一種天然抗菌肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說是一種天然抗菌肽QHA及其應(yīng)用。天然抗菌肽QHA由30個氨基酸殘基組成，為直鏈多肽，分子量3628.5Da，等電點12.61。本發(fā)明所述抗菌肽QHA具有分子量小、化學(xué)合成方法簡單、抗菌作用廣譜高效、穩(wěn)定性好等有益特點，具有廣泛的應(yīng)用前景。此外本發(fā)明還涉及抗菌肽QHA的編碼基因和應(yīng)用。
【專利說明】一種天然抗菌肽及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說是一種天然抗菌肽QHA及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來傳統(tǒng)抗生素的大規(guī)模濫用導(dǎo)致越來越嚴重的病原微生物耐藥問題，給人類 健康帶來巨大的威脅。臨床上應(yīng)對耐藥微生物感染的措施是使用對耐藥微生物尚未使用過 的新的或者替代性的抗生素，因此這就需要持續(xù)開發(fā)新的抗微生物藥物。
[0003] 抗菌肽是生物體基因編碼的一種天然小分子多肽，是生物體免疫系統(tǒng)的一種重要 分子，對細菌、真菌、病毒甚至原蟲均具有直接的殺滅作用?？咕木哂蟹肿恿啃?、結(jié)構(gòu)簡 單、抗菌活性強、殺菌機制獨特、毒性低和不易引起耐藥性等優(yōu)點，因此自發(fā)現(xiàn)之日起就被 認為是具有極大開發(fā)潛力的新一代抗生素。到目前為止，已從不同生物體中發(fā)現(xiàn)超過1500 多種不同的抗菌肽，而且其數(shù)目還在增加。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種天然抗菌肽QHA及其基因和應(yīng)用。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] -種天然抗菌肽QHA，天然抗菌肽QHA由30個氨基酸殘基組成，為直鏈多肽，分子 量3628. 5Da，等電點12. 61，其氨基酸序列由SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 所述編碼天然抗菌肽QHA的前體的基因自5'端至3'端的堿基序列由SEQ ID N0.2 所示。
[0008] 所述SEQ ID NO. 2所示堿基序列可應(yīng)用于多肽重組表達，轉(zhuǎn)基因動物、植物、植物 部分、動物細胞或植物細胞中。
[0009] -種天然抗菌肽QHA的應(yīng)用，所述天然抗菌肽QHA可制備抗菌藥物、抑制細菌生長 藥物、防腐劑、動物飼料或化妝品前體。
[0010] 所述天然抗菌肽QHA可用于制備抗革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌或真菌的藥 物或組合物。
[0011] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0012] 本發(fā)明所述天然抗菌肽QHA具有分子量小、化學(xué)合成方法簡單、抗菌作用廣譜高 效、穩(wěn)定性好等有益特點，具有廣泛的應(yīng)用前景。

【具體實施方式】
[0013] 下面用實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容,但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于 此。
[0014] 實施例1
[0015] 天然抗菌肽QHA編碼基因的克隆：
[0016] 1)青環(huán)海蛇毒腺總RNA提?。?br> [0017] ①取250mg青環(huán)海蛇毒腺組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到EP管中， 加入Iml總RNA提取試劑（Trizol，美國Invitrogen公司產(chǎn)品），充分混勻，而后于4?, 12000rpm 離心 lOmin。
[0018] ②離心取上清，加入0. 2ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4°C， 12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。
[0019] ③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4°C，12000rpm離心10分鐘，收 集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為青環(huán)海蛇毒腺總RNA。
[0020] 2)青環(huán)海蛇毒腺cDNA文庫構(gòu)建：采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 構(gòu)建。
[0021] (I) cDNA第一鏈合成（mRNA反轉(zhuǎn)錄）：
[0022] ①經(jīng)DEPC處理（DEPC處理是在含0· 1%( V/V)DEPC的水浸泡過夜，高壓滅菌，烘干） 的離心管中加入1 μ 1青環(huán)海蛇毒腺總RNAU μ 13'端一鏈合成引物（3'In-Fusion SMRTer CDS Primer)和2. 5 μ 1經(jīng)DEPC處理（DEPC處理是將含0. 1% (V/V) DEPC的水，放置過夜， 高壓滅菌）的水使總體積達到4. 5μ 1，混勻后短暫離心（2000rpm，30s)，離心后于72°C保溫 3分鐘；保溫后再將離心管在42°C孵育2分鐘。
[0023] ②在上述離心管中加入以下試劑（均為CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備），2. 0 μ 15 X 第一鏈緩 沖液、0·25μ IlOOmM DTT、1.0y IlOmM dNTP Mix、Ι.ΟμΙ SMARTer V Oligonucleotide、 0·25μ I RNase Inhibitor 和 1. Ομ I SMARTScribe Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄酶，混 合離心管中試劑并短暫離心（2000rpm，30s)，在42°C保溫90min，然后68°C保溫lOmin。保 溫處理后將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2 μ 1所合成的cDNA第一鏈備 用。
[0024] (2)采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LD-PCR)方法擴增第二鏈(所用試劑均為 CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 建 庫試劑盒中配備）
[0025] ①將 2μ1 cDNA 第一鏈（mRNA 反轉(zhuǎn)錄)、80 μ 1 去離子水、10 μ 110 X Advantage2PCR 緩沖液、2 μ 150XdNTP混合物、2 μ 15' PCR引物、2 μ I CDS 111/3' PCR引物以及 2μ 150XAdvantage2Polymerase Mix 在 95°C預(yù)熱的 PCR 管中進行混合。
[0026] ②在 PCR 儀中按以下程序擴增：95°C，lmin ;18 個循環(huán)：95°C，15sec，65°C，30sec， 68°C，6min。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈一 80°C保存。
[0027] (3)抗菌肽QHA編碼基因克隆篩選：
[0028] 人工設(shè)計合成正向引物進行PCR擴增，其序列為 5'-GAGGATGGAAGGGTTCTTCTGG-3' ， PCR 另一擴增引物為 CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3' -PCR 引物，其序列 為 5' -CGGGGTACGATGAGACACCAT-3'。PCR 反應(yīng)在如下條件下進行：94°C 5min，94°C 30sec， 58°C 3〇sec和72°C lmin，30個循環(huán)。擴增完成后用膠回收試劑盒(天根生物）進行目的片 段回收。將回收的目的片段連接到PMD19-T載體（Takara，大連），轉(zhuǎn)化進CaCl 2-MgCldi 制備好的DH5 α感受態(tài)細胞。涂板并進行氨芐青霉素和藍白斑雙重篩選，挑取單菌落用M13 引物PCR檢測插入片段大小。挑取陽性菌落，搖菌提取質(zhì)粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer，model ABI PRISM377 進行核苷酸測序。
[0029] 測定結(jié)果：
[0030] SEQ ID NO. 2所示的編碼抗菌肽QHA前體的基因自5'端至3'端序列為：
[0031] atgcaagggttcttctggaagaccttgctggtggttgcagctctcaccatcggtgggacc tcctccct tccacacaaacccctgacctatgaggaggccgtggaccttgcagtgagcatc tacaacagcaaatctagggaagag ttcctgtaccgtgtcctggatgctgttcctccaccc aagtgggatcctctttctgaaagcaaccaagagctgaact tcactatcaaggagacggtg tgcccggtggccgaagaacggtccttggaggaatgcggcttccaggaagacggggc cgtc atgggatgcacaggctactttttctttggcgagtcgcccccggtgctggttctcacctgc gagcctttggt tgaagaagagcagcagaagcaggaggaggggaacgaggaggagaaggag gaaaaggaggaagacgagaaggatcag cccaggagggtcaagaggttcaggaaatttttc aaaaggctgctgaagagcgtgaggcgtgcagtcaagaaattca ggaagaagccgaggctc atcgggctctccaccctcctctaagagagggactcggaaggaccggcagcctccactct c tgatcccaggaaaaccggtagagaaaatgaggccggctgctccagtccgtcagatcattt cccgataggatgct
[0032] 其中編碼抗菌肽QHA為第472-561位核苷酸。
[0033] 抗菌肽QHA前體的編碼基因核苷酸序列表為：序列長度為732個堿基，序列類型： 核酸，鏈數(shù)：單鏈，拓撲學(xué)：直鏈狀，序列種類：cDNA，來源：青環(huán)海蛇毒腺。
[0034] 實施例2
[0035] 抗菌肽QHA的化學(xué)合成：
[0036] I、抗菌肽QHA的化學(xué)合成方法：根據(jù)基因推導(dǎo)的成熟肽氨基酸序列，用自動多肽 合成儀（433A, Applied Biosystems)合成其全序列，通過HPLC反相柱層析脫鹽。
[0037] II、分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-T0F)。
[0038] III、純化的抗菌肽QHA用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用基 質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸 測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0039] 抗菌肽QHA是抗菌肽QHA編碼基因編碼的一種直鏈多肽，含有三十個氨基酸殘基， 分子量3628. 5Da，等電點12. 61。其SEQ ID NO. 1氨基酸序列為：
[0040] LyslPhe2Phe3Lys4Arg 5Leu6Leu7Lys8Ser9Val i0ArgllArgi2Alai3Vali4Lys 15Lys16Phe17Arg1 8Lys19Lys2°Pro21Arg22Leu 23Ile24Gly25Leu26Ser27Thr 28Leu29Leu30。
[0041] 實施例3
[0042] 抗菌肽QHA抗菌活性檢測：
[0043] (1)分別挑取保存于斜面上的試驗菌株均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基(購自青島海博 生物技術(shù)有限公司）平板上，將經(jīng)過滅菌的〇. 5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加溶解 于滅菌去離子水的2mg/ml的抗菌肽QHA樣品溶液10 μ 1，于37°C倒置培養(yǎng)18 - 20小時， 觀察抑菌圈形成與否。若樣品具有抗菌活性，則會在濾紙片周圍形成清晰透明的抑菌圈，抑 菌圈越大表明樣品抗菌活性越強。
[0044] (2)抗菌膚 QHA 最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration)測定（2 倍 稀釋法）：
[0045] 選擇上步實驗中具有抑菌圈的菌株進行MIC測定實驗。試驗菌株接種到MH液體 培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司）中，37°C振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長期，而后用新鮮MH液體 培養(yǎng)基將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的培養(yǎng)液稀釋到2X 105cfu/ml待用。
[0046] 在無菌96孔板各孔中預(yù)先加入100 μ I MH液體培養(yǎng)基，然后在第一孔中加入 100 μ 1用MH液體培養(yǎng)基稀釋到一定濃度的經(jīng)0. 22mm孔濾膜過濾的的抗菌肽QHA樣品溶 液，混勻后取100 μ 1加入第2孔，依次倍比稀釋(參見表1 )，自第9孔吸出100 μ 1棄去，第 10孔系對照管。
[0047] 表· 1稀釋方法

【權(quán)利要求】
1. 一種天然抗菌肽QHA，其特征在于：天然抗菌肽QHA由30個氨基酸殘基組成，為直鏈 多肽，分子量3628. 5Da，等電點12. 61，其氨基酸序列由SEQ ID NO. 1所示。
2. 按權(quán)利要求1所述抗菌肽QHA，其特征在于：所述編碼抗菌肽QHA的前體的基因自5' 端至3'端的堿基序列由SEQ ID NO. 2所示。
3. 按權(quán)利要求3所述的抗菌肽QHA，其特征在于： 所述SEQ ID NO. 2所示堿基序列可應(yīng)用于多肽重組表達，轉(zhuǎn)基因動物、植物、植物部分、 動物細胞或植物細胞中。
4. 一種按權(quán)利要求1所述的抗菌肽QHA的應(yīng)用，其特征在于：所述抗菌肽QHA可制備 抗菌藥物、抑制細菌生長藥物、防腐劑、動物飼料或化妝品前體。
5. 按權(quán)利要求4所述的抗菌肽QHA的應(yīng)用，其特征在于：所述抗菌肽QHA可用于制備 抗革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌或真菌的藥物或組合物。
【文檔編號】A61K8/64GK104497119SQ201310660578
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】王義鵬 申請人:王義鵬