一種改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物及其制備方法。該組合物是由包括如下組成的原料制備而成的：紫河車、黃精、丹參。本發(fā)明還提供了這種改善子宮內(nèi)膜容受性中藥組合物的制備方法。本發(fā)明提供的組合物提高了輔助生殖醫(yī)療臨床妊娠率，具有補(bǔ)腎填精，養(yǎng)血活血調(diào)經(jīng)功效。通過調(diào)節(jié)著床窗口期子宮內(nèi)膜血管生成，可有效地改善促排卵治療后的子宮內(nèi)膜容受性，提高臨床妊娠率。從而減少反復(fù)試管嬰兒失敗造成的重復(fù)治療，減輕患者心理、身體及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
【專利說明】一種改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，具體涉及一種改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】[0002]子宮內(nèi)膜容受是指子宮內(nèi)膜處于一種允許囊胚定位、黏附、侵入并使內(nèi)膜間質(zhì)發(fā)生改變從而導(dǎo)致胚胎著床的狀態(tài)，子宮內(nèi)膜接受胚胎的能力即為子宮內(nèi)膜容受性。子宮內(nèi)膜容受性是目前輔助生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。最新數(shù)據(jù)顯示，約有12-15%的育齡夫婦存在著生殖障礙，是困擾社會(huì)和家庭的實(shí)際問題。體外授精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)的應(yīng)用，為千萬不孕不育夫婦帶來了希望。近年來盡管輔助生殖技術(shù)不斷改進(jìn)，使得卵子受精率與胚胎形成率分別達(dá)80%和90%左右，可供移植的胚胎質(zhì)量得到顯著提高。相比之下，仍有75%左右的移植胚胎種植失敗，種植率仍停留在低水平。子宮內(nèi)膜容受性的建立對胚胎著床成功是至關(guān)重要的。反復(fù)著床失敗則是造成重復(fù)治療和醫(yī)療成本居高不下的重要原因。
[0003]目前改善子宮內(nèi)膜容受性的方法主要有:激素調(diào)節(jié)、增加微循環(huán)、中藥治療、手術(shù)治療。對于激素水平正常，且沒有器質(zhì)性病變的患者，尚無有效措施。如何有效地改善促排卵治療后的子宮內(nèi)膜容受性，提高臨床妊娠率是目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迫切需要解決的瓶頸問題。
[0004]中醫(yī)藥是我國的一大瑰寶，在中醫(yī)婦科腎氣-天癸-沖任-胞宮理論指導(dǎo)下，中醫(yī)藥治療不孕癥積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。近年來，中醫(yī)藥滲透入輔助生殖的各個(gè)環(huán)節(jié)，在提高子宮內(nèi)膜容受性，提高妊娠率，并有效地降低西藥毒、副作用等方面有了長足的發(fā)展。但是其機(jī)制尚待明確。如何有效地改善促排卵治療后的子宮內(nèi)膜容受性，提高臨床妊娠率是目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迫切需要解決的瓶頸問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物；
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供一種改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的是通過下列的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]本發(fā)明所述的改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物，是由含以下重量份的原料制備而成的:
[0009]紫河車10 - 19份，黃精10 - 19份，丹參5 — 12份。
[0010]優(yōu)選地，是由含以下重量份的原料制備而成的:
[0011]紫河車12 — 17份，黃精12 — 17份，丹參7 — 10份。
[0012]更優(yōu)選地，是由含以下重量份的原料制備而成的:
[0013]紫河車15份，黃精15份，丹參9份。
[0014]以下是本發(fā)明的藥材來源:
[0015]紫河車:指人類的胎盤，中醫(yī)認(rèn)為，胎盤性味甘、咸、溫，入肺、心、腎經(jīng)，有補(bǔ)腎益精，益氣養(yǎng)血之功?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，胎盤含蛋白質(zhì)、糖、鈣、維生素、免疫因子、女性激素、助孕酮、類固醇激素、促性腺激素、促腎上腺皮質(zhì)激素等，能促進(jìn)乳腺、子宮、陰道、睪丸的發(fā)育，對甲狀腺也有促進(jìn)作用，對肺結(jié)核、支氣管哮喘、貧血等亦有良效，研末口服或灌腸可預(yù)防麻疹或減輕癥狀。對門靜脈性肝硬化腹水及血吸蟲性晚期肝硬化腹水也有一定的療效。
[0016]黃精:又名老虎姜、雞頭參。為百合科植物滇黃精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.)、黃精(Polygonatum sibiricum Red.)或多花黃精(Polygonatum cyrtonemaHua.)的干燥根莖。根據(jù)原植物和藥材性狀的差異，黃精可分為姜形黃精、雞頭黃精和大黃精三種。姜形黃精的原植物多花黃精，雞頭黃精的原植物為黃精，而大黃精(又名碟形黃精)的原植物為滇黃精。三者中以姜形黃精質(zhì)量最佳。
[0017]丹參:又名赤參,紫丹參,紅根等。為雙子葉植物唇形科丹參Salvia miItiorrhiza的干燥根及根莖。主產(chǎn)于安徽、河南、陜西等地。功效:丹參具有歸心、肝經(jīng)。能祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、降脂減肥、清心除煩。
[0018]本發(fā)明的另一方面是提供了本發(fā)明中藥組合物的活性成分的制備方法，該方法是采用水提或40— 80%體積百分濃度的乙醇提取。具體的制備方法如下:
[0019]方案一:全部3味藥材，加水提取2-3次，每次加水量相當(dāng)于藥材總重量的8 — 10倍，每次提取時(shí)間為1-3小時(shí)，合并提取液，濾過，濾液濃縮成流浸膏，即得活性成分。
[0020]方案二:取全部3味藥材，用40-80%乙醇回流提取2-3次，每次乙醇用量為藥材總量的4-10倍，提取時(shí)間為1-3小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液濃縮成流浸膏，即得活性成分。
[0021]本發(fā)明所述的改善子宮 內(nèi)膜容受性的中藥組合物，可以與醫(yī)藥學(xué)上可接受的載體配合，制成各種常用制劑，如片劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑等。
[0022]本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于以下:
[0023]稀釋劑:淀粉、糖粉、乳糖、糊精、微晶纖維素、無機(jī)鹽、糖醇類等。
[0024]潤濕劑與粘合劑:純化水、乙醇、明膠、聚乙二醇、纖維素衍生物等。
[0025]崩解劑:淀粉、羧甲基淀粉鈉、纖維素衍生物、交聯(lián)聚維酮等。
[0026]潤滑劑:硬脂酸鎂、微粉硅膠、滑石粉、聚乙二醇等。
[0027]助溶劑:水、乙醇、甘油、丙二醇、液狀石蠟、植物油等。
[0028]矯味劑:蔗糖、單糖、芳香劑等。
[0029]防腐劑:苯甲酸、山梨酸、甲酯、乙酯、丙酯等。
[0030]方法1:片劑
[0031]取方案一至方案二所得活性成分之一，加入片劑常用輔料，按常規(guī)生產(chǎn)方法制備得本發(fā)明片劑。
[0032]上述片劑常用輔料包括稀釋劑、潤濕劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑之一或全部。
[0033]方法2:顆粒劑
[0034]取方案一至方案二所得活性成分之一，加入顆粒劑常用輔料，按常規(guī)生產(chǎn)方法制備得本發(fā)明顆粒劑。
[0035]上述顆粒劑常用輔料包括稀釋劑、潤濕劑、粘合劑、崩解劑之一或全部。
[0036]方法3:膠囊劑
[0037]取方案一至方案二所得活性成分之一，加入膠囊劑常用輔料，按常規(guī)生產(chǎn)方法制備得本發(fā)明膠囊劑。[0038]上述膠囊劑常用輔料包括稀釋劑、潤濕劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑之一或全部。
[0039]方法4:糖漿劑
[0040]取方案一至方案二所得活性成分之一，加入糖漿劑常用輔料，按常規(guī)生產(chǎn)方法制備得本發(fā)明糖漿劑。
[0041]上述糖漿劑常用輔料包括矯味劑、防腐劑、助溶劑之一或全部。
[0042]方法5:合劑
[0043]取方案一至方案二所得活性成分之一，加入合劑常用輔料，按常規(guī)生產(chǎn)方法制備得本發(fā)明合劑。
[0044]上述合劑常用輔料包括矯味劑、防腐劑之一或全部。
[0045]中醫(yī)認(rèn)為腎藏精，主生殖；女子以血為本。臨床上子宮內(nèi)膜容受性低下常與腎虛血瘀有密切的關(guān)系， 申請人:針對這類病人使用具有補(bǔ)腎填精，養(yǎng)血活血調(diào)經(jīng)功效的本發(fā)明中藥組合物治療50余例患者，取得了一定的療效。
[0046]本發(fā)明改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物組方中，君藥為紫河車，具有補(bǔ)氣，養(yǎng)血，益精功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)紫河車具有激素樣作用；臣藥黃精，具有滋腎潤肺，補(bǔ)脾益氣功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃精具有調(diào)節(jié)免疫功能、延緩衰老等作用；丹參為使藥，具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，養(yǎng)血安神等功效，《本草綱目》認(rèn)為“一味丹參，功同四物”，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)丹參具有促進(jìn)組織的修復(fù)與再生作用、改善微循環(huán)的作用。三藥合用具有補(bǔ)腎填精，養(yǎng)血活血調(diào)經(jīng)功效。
[0047]本發(fā)明技術(shù)方案符合中醫(yī)辨證施治的機(jī)理，立足疾病之本源，組方合理科學(xué)。
[0048]本發(fā)明提供的一種改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0049]1、本發(fā)明提供的組合物提高了輔助生殖醫(yī)療臨床妊娠率，具有補(bǔ)腎填精，養(yǎng)血活血調(diào)經(jīng)功效。通過調(diào)節(jié)著床窗口期子宮內(nèi)膜血管生成，可有效地改善促排卵治療后的子宮內(nèi)膜容受性，提高臨床妊娠率。從而減少反復(fù)試管嬰兒失敗造成的重復(fù)治療，減輕患者心理、身體及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0050]2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的中藥組合物能顯著提高腎虛血瘀模型大鼠體內(nèi)雌激素水平、子宮內(nèi)膜厚度及腺上皮高度；能顯著提高模型大鼠子宮內(nèi)膜ERa表達(dá)和子宮內(nèi)膜微血管密度；可上調(diào)腎虛血瘀模型大鼠子宮內(nèi)膜EG-VEGF、Ang-2、H0XA10蛋白和基因表達(dá)；可上調(diào)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞EG-VEGF、Ang-2、H0XA10基因表達(dá)。研究提示本發(fā)明可通過上調(diào)腎虛血瘀模型大鼠子宮內(nèi)膜ERa、EG-VEGF, Ang_2、H0XA10蛋白和/或基因表達(dá)，促進(jìn)腎虛血瘀模型大鼠子宮內(nèi)膜血管生成、改善子宮內(nèi)膜容受性；可通過上調(diào)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞EG-VEGF、Ang-2、H0XA10基因表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管生成，有利于子宮內(nèi)膜進(jìn)入容受狀態(tài)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1 是:各組間 EG-VEGF、Ang-2, HOXAlOmRNA 電泳條帶圖
[0052]圖2是:各組間EG-VEGF、Ang-2, H0XA10蛋白電泳條帶圖
[0053]圖中各部分標(biāo)號及名稱如下:1:實(shí)施例1低劑量組2:實(shí)施例1中劑量組3:實(shí)施例I高劑量4:模型組5:阿司匹林組6:空白對照組，GAPDH:內(nèi)參，β -actin:上樣對照?！揪唧w實(shí)施方式】
[0054]下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。除非另有說明，本發(fā)明中的乙醇量的百分?jǐn)?shù)是體積百分?jǐn)?shù)，v/v表示溶液的體積比。
[0055]實(shí)施例1
[0056]取紫河車15g，黃精15g、丹參9g，全部3味藥材，加水提取3次，每次加水量分別相當(dāng)于藥材總重量的10倍、8倍、8倍，每次提取時(shí)間分別為3小時(shí)、2小時(shí)、I小時(shí)，合并提取液，濾過，濾液濃縮成流浸膏，得本發(fā)明活性成分。
[0057]實(shí)施例2糖漿劑
[0058]取紫河車12g，黃精12g、丹參7g，全部3味藥材，加水提取2次，每次加水量分別相當(dāng)于藥材總重量的10倍、8倍，每次提取時(shí)間分別為3小時(shí)、2小時(shí)，合并提取液，濾過，濾液濃縮成流浸膏，加入蔗糖、山梨酸、水?dāng)嚢杈鶆?，制得糖漿劑。
[0059]實(shí)施例3片劑
[0060]取紫河車17g，黃精17g、丹參10g，全部3味藥材，加水提取3次，每次加水量分別相當(dāng)于藥材總重量的10倍、10倍、8倍，每次提取時(shí)間分別為2小時(shí)、I小時(shí)、I小時(shí)，合并提取液，濾過，濾液濃縮成流浸膏，加入輔料淀粉、乙醇、滑石粉，制得片劑。
[0061]實(shí)施例4合劑
[0062]取紫河車10g，黃精15g、丹參5g，將上述全部藥材用乙醇回流提取2次，每次乙醇濃度分別為80%、60%，每次乙醇用量分別為藥材總量的10倍、8倍，每次提取時(shí)間分別為3小時(shí)、2小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液濃縮成流浸膏，加入輔料淀粉、乙醇、滑石粉，加入純化水至總重量為藥材總重量的3倍，灌裝，即得本發(fā)明合劑。
[0063]實(shí)施例5片劑
[0064]取紫河車19g，黃精19g、丹參12g，，將上述全部藥材用乙醇回流提取3次，每次乙醇濃度分別為80%、60%、40%，每次乙醇用量分別為藥材總量的10倍、8倍、4倍，每次提取時(shí)間分別為3小時(shí)、2小時(shí)、I小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液濃縮成流浸膏，加入輔料淀粉、乙醇、滑石粉，制得片劑。
[0065]實(shí)施例6膠囊劑
[0066]取紫河車15g，黃精10g、丹參10g，將上述全部藥材用乙醇回流提取3次，每次乙醇濃度分別為80%、60 %、60%，每次乙醇用量分別為藥材總量的10倍、8倍、8倍，每次提取時(shí)間分別為2小時(shí)、2小時(shí)、I小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液濃縮成流浸膏，加入輔料淀粉、乙醇、糊精、硬脂酸鎂，裝入膠囊殼、制得膠囊劑。
[0067]實(shí)施例7顆粒劑
[0068]取金紫河車10g，黃精157g、丹參12g，全部3味藥材，加水提取3次，每次加水量分別相當(dāng)于藥材總重量的10倍、8倍、8倍，每次提取時(shí)間分別為2小時(shí)、2小時(shí)、I小時(shí)，合并提取液，濾過，濾液濃縮成藥材總重量的3倍；取薄荷，加藥材重量的6倍水提取0.5小時(shí)，濾過，濾液與上述濃縮液合并，混勻，濾液濃縮至70°C時(shí)相對密度為1.25的浸膏，加入輔料糖粉、淀粉、糊精、乙醇，制得顆粒劑。
[0069]實(shí)施例8粉劑[0070]稱取紫河車17g，黃精10g、丹參5g，藥材凈選、粉碎，過80-100目篩，即得本發(fā)明粉劑。
[0071]動(dòng)物藥效實(shí)驗(yàn):中藥組合物改善雌性腎虛血瘀模型大鼠子宮內(nèi)膜容受性的實(shí)驗(yàn)研究
[0072]I實(shí)驗(yàn)材料
[0073]1.1 動(dòng)物
[0074]健康SPF級昆明種大鼠，雌性，體重150 ± 20g，購買自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0075]1.2藥品與試劑
[0076]本發(fā)明實(shí)施例1、0.9%生理鹽水、阿司匹林。
[0077]2實(shí)驗(yàn)方法
[0078]2.1 造模
[0079]適應(yīng)性喂養(yǎng)5天，此后每天進(jìn)行陰道涂片檢查，連續(xù)10天，觀察大鼠動(dòng)情周期。所有雌性大鼠有規(guī)律的動(dòng)情周期后隨機(jī)抽取10只大鼠作為空白對`照組，其余50只參考施新猷方法進(jìn)行去勢手術(shù)。大鼠稱重，經(jīng)10%水合氯醛(0.33ml/100g)腹腔內(nèi)注射麻醉后，取俯臥位固定，用脫毛液于最末肋骨水平脫去約4X4cm大小背毛，碘酒、酒精消毒后，取最末肋骨水平背部正中切口長約2cm，剪開皮膚，先將皮膚拉向左側(cè)，剪開背肌，視野中可見一乳白色發(fā)亮的脂肪團(tuán)，卵巢即包埋在其中，以眼科鑷輕輕夾住脂肪團(tuán)，拉出切口外，分離脂肪團(tuán)，便見到淡粉色傘狀的卵巢，直徑約0.5cm,以纖細(xì)的輸卵管連于子宮角，于左側(cè)卵巢下結(jié)扎輸卵管，在接扎線遠(yuǎn)端剪掉卵巢，觀察無活動(dòng)性出血，順勢將子宮角送回腹腔，局部點(diǎn)青霉素2-3滴，逐層縫合，同法摘除另一側(cè)卵巢?？瞻讓φ战M麻醉備皮方法同模型組，切口后，暴露卵巢組織即進(jìn)關(guān)閉腹腔，保留雙側(cè)卵巢組織。術(shù)后每天給予青霉素16萬單位/只肌注，連續(xù)5天。術(shù)后連續(xù)行陰道涂片檢查，正常各組仍有典型的周期性變化；模型各組失去周期變化，無動(dòng)情期出現(xiàn)，確定模型是否成功建立。
[0080]2.2實(shí)驗(yàn)分組
[0081]取造模成功大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為空白對照組、模型組、實(shí)施例I高劑量組、實(shí)施例1中劑量組、實(shí)施例1低劑量組、阿司匹林組。
[0082]2.3 給藥
[0083]實(shí)施例1高劑量組每天按生藥量7.8g/kg劑量灌胃給予相應(yīng)藥物；
[0084]實(shí)施例1中劑量組每天按生藥量3.9g/kg劑量灌胃給予相應(yīng)藥物；
[0085]實(shí)施例1低劑量組每天按生藥量1.95g/kg劑量灌胃給予相應(yīng)藥物；
[0086]阿司匹林組每天按10mg/kg劑量灌胃給藥；
[0087]空白對照組每天給予等容量的生理鹽水。
[0088]以上每組給藥為I次/天，灌胃量為lml/100g體重，連續(xù)30天。
[0089]2.4指標(biāo)檢測
[0090]2.4.1血清E2水平測定:應(yīng)用雌二醇化學(xué)發(fā)光試劑盒，按試劑盒說明進(jìn)行操作。
[0091]2.4.2取大鼠子宮，4%多聚甲醛固定，24小時(shí)后進(jìn)行漂洗，逐級酒精脫水，二甲苯透明，子宮中段同一切面垂直石蠟包埋，制作5 μ m切片，3片/標(biāo)本，HE染色，中性樹脂膠封片，光鏡下觀察:子宮內(nèi)膜厚度、形態(tài)及腺上皮形態(tài)、間質(zhì)形態(tài)以及腺上皮高度。[0092]2.4.3子宮內(nèi)膜微血管密度及ERa，免疫組織化學(xué)染色步驟按試劑盒說明進(jìn)行操作。
[0093]采用⑶34測量大鼠子宮內(nèi)膜微血管密度(MVD)，以⑶34抗體標(biāo)記微血管，低倍鏡視野中(1OX)選取微血管內(nèi)皮細(xì)胞染色清晰、背景對照良好的視野，檢查腺上皮細(xì)胞周圍血管密集區(qū)，在高倍視野(40X)下計(jì)數(shù)所有的血管，由計(jì)算機(jī)決定測量區(qū)域，至少測量5個(gè)視野，以微血管/40X視野為子宮內(nèi)膜微血管密度，取平均值。孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)代表一個(gè)單獨(dú)的微血管，若血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)多于8個(gè)，不計(jì)為微血管。單個(gè)棕染內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞堆積無論有無管腔形成，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分枝結(jié)構(gòu)也作為一個(gè)血管參與計(jì)數(shù)，管腔較大且有較厚肌層的不在計(jì)數(shù)之列。
[0094]通過安裝在01ympusBX60顯微鏡上的SP0-1I數(shù)碼成相軟件系統(tǒng)以及Meta morph圖像分析軟件對ERa免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行拍照和分析。方法是分別在高倍視野(40 X)下，每張切片在子宮內(nèi)膜層隨機(jī)選取3個(gè)視野，測量其灰度值，取平均值。攝像時(shí)注意定位要準(zhǔn)確，各組所選部位盡量保持一致；圖像分析時(shí)在相同面積下進(jìn)行，以保證結(jié)果的可比性。
[0095]2.4.4RT-PCR法檢測大鼠子宮內(nèi)膜組織EG-VEGF、Ang-2, HOXAlOmRNA的表達(dá)
[0096]2.4.4.1.總 RNA 提取
[0097]2.4.4.1.1總RNA提取用Trizol法。自液氮貯存罐中轉(zhuǎn)移出子宮內(nèi)膜組織，置入經(jīng)冰預(yù)冷的研缽中。按50mg:lml比例加入Trizol溶液,迅速研磨,將粉末加入無菌的1.5ml離心管中，室溫放置5min。
[0098]2.4.4.1.2以0.2ml/ml Trizol的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒，待充分乳化溶液呈乳白狀，室溫放置2~3min。
[0099]2.4.4.1.34°C 12000r/min離心15min，離心后溶液分為三層，由下至上為:淡粉的酚仿層、中間白色蛋白層和澄清的水相，RNA在水相中，約500 μ I。
[0100]2.4.4.1.4取上層水相于一新離心管中，按0.5ml/ml Trizol的比例加入異丙醇，室溫放置IOmin。
[0101]2.4.4.1.540C 12000r/min離心10分鐘。RNA沉淀后呈膠狀片層。
[0102]2.4.4.1.6 棄上清，按 lml/ml Trizol 液加入 75% 乙醇(DEPC 水配制)。
[0103]2.4.4.1.7 輕輕上下翻轉(zhuǎn)，4°C 7500r/min 離心 5min。
[0104]2.4.4.1.8小心棄上清，室溫干燥3min。
[0105]2.4.4.1.9將RNA溶于30~50ul DEPC水中；RNA樣品長期保存于_80°C冰箱。
[0106]2.4.4.2反轉(zhuǎn)錄體系
[0107]RNA3μ l
[0108]Oligo (dT)1μ l
[0109]dd H20 (DEPC 處理)9.5 μl
[0110]以上首先70°C孵育5min，然后迅速放在冰上。
[0111]
【權(quán)利要求】
1.一種改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物，其特征在于它是由包括如下重量份的原料制備而成的:紫河車10 — 19份，黃精10 — 19份，丹參5 — 12份。
2.如權(quán)利要求1所述的改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物，其特征在于它是由包括如下重量份的原料制備而成的:紫河車12 — 17份，黃精12 — 17份，丹參7 — 10份。
3.如權(quán)利要求1所述的改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物，其特征在于它是由包括如下重量份的原料制備而成的:紫河車15份，黃精15份，丹參9份。
4.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的中藥組合物，其特征在于它的活性成分是采用水提或40— 80%體積百分濃度的乙醇提取制備而成的。
5.如權(quán)利要求4所述的中藥組合物，其特征在于它的活性成分是通過以下方法制備而成的:全部3味藥材，加水提取2-3次，每次加水量相當(dāng)于藥材總重量的8 - 10倍，每次提取時(shí)間為1-3小時(shí)，合并提取液，濾過，濾液濃縮成流浸膏，即得活性成分。
6.如權(quán)利要求4所述的中藥組合物，其特征在于它的活性成分是通過以下方法制備而成的:取全部3味藥材，用40-80%乙醇回流提取2-3次，每次乙醇用量為藥材總量的4-10倍，提取時(shí)間為1-3小時(shí)，合并提取液，過濾，濾液濃縮成流浸膏，即得活性成分。
7.一種改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合物，包括權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的改善子宮內(nèi)膜容受性的中藥組合 物與醫(yī)藥行業(yè)上可接受的載體。
【文檔編號】A61P15/08GK103816376SQ201310740105
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】林佳靜 申請人:柳州市工人醫(yī)院