石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細(xì)胞mfc細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用及石椒草咳喘片的制備方法。本發(fā)明的石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述石椒草咳喘片由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關(guān)藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚(yú)腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得橙皮苷含量有很大提高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用及石椒草咳喘片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]石椒草咳喘顆粒標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS-10449 (ZD-0449) -2002，記載于國(guó)家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編內(nèi)科脾胃分冊(cè)。由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關(guān)藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚(yú)腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，具有清熱化痰、止咳平喘的功效。用于肺熱引起的咳嗽痰稠、口干咽癢，以及急慢性支氣管炎引起的痰濕咳喘。 [0003]現(xiàn)有技術(shù)中，尚未有石椒草咳喘顆粒在在制備抑制胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用的報(bào)道，也未見(jiàn)有石椒草咳喘顆粒提取制備方面采用超臨界和微波技術(shù)的報(bào)道，而揮發(fā)油提取，水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質(zhì)多，導(dǎo)致患者用量過(guò)大，不方便服用，嚴(yán)重影響了本品在臨床上應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供一種石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種石椒草咳喘片的制備方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述石椒草咳喘片由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關(guān)藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚(yú)腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，所述石椒草咳喘片的制備方法由下列步驟組成:取石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚(yú)腥草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C, CO2流量l-3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間180_220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
[0008]優(yōu)選的，上述的石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述石椒草咳喘片由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關(guān)藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚(yú)腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，所述石椒草咳喘片的制備方法由下列步驟組成:取石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚(yú)腥草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力
15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.min，萃取時(shí)間200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
[0009]現(xiàn)有技術(shù)中，石椒草咳喘顆粒每次8_16g，一日3-4次。石椒草咳喘顆粒服藥量大，且顆粒劑制備需要加大量的糖，糖尿病患者不適宜，不加糖的話(huà)味道不佳，患者不容易服下，依從性差。采用本發(fā)明方法制備成的石椒草咳喘片每片重0.5g，每次僅需2-4片，一日服用3-4次。在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結(jié)論可以通過(guò)下述試驗(yàn)證明。且制備成片劑，患者隨水吞下即可，服藥量小且無(wú)苦味，患者易于接受。
[0010]試驗(yàn)一、不同方法制備的石椒草咳喘片中橙皮苷含量的比較
[0011]1、儀器及試藥本發(fā)明石椒草咳喘片:按實(shí)施例1方法制備，使用3007g原料藥，經(jīng)提取制成250片，每片重0.5g。原石椒草咳喘顆粒，按照WS-10449 (ZD-0449)-2002標(biāo)準(zhǔn)方法制備。Agilentl200高效液相色譜儀；METTLER AE240電子分析天平；橙皮苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。
[0012]2、方法
[0013]照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010年版一部附錄VI D)測(cè)定。
[0014]色譜條件與系統(tǒng) 適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%磷酸溶液(24: 76)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為283nm。理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。
[0015]對(duì)照品溶液的制備取橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每Iml含60yg的溶液，即得。
[0016]供試品溶液的制備取本發(fā)明的石椒草咳喘片，研細(xì)，取0.25g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱(chēng)定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
[0017]對(duì)照產(chǎn)品供試品溶液的制備取本對(duì)照的石椒草咳喘顆粒，研細(xì)，取4g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱(chēng)定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
[0018]供試品溶液的制備取本品裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μ 1，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得
[0019]3、結(jié)果
[0020]結(jié)果表明，本發(fā)明石椒草咳喘片中橙皮苷的含量為15_30mg/片；而原石椒草咳喘顆粒中橙皮苷的含量為3.2mg/袋，每次服用量2片的橙皮苷含量為原顆粒劑含量的5-10倍，在服用量減少的情況下，橙皮苷含量有很大提高。
[0021]上述研究表明，采用本發(fā)明制備方法制備的石椒草咳喘片，有效成分含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于WS-10449 (ZD-0449) -2002標(biāo)準(zhǔn)記載的方法制備的石椒草咳喘顆粒。
【具體實(shí)施方式】[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說(shuō)明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0023]實(shí)施例1
[0024]取陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關(guān)藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚(yú)腥草375g、桑白皮188g，將石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚(yú)腥草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度401:，0)2流量2ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
[0025]經(jīng)檢測(cè)，成品中橙皮苷的含量為59.6mg/片。
[0026]實(shí)施例2
[0027]取陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關(guān)藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚(yú)腥草375g、桑白皮188g，將石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚(yú)腥草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，CO2流量3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎， 加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次5分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
[0028]經(jīng)檢測(cè)，成品中橙皮苷的含量為32.9mg/片。
[0029]實(shí)施例3
[0030]取陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關(guān)藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚(yú)腥草375g、桑白皮188g，將石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚(yú)腥草加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，CO2流量lml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率800W，萃取2次，每次10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-10大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
[0031]經(jīng)檢測(cè)，成品中橙皮苷的含量為44.7mg/片。
[0032]實(shí)施例4:石椒草咳喘片抑制小鼠胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料
[0033]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0034]1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株[0035]小鼠胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0036]1.2實(shí)驗(yàn)藥物
[0037]研究藥物:本發(fā)明石椒草咳喘片:按實(shí)施例1方法制備。
[0038]藥液儲(chǔ)液:稱(chēng)取IOOmg石椒草咳喘片，溶于5ml無(wú)水乙醇中，0.2 μ m濾器過(guò)濾，500 μ Idoff管分裝，-20°c存儲(chǔ)，同時(shí)0.2 μ m濾器過(guò)濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。
[0039]1.3實(shí)驗(yàn)試劑
[0040]DMEM(GIBC0 公司 Cat.N0.12100_061Lot.N0.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot.N0.100419) ;NaHC03(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat.N0.11810_033Lot.N0.1088387) ；Trypsin (AMRESC0 公司);EDTA (AMRESC0 公司);Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司I) !Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無(wú)水乙醇(溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限公司)；MTT (Biosharp 批號(hào):0793) =PBS (實(shí)驗(yàn)室自配)；
[0041]1.4實(shí)驗(yàn)器材
[0042]萊卡倒置顯微鏡(德國(guó)Leica型號(hào):DMIL);可見(jiàn)-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司型號(hào):SPECTRAMAX190);C02培養(yǎng)箱(F0RMA型號(hào):3111);超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào)=SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)Spring公司型號(hào):S/N020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型號(hào):P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào):BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號(hào):MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào):DHG9123A);冰箱(西門(mén)子公司型號(hào):KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠型號(hào):ΚΑ-1000);0.2μπι濾器(MILLIP0RE 型號(hào):SLGP033RB);lcm 培養(yǎng)皿(NEST 公司)、96孔培養(yǎng)板(NEST公司)；細(xì)胞計(jì)數(shù)板；離心管、移液管、Tips若干。
[0043]2.實(shí)驗(yàn)方法`
[0044]I) MFC細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(IOcm培養(yǎng)皿)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA,37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm離心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3X IO4個(gè)/ml。
[0045]2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μ 1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0046]3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50%_70%，加入石椒草咳喘片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0047]4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0048]5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔如入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0049]6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0050]7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(%)=(對(duì)照孔OD值-給藥孔OD值)、對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0051]3.統(tǒng)計(jì)處理
[0052]采用Microsoft Excel2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean+ S.D.表不。
[0053]4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果[0054]MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)MFC細(xì)胞增殖抑制有差異(p〈0.05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時(shí)有極顯著性差異(P〈0.001)。
[0055]表1石椒草咳喘片對(duì)MFC細(xì)胞增殖抑制影響研究(X土 SD)
[0056]
【權(quán)利要求】
1.石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述石椒草咳喘片由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關(guān)藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚(yú)腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，其特征在于，所述石椒草咳喘片的制備方法由下列步驟組成:取石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚(yú)腥草，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，C(V流量l-3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間180_220min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率600-800W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮，加到Diaion HP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石椒草咳喘片在制備抑制胃癌細(xì)胞MFC細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述石椒草咳喘片由陳皮156g、石菖蒲96g、虎杖312g、天冬188g、石椒草375g、百部96g、通關(guān)藤750g、臭靈丹375g、苦杏仁96g、魚(yú)腥草375g、桑白皮188g作為原料藥制成，其特征在于，所述石椒草咳喘片的制備方法由下列步驟組成:取石菖蒲、臭靈丹、石椒草、魚(yú)腥草，加入到0)2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥.π?η，萃取時(shí)間200min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入5L的50%乙醇，投入微波萃取裝置中進(jìn)行微波萃取，萃取功率700W，萃取2次，每次5-10分鐘，合并萃取液，濃縮,加到DiaionHP-1O大孔吸附樹(shù)脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述 超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成250片，每片重0.5g。
【文檔編號(hào)】A61P11/14GK103751661SQ201310670788
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】孫波 申請(qǐng)人:濟(jì)南新起點(diǎn)醫(yī)藥科技有限公司