釋的濃縮物。在又一些實施方案中，可以通 過在施用前混合分開的組分生成本文中提供的組合物。包裝可以進一步包含合適的文件， 標簽7等等。
[0054] 應當理解，以下實施例并不意圖限制本發(fā)明的范圍。 實施例
[0055] 實施例1 :HPV16 E6/E7的誘變和病毒構(gòu)建
[0056] HPV16 E6/E7誘變。使用體外定點誘變將HPV16 E6和E7中的6處突變引入野生 型E6/E7編碼核酸中，如圖1中顯示的。對于稱作L50G的突變，在p53結(jié)合和端粒末端轉(zhuǎn) 移酶活化位點域內(nèi)E6中的位置50進行亮氨酸至甘氨酸突變。對于稱作roz的突變，將殘 基146-151處的E6的C端PDZ結(jié)合域用4個丙氨酸殘基替代。對于稱作H2P的突變，在E7 中的Rb結(jié)合位點內(nèi)位置2處用脯氨酸殘基取代組氨酸殘基。對于稱作C24G的突變，在E7 中的Rb結(jié)合位點內(nèi)位置24處用甘氨酸殘基替換半胱氨酸殘基。對于稱作E46A的突變，在 E7中的Rb結(jié)合位點內(nèi)位置46處，將谷氨酸殘基改變成丙氨酸。對于稱作L67R的突變，在 E7的Μ?2β結(jié)合區(qū)內(nèi)在位置67處進行亮氨酸至精氨酸突變。按照制造商的指導（Agilent Technologies#200521)使用表1中列出的引物對編碼HPV16 E6和E7的核酸（SEQ ID N0:5) 實施定點誘變。
[0057]
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的多核苷酸，其包含編碼第一抗原性多肽的第一核苷酸序列，其中所述第 一抗原性多肽： a. 包含與第一致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列； b. 能夠在免疫感受態(tài)宿主中啟動對所述第一致癌病毒多肽的免疫應答；及 c. 在所述免疫感受態(tài)宿主中是非致癌的。
2. 權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼第二抗原性多肽的第二核苷酸 序列，其中所述第二抗原性多肽： a. 包含與第二致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列； b. 能夠在免疫感受態(tài)宿主中啟動對所述第二致癌病毒多肽的免疫應答；及 c. 在所述免疫感受態(tài)宿主中是非致癌的。
3. 權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述病毒是人乳頭瘤病毒。
4. 權(quán)利要求3的多核苷酸，其中所述第一致癌病毒多肽是E6,且所述第二致癌病毒多 膚是E7。
5. 權(quán)利要求4的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列編碼具有選自下組的突變的SEQ ID NO:2 ： a. L50處的點突變或缺失； b. E148處的點突變或缺失； c. T149處的點突變或缺失； d. Q150處的點突變或缺失；和 e. L151處的點突變或缺失。
6. 權(quán)利要求4的多核苷酸，其中所述第二核苷酸序列編碼具有選自下組的突變的SEQ ID NO:4 ： a. H2處的點突變或缺失； b. C24處的點突變或缺失； c. E46處的點突變或缺失；和 d. L67處的點突變或缺失。
7. 權(quán)利要求4的多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 29,且所述第二 核苷酸序列編碼SEQ ID NO:30。
8. -種組合物，其包含： a. 藥學可接受載體；和 b. 多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼第一抗原性多肽的第一核苷酸序列，其中所述第 一抗原性多肽： i. 包含與第一致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列； ii. 能夠在免疫感受態(tài)宿王中啟動對所述弟一致癌病毒多膚的免疫應答；及 iii. 在所述免疫感受態(tài)宿主中是非致癌的。
9. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述多核苷酸包含編碼第二抗原性多肽的第二核苷酸序 列，其中所述第二抗原性多肽： a. 包含與第二致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列； b. 能夠在免疫感受態(tài)宿主中啟動對所述第二致癌病毒多肽的免疫應答；及 C.在所述免疫感受態(tài)宿主中是非致癌的。
10. 權(quán)利要求9的組合物，其中所述病毒是人乳頭瘤病毒。
11. 權(quán)利要求10的組合物，其中所述第一致癌病毒多肽是E6,且所述第二致癌病毒多 膚是E7。
12. 權(quán)利要求11的組合物，其中所述第一核苷酸序列編碼具有選自下組的突變的SEQ ID NO:2 ： a. L50處的點突變或缺失； b. E148處的點突變或缺失； c. T149處的點突變或缺失； d. Q150處的點突變或缺失；和 e. L151處的點突變或缺失。
13. 權(quán)利要求11的組合物，其中所述第二核苷酸序列編碼具有選自下組的突變的SEQ ID NO:4 ： a. H2處的點突變或缺失； b. C24處的點突變或缺失； c. E46處的點突變或缺失；和 d. L67處的點突變或缺失。
14. 權(quán)利要求11的組合物，其中所述第一核苷酸序列編碼SEQ ID N0:29,且所述第二 核苷酸序列編碼SEQ ID NO:30。
15. 權(quán)利要求8的組合物，其中所述藥學可接受載體是腺病毒包膜。
16. -種用于殺死受試者中表達第一致癌病毒多肽的細胞的方法，該方法包括以足以 啟動針對所述第一致癌病毒肽的免疫應答的量對所述受試者施用組合物，所述組合物包 含： a. 藥學可接受載體；和 b. 多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼第一抗原性多肽的第一核苷酸序列，其中所述第 一抗原性多肽： i. 包含與第一致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列； ii. 能夠在免疫感受態(tài)宿王中啟動對所述弟一致癌病毒多膚的免疫應答；及 iii. 在所述免疫感受態(tài)宿主中是非致癌的； 所述免疫應答在所述細胞中有效引起細胞毒性效應。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述多核苷酸包含編碼第二抗原性多肽的第二核苷酸序 列，其中所述第二抗原性多肽： i. 包含與第二致癌病毒多肽的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列； ii. 能夠在免疫感受態(tài)宿王中啟動對所述弟-致癌病毒多膚的免疫應答；及 iii. 在所述免疫感受態(tài)宿主中是非致癌的。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述細胞是新生物的一部分。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述新生物是惡性的。
20. 權(quán)利要求17的方法，其中所述病毒是人乳頭瘤病毒。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述第一致癌病毒多肽是E6,且所述第二致癌病毒多肽 是E7。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述第一核苷酸序列編碼具有選自下組的突變的SEQ ID NO:2 ： a. L50處的點突變或缺失； b. E148處的點突變或缺失； c. T149處點突變或缺失； d. Q150處的點突變或缺失；和 e. L151處的點突變或缺失。
23. 權(quán)利要求21的方法，其中所述第二核苷酸序列編碼具有選自下組的突變的SEQ ID NO:4 ： a. H2處的點突變或缺失； b. C24處的點突變或缺失； c. E46處的點突變或缺失；和 d. L67處的點突變或缺失。
24. 權(quán)利要求21的方法，其中所述第一核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 29,且所述第二核 苷酸序列編碼SEQ ID NO:30。
25. 權(quán)利要求17的方法，其中所述藥學可接受載體是腺病毒包膜。
【文檔編號】A61K39/12GK104159607SQ201380012419
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月24日
【發(fā)明者】J.H.李, D.W.弗米爾 申請人:桑福德研究院/南達科他大學