一種牛蛙抗菌肽crc及其改造體、編碼核酸和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛蛙抗菌肽CRC，其特征在于：所述牛蛙抗菌肽CRC由28個(gè)氨基酸殘基組成，分子量3282.2Da，等電點(diǎn)10.32，其氨基酸序列為：Lys1Lys2Cys3Lys4Phe5Phe6Cys7Lys8Val9Lys10Lys11Lys12Ile13Lys14Ser15Ile16Gly17Phe18Gln19Ile20Pro21Ile22Val23Ser24Ile25Pro26Phe27Lys28，其中Cys3和Cys7之間形成一對(duì)分子內(nèi)二硫鍵。本發(fā)明中的牛蛙抗菌肽CRC及其改造體多肽具有分子量小、人工合成簡(jiǎn)單、抗菌作用廣譜高效、真核細(xì)胞毒性和溶血活性低、鹽耐受性、熱耐受性和熱穩(wěn)定性好，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種牛蛙抗菌肽CRC及其改造體、編碼核酸和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種牛蛙抗菌肽CRC及其改造體、編碼核酸和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]近年來，隨著傳統(tǒng)抗生素的大規(guī)模和不恰當(dāng)使用，微生物對(duì)傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生了越來越強(qiáng)的耐受性。醫(yī)學(xué)界對(duì)微生物耐藥性的應(yīng)對(duì)手段是使用對(duì)耐藥微生物尚未使用過的新的或者替代性的抗生素。這就需要持續(xù)開發(fā)新的抗微生物劑?？咕氖且环N小分子多肽，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒和原蟲等均具有殺滅作用?？咕木哂蟹肿恿啃?、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、殺菌活性強(qiáng)、殺菌機(jī)制獨(dú)特，不易引起耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，因此具有很大的開發(fā)應(yīng)用前景。目前已從不同的無尾目動(dòng)物皮膚中分離到300多條不同的抗菌肽，并且其數(shù)目還在增加。本發(fā)明是提供一種從牛蛙體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的具有廣譜高效的抗菌活性、極低的細(xì)胞毒性和溶血活性的新抗菌肽CRC，以及編碼這條多肽的核酸序列，并提供一批具有抗菌活性的CRC改造體多肽，以及編碼這些多肽的多核苷酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的是:提供一種從牛蛙體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的具有廣譜高效的抗菌活性、極低的細(xì)胞毒性和溶血活性的新抗菌肽CRC，以及編碼這條多肽的核酸序列，并提供一批具有抗菌活性的CRC改造體多肽，以及編碼這些多肽的多核苷酸。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種牛蛙抗菌肽CRC，其特征在于:所述牛蛙抗菌肽CRC由28個(gè)氨基酸殘基組成，分子量3282.2Da，等電點(diǎn)10.32，其氨基酸序列為:
[0005]LyslLys2Cys3Lys4Phe5Phe6Cys7Lys8Val9Lysi0LysllLysi2Ilei3Lysi4Ser15Ile16Gly17Phe18Gln19I Ie20Pro2111e22Val23Ser24I Ie25Pro26Phe27Lys28,其中 Cys3 和 Cys7 之間形成一對(duì)分子內(nèi)二硫鍵。
[0006]一種基于上述牛蛙抗菌肽CRC的具有抗微生物活性的改造體多肽，以牛蛙抗菌肽CRC的氨基酸序列為模板，通過設(shè)計(jì)改造獲得的具有抗微生物活性的改造體多肽:包含以下氨基酸序列:Xl-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xll-X12-X13-X14-X15-1le16Gly17Phe18Gln19I I e20Pro21I I e22Val23Ser24Il e25Pro26Phe27Lys28，
[0007]其中，
[0008]Xl=Lys 或 Arg ；
[0009]X2=Lys, Phe, He, Trp, Ser, Ala, Thr, Val, Leu 或 Gly;
[0010]X3=Cys, Phe, He, Trp, Ser, Ala, Thr, Tyr, Val, Leu 或 Gly ；
[0011 ] X4=Lys 或 Arg ；
[0012]X5=Phe, Ala, Gly 或 Val;
[0013]X6=Phe, lie, Trp, Val 或 Leu;
[0014]X7=Cys, Ser, Lys, Arg, Ala 或 Gly ；[0015]X8=Lys 或 Arg ；
[0016]X9=Val, Phej Trpj Leu 或 lie;
[0017]XlO=Valj Phej Trpj Leu 或 lie;
[0018]Xll=Lys, Arg 或 Gly ；
[0019]X12=Lys, Arg 或 Gly ；
[0020]X13=Phe，He, Trpj Serj Ala, Thr，Val, Leu 或 lie ；
[0021]X14=Gly, Lysj Argj Ala 或 Ser ；
[0022]X15=Ser, Lysj Argj Gly 或 Ala。
[0023]優(yōu)選的:優(yōu)選所述X2 = Phe，Ile，Trp，Leu 或 Gly;X3=Cys, Phej He, Ala，Trpj Leuj Val 或 Gly ；X7=Cys, Lys 或 Arg ;X13=Phe，Trpj Leu 或 Ile ；X15=Lys或Arg。其中所述氨基酸序列至少包含SEQ IDN0:2的I到15位氨基酸，且片段長(zhǎng)度不低于15個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明的多肽的氨基酸可以是D或L-氨基酸。氨基酸可以是天然的或合成的。也包括已知的異構(gòu)體(結(jié)構(gòu)的、立體的、構(gòu)象的和構(gòu)型的)和上述氨基酸的結(jié)構(gòu)類似物，和天然(翻譯后修飾)或化學(xué)修飾的氨基酸，所述天然或化學(xué)修飾包括但不僅限于磷酸化、糖基化、羥基化和/或酰胺化。與牛蛙抗菌肽CRC相比，優(yōu)選的改造體多肽具有分子量更小、合成成本更低、穩(wěn)定性更高、毒性更低等優(yōu)勢(shì)。
[0024]一種牛蛙抗菌肽CRC的編碼基因，該牛蛙抗菌肽CRC前體的編碼基因由677個(gè)核苷酸組成，其5’端至3’端序列為SEQIDN0:1所示的核苷酸序列:
[0025]atgaagatctggcagtgtgtggtatggctctgtgcgatcacattggaggtggctcactct 60
[0026]cagtctccggatcgggaaggatggatcagagaggccctggatctctacaaccagagagaa 120
[0027]gatggagagttcctcttcaaactcctgtctgagctccccggccccctcctggaggaggag 180
[0028]ggagactctccagcaatcggtttcttgataaaggagacggactgccccaaatctgaggag 240
[0029]attgacttggagcgatgtgactacagcaaagacggggaggtgaaggtctgcgctctgcac 300
[0030]caggaggaacaggatgtgaagtgcgtcagcctgaccgagaattcacgtagcaagcgttcc 360
[0031]agcaaaaagaaaaagtgcaaattcttctgcaaagtgaaaaagaagatcaaatctatcggc 420
[0032]ttccagatccctatcgtcagtatcccgtttaaatgatacgtcgcgcccgccaacgctccc 480
[0033]cccgtgtgcaccgcgcaatctccgcttcatcagaaatattctctatcctggatacattgt 540
[0034]atactgtgtgtgtgtaattgtatcggatgatctgcagatgacgctttttatttgcttcca 600
[0035]acatttctgcagatgaatccaaataaaattatatcccgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 660
[0036]
[0037]編碼牛蛙抗菌肽CRC為第370-453位核苷酸。
[0038]一種用于抗菌的組合物，其中該組合物包含一種或多種牛蛙抗菌肽CRC或改造體多肽。含有牛蛙抗菌肽CRC或改造體多肽的組合物可以用作藥物、殺菌劑、抗微生物制劑、動(dòng)物飼料、化妝品和防腐保鮮等領(lǐng)域。本發(fā)明的牛蛙抗菌肽CRC的編碼基因，可以應(yīng)用于多肽重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、植物、植物部分或植物細(xì)胞中。
[0039]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
[0040]本發(fā)明中的牛蛙抗菌肽CRC及其改造體多肽具有分子量小、人工合成簡(jiǎn)單、抗菌作用廣譜高效、真核細(xì)胞毒性和溶血活性低、鹽耐受性、熱耐受性和熱穩(wěn)定性好，具有廣泛的應(yīng)用前景。【具體實(shí)施方式】
[0041]實(shí)施例1:
[0042]牛蛙抗菌肽CRC編碼基因克隆:
[0043]1)牛蛙肺總RNA提取:
[0044]①取200mg牛蛙肺組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到EP管中，加入Iml總RNA提取緩沖液(Trizol，美國(guó)Life公司產(chǎn)品)，充分混勻，而后于4°C，12000rpm離心 IOmin0
[0045]②離心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4°C，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。
[0046]③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4°C，12000rpm離心10分鐘，收集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為牛蛙肺總RNA。
[0047]2)牛蛙肺 cDNA 二鏈合成:采用 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer TMDirectionaIcDNALibraryConstructionKit 合成。
[0048](I) cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄):
[0049]①RNase-free的PCR管中加入I μ I牛蛙肺總RNA、I μ 13 ’端一鏈合成引物(3，In-FusionSMARTerCDSPrimer)和 2.5 μ I RNase-free 水使總體積達(dá)到 4.5 μ 1，混勻后短暫離心(2000rpm，30s)，離心后于72°C保溫3分鐘；保溫后再將離心管在42°C孵育2分鐘。
[0050]②在上述離心管中加入以下試劑(均為CL0NTECH公司In-Fusion SMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit 建庫試劑盒中配備)，2.0 μ 15 X 第一鏈緩沖液、0.25 μ IlOOmMDTTU.0 μ IlOmMdNTP Mix、1.0 μ ISMARTerVOligonucleotide、0.25 μ IRNaseInhibitor 和 1.0 μ ISMARTScribeReverseTranscriptase 反轉(zhuǎn)錄酶，混合離心管中試劑并短暫離心(2000rpm,30s),在42°C保溫90min,然后68°C保溫lOmin。保溫處理后將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2 μ I所合成的cDNA第一鏈備用。
[0051](2)采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈(所用試劑均為CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibrary ConstructionKit 建庫試劑盒中配備)
[0052]①將2 μ IcDNA 第一鏈(mRNA 反轉(zhuǎn)錄)、80 μ I 去離子水、10 μ IlOX Advantage2PCR緩沖液、2μ 150XdNTP混合物、2μ 15’PCR引物、2 μ 1CDSIII/3’PCR弓丨物以及2μ 150 X Advantage2Polymerase Mix 在 95°C預(yù)熱的 PCR 管中進(jìn)行混合。
[0053]②在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增:
[0054]95°C，Imin ; 18 個(gè)循環(huán):95°C，15sec, 65°C，30sec, 68°C，6min。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈一 80°C保存。
[0055](3)牛蛙抗菌肽CRC編碼基因克隆:
[0056]人工設(shè)計(jì)合成正向引物5 ’ -CRC: 5，-GGATGAAGATCTGGCAGTGTGTG-3，，反向引物為 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTerTMDirectionalcDNALibraryConstructionKit 中的3 ’ -PCR引物，其序列為5 ’ -CGGGGTACGATGAGACACCAT-3 ’。PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行:95°C 4min,95°C 30sec，58°C 30sec和72°C lmin，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進(jìn)行目的片段回收。將回收的目的片段連接到PMD19-T載體(Takara，大連)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。涂板并進(jìn)行氨芐青霉素篩選，挑取單菌落用M13引物PCR檢測(cè)插入片段大小。挑取陽性菌落，搖菌提取質(zhì)粒，使用AppliedBiosystemsDNAsequencer, modelABIPRISM377 進(jìn)行核苷酸測(cè)序。
[0057]測(cè)定結(jié)果:
[0058]編碼牛蛙抗菌肽CRC前體的基因自5’端至3’端序列為:
[0059]atgaagatctggcagtgtgtggtatggctctgtgcgatcacattggaggtggctcactct 60
[0060]cagtctccggatcgggaaggatggatcagagaggccctggatctctacaaccagagagaa 120
[0061]gatggagagttcctcttcaaactcctgtctgagctccccggccccctcctggaggaggag 180
[0062]ggagactctccagcaatcggtttcttgataaaggagacggactgccccaaatctgaggag 240
[0063]attgacttggagcgatgtgactacagcaaagacggggaggtgaaggtctgcgctctgcac 300
[0064]caggaggaacaggatgtgaagtgcgtcagcctgaccgagaattcacgtagcaagcgttcc 360
[0065]agcaaaaagaaaaagtgcaaattcttctgcaaagtgaaaaagaagatcaaatctatcggc 420
[0066]ttccagatccctatcgtcagtatcccgtttaaatgatacgtcgcgcccgccaacgctccc 480
[0067]cccgtgtgcaccgcgcaatctccgcttcatcagaaatattctctatcctggatacattgt 540
[0068]atactgtgtgt`gtgtaattgtatcggatgatctgcagatgacgctttttatttgcttcca 600
[0069]acatttctgcagatgaatccaaataaaattatatcccgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 660
[0070]
[0071]牛蛙抗菌肽CRC前體的編碼基因核苷酸序列表為:序列長(zhǎng)度為677個(gè)堿基，序列類型:核酸，鏈數(shù):單鏈，拓?fù)鋵W(xué):直鏈狀，序列種類:cDNA，來源:牛蛙肺。
[0072]實(shí)施例2
[0073]牛蛙抗菌肽CRC的制備:
[0074](I)、牛蛙抗菌肽CRC的化學(xué)合成方法:根據(jù)編碼基因推導(dǎo)的氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(433A, AppliedBiosystems)合成其全序列,通過HPLC反相柱層析脫鹽純化。
[0075](2)、分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F)。
[0076](3)、純化的抗菌肽CRC用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0077]牛蛙抗菌肽CRC是基因編碼的一種小分子多肽，由28個(gè)氨基酸殘基組成，分子量3282.2Da，等電點(diǎn)10.32。牛蛙抗菌肽CRC全序列為:
[0078]LyslLys2Cys3Lys4Phe5Phe6Cys7Lys8Val9Lysl0LysllLysl2Ilel3Lysl4Serl5Ilel6Glyl7Phel8Glnl9Ile20Pro21Ile22Val23Ser24Ile25Pro26Phe27Lys28,其中 Cys3 和Cys7之間形成一對(duì)分子內(nèi)二硫鍵。
[0079]實(shí)施例3
[0080]牛蛙抗菌肽CRC抗菌活性檢測(cè):
[0081]( I)分別挑取保存于斜面上的試驗(yàn)菌株均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術(shù)有限公司)平板上，將經(jīng)過滅菌的0.5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加溶解于滅菌去離子水的2mg/ml的牛蛙抗菌肽CRC樣品溶液10 μ 1，于37°C倒置培養(yǎng)18 — 20小時(shí)，觀察抑菌圈形成與否。若樣品具有抗菌活性，則會(huì)在濾紙片周圍形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明樣品抗菌活性越強(qiáng)。[0082](2)牛娃抗菌妝 CRC 最小抑菌濃度(Minimumlnhibitory Concentration)測(cè)定(2倍稀釋法):
[0083]選擇上步實(shí)驗(yàn)中具有抑菌圈的菌株進(jìn)行MIC測(cè)定實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)菌株接種到MH液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)中，37°C振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而后用新鮮MH液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)液稀釋到2X105cfu/ml待用。
[0084]在無菌96孔板各孔中預(yù)先加入ΙΟΟμ IMH液體培養(yǎng)基，然后在第一孔中加入100 μ I用MH液體培養(yǎng)基稀釋到一定濃度的經(jīng)0.22 μ m孔濾膜過濾的的牛蛙抗菌肽CRC樣品溶液，混勻后取100 μ I加入第2孔，依次倍比稀釋(參見表1)，自第9孔吸出100 μ I棄去，第10孔系對(duì)照管。
[0085]表.1稀釋方法
【權(quán)利要求】
1.一種牛蛙抗菌肽CRC，其特征在于:所述牛蛙抗菌肽CRC由28個(gè)氨基酸殘基組成，分子量3282.2Da，等電點(diǎn)10.32，其氨基酸序列為:
LyslLys2Cys3Lys4Phe5Phe6Cys7Lys8Val9Lysi0LysllLysi2Ilei3LysMseri5Ile16Gly17Phe18Gln19Ile2c1Pro21Ile22Val23Ser24Ile25Pro26Phe27Lys28,其中 Cys3 和 Cys7 之間形成一對(duì)分子內(nèi)二硫鍵。
2.一種基于權(quán)利要求1所述的牛蛙抗菌肽CRC的具有抗微生物活性的改造體多肽，其特征在于:包含以下氨基酸序列:X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-1le16Gly17Phe18Gln19Ile20Pro21Ile22Val23Ser24Ile25Pro26Phe27Lys28, 其中，
Xl=Lys 或 Arg ；
X2=Lys, Phe, He, Trp, Ser, Ala, Thr, Val, Leu 或 Gly;
X3=Cys, Phe, He, Trp, Ser, Ala, Thr, Tyr, Val, Leu 或 Gly ；
X4=Lys 或 Arg ；
X5=Phe, Ala, Gly 或 Val;
X6=Phe, He, Trp, Val 或 Leu;
X7=Cys, Ser, Lys, Arg, Ala 或 Gly ；
X8=Lys 或 Arg ；
X9=Val, Phe, Trp, Leu 或 lie;
XlO=Val, Phe, Trp, Leu 或 lie;
Xll=Lys, Arg 或 Gly ；
X12=Lys, Arg 或 Gly ；
X13=Phe, He, Trp, Ser, Ala, Thr, Val, Leu 或 He ；
X14=Gly, Lys, Arg, Ala 或 Ser ；
X15=Ser, Lys, Arg, Gly 或 Ala。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗微生物活性的改造體多肽，其特征在于:優(yōu)選所述X2=Phe, He, Trp, Leu 或 Gly ；X3=Cys, Phe, He, Ala, Trp, Leu, Val 或 Gly ；X7=Cys, Lys 或Arg ；X13=Phe, Trp, Leu 或 lie ；X15=Lys 或 Arg0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有抗微生物活性的改造體多肽，其特征在于:所述氨基酸為D或L-氨基酸。
5.一種編碼如權(quán)利要求1所述的牛蛙抗菌肽CRC的編碼基因，其序列為SEQIDNO:1所示序列的第370-453位核苷酸。
6.一種用于抗菌 的組合物，其中該組合物包含一種或多種權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽。
7.通過施用包含一種或多種權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽的組合物來防腐保鮮的方法。
8.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的肽，在制備抗菌、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物、防腐劑、動(dòng)物飼料以及化妝品中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求5中牛蛙抗菌肽CRC的編碼基因，在多肽重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、植物、植物部分、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK103641903SQ201310616751
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】王義鵬, 于海寧, 凌桂英, 高久香, 衛(wèi)林 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)