止血傷口敷料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了止血傷口敷料。所述敷料包含非膠體多孔敷料材料和固定到所述非膠體多孔敷料材料的多個纖維蛋白原結(jié)合肽，其中每個纖維蛋白原結(jié)合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ?ID?NO：1)，其中Xaa為除Val以外的任何氨基酸，優(yōu)選為Pro、Sar或Leu；或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ?ID?NO：2)，其中Xaa為除Pro以外的任何氨基酸。所述敷料能夠加速止血，不需要酶活性。具體而言，所述敷料不依賴于外源性凝血酶的作用，并且可在室溫下長期儲存于溶液中。本發(fā)明還描述了制備所述敷料的方法和所述敷料控制出血的用途。
【專利說明】止血傷口敷料
[0001 ] 本發(fā)明涉及止血傷口敷料、用于形成止血傷口敷料的試劑盒和止血劑、制備所述 敷料的方法和所述敷料控制出血，尤其是例如可在外科實(shí)踐中發(fā)生的幾種出血的用途。
[0002] 手術(shù)過程中使用的幾種局部止血劑目前可用。吸收性明膠海綿，例如Gelfoam，由 豬明膠制成。Gelfoam可吸收超過其重量40倍的血液并且擴(kuò)大到其初始體積的約200%。 海綿表面通過凝血級聯(lián)的接觸活化途徑引起血小板活化。替代性明膠性產(chǎn)品Floseal包括 已經(jīng)交聯(lián)的明膠顆粒，以致它們不會膨脹到與Gelfoam幾乎相同的程度。
[0003] 氧化纖維素片，例如Surgicel，源自α -纖維素并且在凝血級聯(lián)的接觸活化途徑 中與Gelfoam同時作用。血液飽和時，所述片迅速膨脹成凝膠狀物質(zhì)。微纖維膠原，例如 Avitene，使用源自牛皮的膠原。其呈粉末或片形式。其與血液表面緊緊結(jié)合并且引起極小 膨脹。其引起接觸活化，但是也直接活化血小板。
[0004] 局部止血劑常常連同由纖維蛋白原生成纖維蛋白并促進(jìn)血小板活化的凝血酶一 起使用，從而加速血液凝固。使用純化牛或人凝血酶或重組人凝血酶。然而，牛凝血酶受牛 抗原，尤其是牛因子V污染。對這種抗原產(chǎn)生的抗體可與人因子V交叉反應(yīng)并導(dǎo)致致命性 出血，并且在一些情況下，導(dǎo)致過敏反應(yīng)和死亡。為了將這些風(fēng)險減到最低，已經(jīng)從供體的 混合血漿分離出人凝血酶，但是有傳播血源性病原體，尤其是病毒的可能。最近，已經(jīng)研發(fā) 了一種重組人凝血酶并且經(jīng)FDA批準(zhǔn)使用。其具有最低抗原性的優(yōu)勢并且不帶病毒傳播的 風(fēng)險。然而，其使用經(jīng)基因改良的中國倉鼠卵巢細(xì)胞系制成，所以生產(chǎn)相對昂貴。
[0005] 純化牛和重組人凝血酶制劑在室溫下呈粉末儲存，使用之前必須用鹽水復(fù)水為溶 液。經(jīng)FDA-批準(zhǔn)的純化人凝血酶呈溶液包裝，但是在室溫下這只可儲存長達(dá)24小時；長期 儲存需要冷凍（Lew 和 Weaver，Biologies :Targets & Therapy2008 :2(4)593-599)。
[0006] 使用凝血酶的另一缺點(diǎn)是酶將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白需要時間，所以在加速 血液凝固之前稍有延遲。
[0007] 因此，需要提供可迅速有效地終止嚴(yán)重出血，并且克服以上使用凝血酶的一種或 多種缺點(diǎn)的局部止血劑。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明，提供了一種止血傷口敷料，其包含非膠體多孔敷料材料和固定 到所述非膠體多孔敷料材料的多個纖維蛋白原結(jié)合肽，其中每個纖維蛋白原結(jié)合肽包 含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO : 1)，其中Xaa為 除Val以外的任何氨基酸，優(yōu)選為Pro、Sar或Leu ;或在所述肽氨基末端的氨基酸序列 Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID NO :2)，其中Xaa為除Pro以外的任何氨基酸。
[0009] 纖維蛋白原包含兩個各自可與纖維蛋白原結(jié)合肽結(jié)合的末端結(jié)構(gòu)域（D-結(jié)構(gòu) 域）。例如在血漿或血液中，纖維蛋白原接觸所述肽時，形成包含纖維蛋白原結(jié)合肽和纖維 蛋白原，具有纖維蛋白凝塊特征的共聚物。因此本發(fā)明的止血傷口敷料中纖維蛋白原結(jié)合 肽的存在加速止血。
[0010] 已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的止血傷口敷料具有比浸在凝血酶中的常規(guī)明膠襯墊明 顯更好的止血性。
[0011] 本發(fā)明的止血傷口敷料不依賴于外源性凝血酶的作用。纖維蛋白原結(jié)合肽可經(jīng)合 成制備，所以抗原性最低，不帶病毒傳播的風(fēng)險，可比在哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)的重組蛋白 質(zhì)更便宜地制備，并且可在室溫下長期儲存于溶液中。
[0012] 本發(fā)明的止血傷口敷料不需要酶活性來加速止血，所以與纖維蛋白原接觸就立即 加速止血。
[0013] 本文使用術(shù)語"非膠體多孔敷料材料"指可局部施加以覆蓋、包扎或保護(hù)傷口的任 何非膠體多孔材料。此類材料的實(shí)例包括片、襯墊、海綿、泡沫、膜、紗布、網(wǎng)、顆粒和珠。非 膠體多孔敷料材料包括適合向傷口局部施加，但不適合注入體內(nèi)的材料。具體而言，顆?；?珠太大而不能通過肺毛細(xì)血管床。至少大部分顆?；蛑榈淖畲蟪叽绱笥? μ m。非膠體多孔 敷料材料可包含任何適合化學(xué)品。實(shí)例包括明膠、棉花、人造絲、聚酯、膠原、藻酸鹽和氧化 纖維素。優(yōu)選明膠。
[0014] 凝血酶從纖維蛋白原的α和β鏈的氨基端裂解肽（釋放出纖維蛋白肽A和B) 以分別暴露出序列NH 2-GPRV-(SEQ ID N0:3)和NH2-GHRP-(SEQ ID N0:4)。因此本發(fā)明止 血傷口敷料的纖維蛋白原結(jié)合肽在序列上與纖維蛋白原上通過凝血酶作用暴露的序列不 同。優(yōu)選至少一些（更優(yōu)選全部）纖維蛋白原結(jié)合肽在氨基末端包含序列nh 2-gprp-(seq ID NO ：5) 〇
[0015] 優(yōu)選纖維蛋白原結(jié)合肽各自長度為4-60個，優(yōu)選4-30個，更優(yōu)選4-10個氨基酸 殘基。
[0016] 每個纖維蛋白原結(jié)合肽的氨基末端均能夠與纖維蛋白原分子中的"孔"結(jié)合 (ffeisel, Fibrinogen and Fibrin, Advances in Protein Chemistry, 2005,第 70 卷，第 247-299頁）。因此，在每個肽氨基末端的4個氨基酸殘基的羧基端的纖維蛋白原結(jié)合肽任 何序列并不關(guān)鍵，只要該序列不抑制所述肽的氨基末端與纖維蛋白原的結(jié)合。
[0017] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，每個纖維蛋白原結(jié)合肽至少為5個氨基酸殘基 長以確保所述肽足夠長以高親和力與其在纖維蛋白原中的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。因此，特別優(yōu)選 每個纖維蛋白原結(jié)合肽長度為5-60個、5-30個或5-10個氨基酸殘基。優(yōu)選從每個此類纖 維蛋白原結(jié)合肽的氨基末端第5個氨基酸殘基為甘氨酸殘基。在其它實(shí)施方案中，每個纖 維蛋白原結(jié)合肽可能長度為至少6、7、8、9、10或11個氨基酸殘基。優(yōu)選每個纖維蛋白原結(jié) 合肽長度不長于60個氨基酸殘基，更優(yōu)選長度不長于30個氨基酸殘基。
[0018] 優(yōu)選每個纖維蛋白原結(jié)合肽為合成肽。
[0019] 優(yōu)選地，纖維蛋白原結(jié)合肽與纖維蛋白原結(jié)合，解離常數(shù)介于ΚΓ9至1(Γ 6Μ之間，例 如約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400ηΜ 或更大。優(yōu)選約ΙΟΟηΜ的解離常數(shù)。
[0020] 纖維蛋白原結(jié)合肽可能各自具有相同序列，優(yōu)選各自在氨基末端包含SEQ ID N0 : 1的序列?？蛇x地，纖維蛋白原結(jié)合肽可能包含具不同序列的肽，只要每個肽在其氨基末端 包含 SEQ ID N0 :1 或 SEQ ID N0 :2 的序列。
[0021] 所述多個纖維蛋白原結(jié)合肽可共價或非共價固定到非膠體多孔敷料材料。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案，多個載體非共價固定到非膠體多孔敷料材料， 并且多個纖維蛋白原結(jié)合肽固定，優(yōu)選共價固定到每個載體。
[0023] 例如在血漿或血液中，纖維蛋白原接觸固定到載體的纖維蛋白原結(jié)合肽時，其與 肽結(jié)合。因為每個纖維蛋白原分子可結(jié)合兩個肽，所以纖維蛋白原分子變成經(jīng)載體非共價 交聯(lián)，并且形成包含載體和纖維蛋白原，具有纖維蛋白凝塊特征的共聚物。
[0024] 載體可為可溶性或不溶性載體，但不是血小板。載體應(yīng)適合向出血傷口部位局部 施用。載體可包含可溶性或不溶性聚合物，例如蛋白質(zhì)、多糖或合成生物相容性聚合物，例 如聚乙二醇或任何這些的組合。白蛋白為優(yōu)選蛋白質(zhì)載體。
[0025] 不溶性載體可為微粒（包括實(shí)心、空心或多孔微粒，優(yōu)選大體球形微粒）。微?？?由任何適合物質(zhì)，例如交聯(lián)蛋白質(zhì)形成。適合的蛋白質(zhì)為白蛋白（在序列上為血清來源或 重組、人或非人類）。例如W092/18164中，適合在本發(fā)明中用作不溶性載體的微?？赏ㄟ^使 用眾所周知的噴霧干燥技術(shù)，噴霧干燥人血清白蛋白（HSA)形成。使用微粒作為載體的替 代方案包括脂質(zhì)體、合成聚合物顆粒（例如聚乳酸、聚乙醇酸和聚（乳酸/乙醇酸））或細(xì) 胞膜碎片。
[0026] 至少大部分載體優(yōu)選最大尺寸小于6 μ m。
[0027] 理論上，每個載體的纖維蛋白原結(jié)合肽數(shù)量沒有上限。最佳數(shù)量很可能取決于許 多因素，例如載體的性質(zhì)和每個載體上連接纖維蛋白原結(jié)合肽的反應(yīng)基團(tuán)數(shù)量。然而，優(yōu)選 平均每個載體分子多達(dá)1〇〇個纖維蛋白原結(jié)合肽。優(yōu)選地，平均每個載體分子有至少3個， 優(yōu)選至少5個纖維蛋白原結(jié)合肽。優(yōu)選范圍為每個載體分子10-20個纖維蛋白原結(jié)合肽。
[0028] 優(yōu)選地，纖維蛋白原結(jié)合肽共價固定到載體。
[0029] 載體可包含允許連接纖維蛋白原結(jié)合肽的反應(yīng)基團(tuán)。例如，載體可在其表面包含 硫醇部分或胺部分。如果載體為蛋白質(zhì)性，則可由氨基酸例如半胱氨酸或賴氨酸的側(cè)鏈提 供硫醇或胺部分。可選地，可向載體添加反應(yīng)基團(tuán)。如果載體由蛋白質(zhì)，例如HSA形成，這 特別有利。例如，可使用能夠與載體上的伯胺基反應(yīng)的試劑例如2-亞氨基硫烷（2-IT)硫 醇化載體?？蛇x地，在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)和N-羥基琥 珀酰亞胺（NHS)的存在下，使胱胺與載體上的羧基偶聯(lián)，接著還原裂解引入的二硫鍵。
[0030] 在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，纖維蛋白原結(jié)合肽經(jīng)間隔區(qū)共價固定到載體。優(yōu)選間隔 區(qū)為非肽間隔區(qū)，例如包含親水性聚合物例如聚乙二醇（PEG)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，各 自包含通過PEG間隔區(qū)與硫醇-反應(yīng)基團(tuán)（例如，馬來酰亞胺基團(tuán)）連接的纖維蛋白原結(jié) 合肽的多種肽偶聯(lián)物與硫醇化載體（例如，使用如上所述的2-IT或胱胺制備而成）反應(yīng)。
[0031] 可通過使載體的水溶液或懸浮液與敷料材料接觸足夠長時間使載體非共價固定 到非膠體多孔敷料材料，以致載體變成固定到敷料材料上。在一種優(yōu)選方法中，將載體浸在 敷料材料上。
[0032] 在其它實(shí)施方案中，每個纖維蛋白原結(jié)合肽任選地經(jīng)間隔區(qū)直接共價固定到非膠 體多孔敷料材料。優(yōu)選的間隔區(qū)為非肽間隔區(qū)，優(yōu)選包含親水性聚合物例如PEG。
[0033] 在此類實(shí)施方案中，非膠體多孔敷料材料優(yōu)選包含顆?；蛑?。在一個特別優(yōu)選的 實(shí)施方案中，顆?；蛑榘酆衔镔|(zhì)，例如蛋白質(zhì)（例如明膠）。
[0034] 非膠體敷料材料可包含允許連接纖維蛋白原結(jié)合肽的反應(yīng)基團(tuán)。例如，敷料材料 可在其表面包含硫醇部分或胺部分。如果敷料材料為蛋白質(zhì)性，則可由氨基酸例如半胱氨 酸或賴氨酸的側(cè)鏈提供硫醇或胺部分?？蛇x地，可向敷料材料添加反應(yīng)基團(tuán)。如果敷料材 料由蛋白質(zhì)，例如明膠形成，這特別有利。例如，可使用能夠與敷料材料上的伯胺基反應(yīng)的 試劑例如2-亞氨基硫烷（2-IT)硫醇化敷料材料。可選地，在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙 基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)的存在下，使胱胺與敷料材料上的 羧基偶聯(lián)，接著還原裂解引入的二硫鍵。
[0035] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，纖維蛋白原結(jié)合肽經(jīng)間隔區(qū)共價固定到非膠體敷料材料。優(yōu) 選間隔區(qū)為非肽間隔區(qū)，例如包含親水性聚合物例如聚乙二醇（PEG)。在一個優(yōu)選實(shí)施方 案中，各自包含通過PEG間隔區(qū)與硫醇-反應(yīng)基團(tuán)（例如，馬來酰亞胺基團(tuán)）連接的纖維蛋 白原結(jié)合肽的多種肽偶聯(lián)物與硫醇化敷料材料（例如，使用如上所述的2-IT或胱胺制備而 成）反應(yīng)。
[0036] 本發(fā)明的止血傷口敷料呈干燥形式，優(yōu)選呈凍干形式。以下實(shí)施例5顯示本發(fā)明 的止血傷口敷料在凍干后保持再水合后共聚纖維蛋白原的能力。
[0037] 優(yōu)選傷口敷料無菌。本發(fā)明的止血傷口敷料可作為準(zhǔn)備好向傷口施用的無菌傷口 敷料提供。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步提供了與向傷口施加傷口敷料的說明書包裝在一起的本發(fā)明 止血傷口敷料。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于形成止血傷口敷料的試劑盒，其包含非膠體多孔敷 料材料，和單獨(dú)地，包含多個載體和固定到每個載體的多個纖維蛋白原結(jié)合肽的止血劑，其 中每個纖維蛋白原結(jié)合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pr〇-Arg-Xaa(SEQ ID NO :1)，其中Xaa為除Val以外的任何氨基酸，優(yōu)選為Pro、Sar或Leu ;或在所述肽氨基末端 的氨基酸序列Gly-His_Arg-Xaa(SEQ ID NO :2)，其中Xaa為除Pro以外的任何氨基酸。
[0040] 試劑盒可進(jìn)一步包含在向傷口施加敷料材料之前將所述試劑施加到非膠體多孔 敷料材料上的說明書和/或向傷口施加止血傷口敷料的說明書。
[0041] 還根據(jù)本發(fā)明提供了包含多個載體和固定到每個載體的多個纖維蛋白原結(jié) 合肽的止血劑，其中每個纖維蛋白原結(jié)合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列 Gly-Pro_Arg-Xaa(SEQ ID N0:1)，其中Xaa為除Val以外的任何氨基酸，優(yōu)選為Pro、Sar 或Leu ;或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID NO :2)，其中Xaa為 除Pro以外的任何氨基酸，并且其中所述試劑與在向傷口施加敷料材料之前將所述試劑施 加到非膠體多孔敷料材料上的說明書包裝在一起。
[0042] 有利的是，止血劑可呈溶液、懸浮液或干燥形式，例如凍干形式。以下實(shí)施例3證 明本發(fā)明的止血劑在從本發(fā)明的凍干止血傷口敷料萃取到溶液中后，保持共聚纖維蛋白原 的能力。實(shí)施例6顯示本發(fā)明的止血劑在37°C下，呈溶液穩(wěn)定至少6個月。因此，若需要， 可將本發(fā)明的止血劑呈溶劑儲存，從而避免在使用之前復(fù)水成溶液的需要。
[0043] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了控制出血，尤其是嚴(yán)重出血的方法，其包括向傷口施用本發(fā) 明的止血傷口敷料。
[0044] 本文使用術(shù)語"嚴(yán)重出血"以包括需要干預(yù)（手術(shù)或內(nèi)窺鏡檢查）或封閉空間減 壓以終止或控制所述事件的出血，引起血液動力學(xué)危害（需要血液、補(bǔ)液、強(qiáng)心劑或手術(shù)干 預(yù)）的出血或無法通過常規(guī)干預(yù)例如手法壓迫、燒灼或縫合控制的出血。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明還提供了一種制備止血傷口敷料的方法，其包括將多個纖維蛋白原結(jié) 合肽固定到非膠體多孔敷料材料，其中每個纖維蛋白原結(jié)合肽包含：在所述肽氨基末端的 氨基酸序列Gly-Pr〇-Arg-Xaa(SEQ ID N0:1)，其中Xaa為除Val以外的任何氨基酸，優(yōu)選 為Pro、Sar或Leu ;或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His_Arg-Xaa(SEQ ID NO :2)， 其中Xaa為除Pro以外的任何氨基酸。
[0046] 多個纖維蛋白原結(jié)合肽可共價或非共價固定到非膠體多孔敷料材料。
[0047] 優(yōu)選地通過將多個載體固定到非膠體多孔敷料材料將多個纖維蛋白原結(jié)合肽固 定到非膠體多孔敷料材料，其中多個纖維蛋白原結(jié)合肽固定到每個載體上。
[0048] 此類方法可進(jìn)一步包括將多個纖維蛋白原結(jié)合肽固定到每個載體上。
[0049] 優(yōu)選地，多個載體非共價固定到非膠體多孔敷料材料，并且多個纖維蛋白原結(jié)合 肽優(yōu)選共價固定到每個載體上。
[0050] 以上描述了任選經(jīng)間隔區(qū)（優(yōu)選非肽間隔區(qū)，例如包含親水性聚合物（例如PEG)) 將纖維蛋白原結(jié)合肽共價固定到載體上的適合方法。
[0051] 以上描述了將載體非共價固定到非膠體多孔敷料材料的適合方法。
[0052] 以上描述了任選經(jīng)間隔區(qū)（優(yōu)選非肽間隔區(qū)，例如包含親水性聚合物（例如PEG)) 將每個纖維蛋白原結(jié)合肽直接共價固定到非膠體多孔敷料材料上的適合方法。
[0053] 還根據(jù)本發(fā)明提供了一種制備止血傷口敷料的方法，其包括將止血劑施加 到非膠體多孔敷料材料，其中所述止血劑包含多個載體和固定到每個載體的多個纖 維蛋白原結(jié)合肽，其中每個纖維蛋白原結(jié)合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列 Gly-Pr〇-Arg-Xaa(SEQ ID N0:1)，其中Xaa為除Val以外的任何氨基酸，優(yōu)選為Pro、Sar或 Leu;或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID N0:2)，其中Xaa為除 Pro以外的任何氨基酸。
[0054] 例如可通過使止血劑的水溶液或懸浮液與敷料材料接觸足夠長時間使止血劑非 共價施加到非膠體多孔敷料材料上，以致止血劑變成固定到敷料材料上。在一種優(yōu)選方法 中，將止血劑浸在敷料載體上。
[0055] 本發(fā)明特別優(yōu)選的止血傷口敷料包含多個可溶性載體（優(yōu)選可溶性蛋白載體，例 如白蛋白載體），多個纖維蛋白原結(jié)合肽（每個肽優(yōu)選包含在所述肽氨基末端的氨基酸序 列Gly-Pr 〇-Arg-Pr〇-Gly-(SEQ ID Ν0:6))經(jīng)非肽間隔區(qū)（適合地為親水性聚合物，例如聚 乙二醇）共價固定到每個載體。載體非共價固定到非膠體多孔敷料材料（優(yōu)選包含明膠， 例如明膠墊，或包含人造絲或聚酯）。以下實(shí)施例2、3和4中描述了此類止血傷口敷料的實(shí) 例。
[0056] 本發(fā)明進(jìn)一步特別優(yōu)選的止血傷口敷料包含經(jīng)非肽間隔區(qū)（適合地為親水性 聚合物，例如聚乙二醇）直接共價固定到非膠體多孔敷料材料（優(yōu)選包含明膠，例如明 膠顆粒）的多個纖維蛋白原結(jié)合肽（每個肽優(yōu)選包含在所述肽氨基末端的氨基酸序列 Gly-Pro-Arg-Pro-Gly)。以下實(shí)施例5中描述了此類止血傷口敷料的實(shí)例。
[0057] 現(xiàn)參考附圖，僅通過舉例的方式描述本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：
[0058] 圖1示出了共價固定到載體的纖維蛋白原結(jié)合肽的優(yōu)選實(shí)例的結(jié)構(gòu)（根據(jù)本發(fā)明 的優(yōu)選實(shí)施方案，多個此類纖維蛋白原結(jié)合肽共價固定到載體上-圖中僅示出了固定到載 體上的單個纖維蛋白原結(jié)合肽）；
[0059] 圖 2a 不出 了根據(jù) Adams 等人，J Thromb Thrombolysis，2009, 28 (1) : 1-5 分配出 血評分的方案；
[0060] 圖2b為顯示根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，止血傷口敷料止血活性的評估結(jié)果的 圖；
[0061] 圖3示出了從本發(fā)明的凍干和非凍干止血傷口敷料回收的具有固定纖維蛋白原 結(jié)合肽的載體的凝血活性比較結(jié)果；
[0062] 圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，止血傷口敷料止血活性的評估結(jié) 果；
[0063] 圖5示出了固定到HSA載體的纖維蛋白原結(jié)合肽在37°C下呈溶液儲存長達(dá)6個月 的穩(wěn)定性測試結(jié)果。
[0064] 提到關(guān)于本發(fā)明止血傷口敷料和止血劑的"凝塊形成"和"凝固活性"是提到包含 所述敷料或試劑的纖維蛋白原結(jié)合肽和纖維蛋白原，具有纖維蛋白凝塊特征的共聚物的形 成。
[0065] 實(shí)施例1
[0066] 纖維蛋白原結(jié)合肽與白蛋白載體的偶聯(lián)
[0067] 該實(shí)施例描述了通過聚乙二醇（PEG)連接子連接到馬來酰亞胺基團(tuán)（Mai)的序列 GPRPG的纖維蛋白原結(jié)合肽與白蛋白載體的偶聯(lián)。所得產(chǎn)物稱為"P印roStat"。
[0068] 將人血清白蛋白于反應(yīng)緩沖液（50mM磷酸鈉、150mM氯化鈉、lOOmM乙二胺四乙酸 [EDTA]，pH8. 0 ± 0. 2)中稀釋至50mg/mL并通過添加60倍摩爾過量的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽 硫醇化。在室溫下溫育1小時后，使用20mM磷酸鈉、150mM氯化鈉 、ImM EDTA pH7. 2±0. 2(過 濾緩沖液），通過切向流滲濾法將硫醇化白蛋白與未反應(yīng)的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽分離。
[0069] 通過按50mg/mL的濃度將肽（GPRPG-PEG12-馬來酰亞胺）溶解于過濾緩沖液中并 且按每lmg白蛋白0. 95mg肽的比例添加到硫醇化白蛋白中進(jìn)行肽偶聯(lián)。在室溫下溫育1 小時后，通過用60倍過量的Tris緩沖鹽水（TBS;20mM Tris、150mM氯化鈉 pH7. 2±0. 2)， 使用截留分子量為10-14KD的透析膜在4°C下透析至少16小時，更換一次緩沖液，去除過量 肽。于TBS中將回收的PeproStat稀釋至5mg/mL，通過0. 2 μ m過濾器無菌過濾，分配并于 4°C下儲存。
[0070] 通過測量280nm下的吸光度估計最終產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量，其中E(280，l% )= 5. 3。
[0071] 使用Sigma Amelung KC4凝血計研究最終產(chǎn)物的活性。簡言之，按3mg/ml向 100 μ L0. 5mg/ml的純化人纖維蛋白原添加30 μ L試樣，KC4記錄在少于6s內(nèi)凝塊形成。
[0072] 使用經(jīng)考馬斯（Coomassie)染色的4-15% Tris-甘氨酸預(yù)制凝膠，通過還原樣品 的SDS-PAGE，通過與未染色蛋白梯的條帶概況比較，估計最終產(chǎn)物的分子量。
[0073] 產(chǎn)物概況
[0074]
【權(quán)利要求】
1. 一種止血傷口敷料，其包含非膠體多孔敷料材料和固定到所述非膠體多孔敷料材料 的多個纖維蛋白原結(jié)合肽，其中每個纖維蛋白原結(jié)合肽包含： 在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pr〇-Arg-Xaa(SEQ ID N0:1)，其中Xaa為除Val 以外的任何氨基酸，優(yōu)選為Pro、Sar或Leu ;或 在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID N0:2)，其中Xaa為除Pro 以外的任何氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的傷口敷料，其中所述多個纖維蛋白原結(jié)合肽非共價固定到所述非 膠體多孔敷料材料。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的傷口敷料，其中多個載體固定到所述非膠體多孔敷料材料，并 且多個纖維蛋白原結(jié)合肽固定到每個載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的傷口敷料，其中所述多個纖維蛋白原結(jié)合肽共價固定到每個載 體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的傷口敷料，其中每個纖維蛋白原結(jié)合肽通過非肽間隔區(qū)共價固定 到所述載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的傷口敷料，其中所述非肽間隔區(qū)包含親水性聚合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的傷口敷料，其中所述親水性聚合物包含聚乙二醇。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一項的傷口敷料，其中所述載體為可溶性載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1的傷口敷料，其中所述多個纖維蛋白原結(jié)合肽共價固定到所述非膠 體多孔敷料材料。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的傷口敷料，其中每個纖維蛋白原結(jié)合肽通過非肽間隔區(qū)共價固 定到所述非膠體多孔敷料材料。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的傷口敷料，其中所述非肽間隔區(qū)包含親水性聚合物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的傷口敷料，其中所述親水性聚合物包含聚乙二醇。
13. 根據(jù)前述任何權(quán)利要求的傷口敷料，其中所述非膠體多孔敷料材料包括片、襯墊、 海綿、泡沫、膜、紗布、網(wǎng)或顆?；蛑?。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的傷口敷料，其中所述非膠體多孔敷料材料包含顆粒，并且其中 大部分所述顆粒具有大于6 μ m的最大尺寸。
15. 根據(jù)前述任何權(quán)利要求的傷口敷料，其中所述非膠體多孔敷料材料包含明膠、棉 花、人造絲、聚酯、膠原、藻酸鹽或氧化纖維素。
16. 根據(jù)前述任何權(quán)利要求的傷口敷料，其呈干燥形式。
17. 根據(jù)前述任何權(quán)利要求的傷口敷料，其呈凍干形式。
18. 根據(jù)前述任何權(quán)利要求的傷口敷料，其中所述纖維蛋白原結(jié)合肽各自為4-60個氨 基酸殘基長。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項的傷口敷料，與向傷口施加所述傷口敷料的說明書包 裝在一起。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項的傷口敷料，其用于控制出血。
21. -種用于形成止血傷口敷料的試劑盒，其包含非膠體多孔敷料材料，和單獨(dú)的止血 齊U，所述止血劑包含多個載體和固定到每個載體的多個纖維蛋白原結(jié)合肽，其中每個纖維 蛋白原結(jié)合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pr〇-Arg-Xaa(SEQ ID N0:1)，其 中Xaa為除Val以外的任何氨基酸，優(yōu)選為Pro、Sar或Leu ;或在所述肽氨基末端的氨基酸 序列Gly-His_Arg-Xaa(SEQ ID NO :2)，其中Xaa為除Pro以外的任何氨基酸。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的試劑盒，其進(jìn)一步包含向傷口施加所述敷料材料之前將所述試 劑施加到所述非膠體多孔敷料材料上的說明書。
23. 根據(jù)權(quán)利要求21或22的試劑盒，其進(jìn)一步包含向傷口施加所述止血傷口敷料的說 明書。
24. -種止血劑，其包含多個載體和固定到每個載體的多個纖維蛋白原結(jié)合肽，其中每 個纖維蛋白原結(jié)合肽包含： 在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pr〇-Arg-Xaa(SEQ ID N0:1)，其中Xaa為除Val 以外的任何氨基酸，優(yōu)選為Pro、Sar或Leu ;或 在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID N0:2)，其中Xaa為除Pro 以外的任何氨基酸；并且 其中所述試劑與向傷口施加所述敷料材料之前將所述試劑施加到非膠體多孔敷料材 料上的說明書包裝在一起。
25. -種控制出血的方法，其包括向傷口施用根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項的止血傷口 敷料。
26. -種制備止血傷口敷料的方法，其包括將多個纖維蛋白原結(jié)合肽固定到非膠體多 孔敷料材料，其中每個纖維蛋白原結(jié)合肽包含 ： 在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pr〇-Arg-Xaa(SEQ ID N0:1)，其中Xaa為除Val 以外的任何氨基酸，優(yōu)選為Pro、Sar或Leu ;或 在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID N0:2)，其中Xaa為除Pro 以外的任何氨基酸。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中通過將多個載體固定到所述非膠體多孔敷料材料， 而將所述多個纖維蛋白原結(jié)合肽固定到所述非膠體多孔敷料材料，其中多個纖維蛋白原結(jié) 合肽固定到每個載體。
28. -種制備止血傷口敷料的方法，其包括將止血劑施加到非膠體多孔敷料材料，其 中所述止血劑包含多個載體和固定到每個載體的多個纖維蛋白原結(jié)合肽，其中每個纖維蛋 白原結(jié)合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pr〇-Arg-Xaa(SEQ ID N0:1)，其中 Xaa為除Val以外的任何氨基酸，優(yōu)選為Pro、Sar或Leu ;或在所述肽氨基末端的氨基酸序 列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID NO :2)，其中Xaa為除Pro以外的任何氨基酸。
【文檔編號】A61F13/00GK104114198SQ201380007527
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月1日
【發(fā)明者】格雷格·沃克, 薩拉·瑪格麗特·米德爾頓 申請人:哈莫斯塔蒂斯有限公司