適于經(jīng)皮藥物和疫苗遞送的機(jī)械增強(qiáng)的快速溶解微針的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開具有機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)的生物相容性的可溶解微針結(jié)構(gòu)。更具體而言，本發(fā)明涉及含有納米材料的微針。本發(fā)明還公開用于制備這種微針結(jié)構(gòu)的方法，以及利用它們將藥物或生物分子遞送到對(duì)象的皮膚或上皮細(xì)胞內(nèi)或皮膚或上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核內(nèi)的方法?！緦＠f明】適于經(jīng)皮藥物和疫苗遞送的機(jī)械增強(qiáng)的快速溶解微針【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本公開通常涉及具有增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度的生物相容性的可溶解微針結(jié)構(gòu)。更具體地，本發(fā)明涉及包含具有良好分散的納米材料的微針?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]微針是微米級(jí)尺寸的微小突起，并具有將藥物、疫苗和其它生物分子遞送到皮膚的能力。該經(jīng)皮遞送平臺(tái)具有與通過針頭和注射器進(jìn)行的傳統(tǒng)皮下肌內(nèi)注射相比具有優(yōu)于其的許多優(yōu)點(diǎn)。首先，沒有或存在最小程度的疼痛、交叉感染和針頭扎傷。其次，微針可設(shè)計(jì)成針對(duì)皮膚的具體層。第三，具有自我給藥的潛力。最后但并非是最不重要的，當(dāng)存在可過早代謝藥物的肝臟顯著首過效應(yīng)時(shí)使用微針。微針陣列通常由硅、金屬和聚合物制成。其中，聚合物微針陣列越來越具有吸引力，因?yàn)轭A(yù)計(jì)它們大量生產(chǎn)時(shí)比硅或金屬陣列成本更低以及在應(yīng)用過程中更安全。當(dāng)使用可溶解的聚合物時(shí)，藥物和生物分子可混入到微針本身內(nèi)。在應(yīng)用過程中，聚合物結(jié)構(gòu)在皮膚內(nèi)快速溶解，從而釋放藥物和生物分子，所以不存在帶尖頭的廢物。[0003]盡管它們具有前景廣闊的特征，但是可溶解的聚合物通常具有相對(duì)較弱的機(jī)械性能。需要將生物相容性、耐用的機(jī)械性能以及快速溶解速率的組合嚴(yán)重地限制了聚合物的選擇性。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羧甲基纖維素鈉鹽(CMC)通常被報(bào)道適于在可溶解的聚合物微針中使用。例如，PVP微針要么在紫外線條件(使用100瓦的紫外線燈)下使得單體進(jìn)行原位聚合或在80°c下加熱24小時(shí)賴制備。這些苛刻條件會(huì)嚴(yán)重限制對(duì)溫度或紫外線敏感的藥物和生物分子的混入。另一方面，CMC微針可在室溫下制備，但CMC具有較弱的機(jī)械性能。例如，CMC的彈性模量只有約lGPa。據(jù)預(yù)計(jì)生物可吸收性的聚合物微針的尺寸需要相對(duì)較大以便可靠地刺穿人體皮膚。這顯然將限制陣列上的微針密度。然而，近期研究表明較小(基部直徑或?qū)挾取?0微米)和密集排布的微針(每平方厘米超過10，000個(gè)微針)與較大的稀疏排布的微針相比會(huì)導(dǎo)致顯著增強(qiáng)疫苗功效。此外，較小微針在制備過程中會(huì)易于變干以及在應(yīng)用過程中會(huì)在皮膚中快速溶解。因此，改進(jìn)可溶解聚合物微針的機(jī)械性能會(huì)在藥物功效、設(shè)計(jì)靈活性、易于制備和在皮膚中快速溶解方面是有益的。[0004]因此，需要改進(jìn)適于經(jīng)皮遞送的可溶解微針陣列的機(jī)械特性?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]在第一方面，公開一種微針結(jié)構(gòu)，其包括多個(gè)微針，其中每個(gè)微針包括至少一種可溶解聚合物和納米材料，其中所述納米材料良好地分散于每一整個(gè)微針中。[0006]在第二方面，公開用于制備微針結(jié)構(gòu)的一種方法。該方法的步驟包括:a)形成包括至少一種可溶解聚合物和至少一種納米材料的復(fù)合溶液，其中所述納米材料良好地分散于整個(gè)復(fù)合溶液中山)將復(fù)合溶液添加到微針結(jié)構(gòu)模具的表面上；c)迫使復(fù)合溶液進(jìn)入到微針結(jié)構(gòu)模具空腔內(nèi)；d)干燥復(fù)合溶液以便形成微針結(jié)構(gòu)；以及e)將微針結(jié)構(gòu)從微針結(jié)構(gòu)模具取出。[0007]在第三方面，公開用于制備機(jī)械強(qiáng)度增加的微針結(jié)構(gòu)的一種方法。該方法的步驟包括:a)形成包括至少一種可溶解聚合物和至少一種納米材料的復(fù)合溶液，其中所述納米材料良好地分散于整個(gè)復(fù)合溶液中山)將復(fù)合溶液添加到微針結(jié)構(gòu)模具的表面上；c)迫使復(fù)合溶液進(jìn)入到微針結(jié)構(gòu)模具空腔內(nèi)；d)干燥復(fù)合溶液以便形成微針結(jié)構(gòu)；以及e)將微針結(jié)構(gòu)從微針結(jié)構(gòu)模具取出。[0008]在第四方面，公開用于制備微針結(jié)構(gòu)的一種方法。該方法的步驟包括:a)將至少一種藥物或生物分子與至少一種納米材料組合以便形成納米藥物；b)形成包括至少一種可溶解聚合物和納米藥物的復(fù)合溶液，其中所述納米藥物良好地分散于整個(gè)所述復(fù)合溶液中；c)將復(fù)合溶液添加到微針結(jié)構(gòu)模具的表面上；d)迫使復(fù)合溶液進(jìn)入到微針結(jié)構(gòu)模具空腔內(nèi)；e)干燥復(fù)合溶液以便形成微針結(jié)構(gòu)；以及f)將微針結(jié)構(gòu)從微針結(jié)構(gòu)模具取出。[0009]在第五方面，公開用于制備機(jī)械強(qiáng)度增加的微針結(jié)構(gòu)的一種方法。該方法的步驟包括:a)將至少一種藥物或生物分子與至少一種納米材料組合以便形成納米藥物；b)形成包括至少一種可溶解聚合物和納米藥物的復(fù)合溶液，其中所述納米藥物良好地分散于整個(gè)所述復(fù)合溶液中；c)將復(fù)合溶液添加到微針結(jié)構(gòu)模具的表面上；d)迫使復(fù)合溶液進(jìn)入到微針結(jié)構(gòu)模具空腔內(nèi)；e)干燥復(fù)合溶液以便形成微針結(jié)構(gòu)；以及f)將微針結(jié)構(gòu)從微針結(jié)構(gòu)模具取出。[0010]在第六方面，公開用于經(jīng)皮遞送藥物或生物分子或用于將藥物或生物分子遞送到上皮細(xì)胞的一種方法。該方法的步驟包括將生物相容性的可溶解微針結(jié)構(gòu)施加到對(duì)象的皮膚或上皮細(xì)胞。微針結(jié)構(gòu)包括多個(gè)微針。每個(gè)微針包括至少一種可溶解聚合物、藥物或生物分子和納米材料，其中所述納米材料良好地分散于每一整個(gè)微針中。應(yīng)用(或施加)應(yīng)該是如此的，以至于微針結(jié)構(gòu)的微針穿透皮膚或上皮細(xì)胞以及在微針溶解后釋放藥物或生物分子。在一些實(shí)施例中，在穿透皮膚或上皮細(xì)胞的五分鐘內(nèi)大致發(fā)生微針的溶解。[0011]在第七方面，公開用于將藥物或生物分子遞送到皮膚或上皮細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核的一種方法。該方法`的步驟包括將生物相容性的可溶解微針結(jié)構(gòu)施加到對(duì)象的皮膚或上皮細(xì)胞。微針結(jié)構(gòu)包括多個(gè)微針。每個(gè)微針包括至少一種可溶解聚合物、藥物或生物分子和納米材料，其中所述納米材料良好地分散于每一整個(gè)微針中。應(yīng)用或施加應(yīng)該是如此的，以至于微針結(jié)構(gòu)的微針穿透皮膚或上皮細(xì)胞以及在微針溶解后釋放藥物或生物分子。在一些實(shí)施例中，納米材料包含作為納米藥物的藥物或生物分子以便藥物或生物分子遞送。在一些實(shí)施例中，在穿透皮膚或上皮細(xì)胞的五分鐘內(nèi)大致發(fā)生微針的溶解。[0012]從結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明各個(gè)方面的以下詳細(xì)描述將明了本公開的這些和其它目的、特征和優(yōu)勢(shì)?！緦＠綀D】【附圖說明】[0013]圖1示出用于制備可溶解納米復(fù)合材料微針結(jié)構(gòu)的一個(gè)實(shí)施例的步驟。[0014]圖2示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例納米粒子的各種測(cè)量值和特性。a)良好分散的納米粒子的高分辨率透射電子顯微鏡圖像。b)包含納米粒子的懸浮液的粒徑分布。c)在不含水和緩沖劑溶液中的納米粒子的Zeta電位。d)純凈納米粒子的X射線衍射圖案。[0015]圖3示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例納米粒子的各種測(cè)量值和特性。a)通過納米壓痕導(dǎo)致的負(fù)載-位移曲線。b)具有不同納米粒子濃度的CMC聚合物薄膜的彈性模量和c)硬度。[0016]圖4不出掃描電子顯微鏡圖像。圖4a和圖4b是娃微針陽模的代表性SEM圖像，所述陽模用于制備適于聚合物微針制備的PDMS陰模。圖4c和圖4d示出根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的可溶解聚合物微針的典型SEM圖像。[0017]圖5示出納米粒子分別相對(duì)于a)海拉(HeLa)細(xì)胞系和d)A549細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。[0018]圖6示出微針應(yīng)用5分鐘之后的皮膚反射共聚焦顯微鏡圖像:a)應(yīng)用納米復(fù)合材料微針之后的豬皮山)控制微針應(yīng)用之后的豬皮；c)應(yīng)用納米復(fù)合材料微針之后的人體皮膚；以及d)控制微針應(yīng)用之后的人體皮膚。[0019]圖7示出微針應(yīng)用5分鐘之后的皮膚激光掃描共聚焦顯微鏡圖像:a)和b)是應(yīng)用納米復(fù)合材料微針之后的豬皮；c)和d)是控制微針應(yīng)用之后的豬皮；e)和f)是納米復(fù)合材料微針應(yīng)用之后的人體皮膚；以及g)和h)是控制微針應(yīng)用之后的人體皮膚。[0020]圖8示出納米復(fù)合材料微針的合并后的熒光和反射共聚焦顯微鏡圖像:a)應(yīng)用之前；b)應(yīng)用到豬皮之后的I分鐘；c)應(yīng)用到豬皮之后的2分鐘以及d)應(yīng)用到豬皮之后的5分鐘。【具體實(shí)施方式】[0021]在第一方面，公開包括多個(gè)微針的微針結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)微針包括至少一種可溶解聚合物和納米材料，其中所述納米材料分散于每一整個(gè)微針中。[0022]微針結(jié)構(gòu)包括由基部連接的多個(gè)微針?；坑糜阱^固微針，允許微針從微針結(jié)構(gòu)的模具中移除，并且作為一個(gè)單元應(yīng)用到對(duì)象上。圖1中可以看出微針結(jié)構(gòu)的這樣的一個(gè)實(shí)施例。[0023]納米材料可以是任何材料，其中材料的至少一個(gè)維度等于或小于100納米，也就是從I納米至100納米。在某些實(shí)施`例中，納米材料的至少一個(gè)表面上具有正電荷。在一些實(shí)施例中，納米材料包括納米粒子。納米材料可包括納米粒子、納米薄片、納米纖維、納米線、納米管或它們的組合。[0024]在一些實(shí)施例中，納米材料包括層狀的雙金屬氫氧化物(LDH)納米粒子。LDH納米粒子具有較高的生物相容性，較高的高寬比(橫向厚度超過厚度)，而且成本低。這些LDH納米粒子可包括鎂、鋁、鐵、鈷、鋅、鈣或錳中的至少一種。即，可以使用鎂、鋁、鐵、鈷、鋅、鈣或錳的任何一種或組合。例如，在一些實(shí)施例中，LDH納米粒子包括鎂和鋁。在一些實(shí)施例中，LDH納米粒子包括鋅和鋁。在一些實(shí)施例中，LDH納米粒子包括鈣和鋁。在一些實(shí)施例中，LDH納米粒子包括鎳和鋁。在一些實(shí)施例中，LDH納米粒子包括鋅和鉻。在一些實(shí)施例中，LDH納米粒子包括鋅和鐵。在一些實(shí)施例中，LDH納米粒子包括鎂和鐵。在一些實(shí)施例中的LDH納米粒子包括鈣和鐵。在一些實(shí)施例中，LDH納米粒子包括鋅和鈷。在一些實(shí)施例中，LDH納米粒子包括鎂、鈣和鐵。在一些實(shí)施例中，LDH納米粒子包括鎂、鈣和鋁。[0025]在一些實(shí)施例中，聚合物是可生物降解的。其中發(fā)生和中降解的環(huán)境將在對(duì)象的皮膚或上皮細(xì)胞內(nèi)。所用的納米材料增加可溶解聚合物的機(jī)械強(qiáng)度，而不損害聚合物在皮膚或上皮細(xì)胞內(nèi)的溶解速度。在一些實(shí)施例中，包括納米材料的微針結(jié)構(gòu)的溶解速率在不包括納米材料的相對(duì)照微針結(jié)構(gòu)的溶解速率的25%內(nèi)。作為一個(gè)非限制性的實(shí)例，包括CMC,LDH納米粒子和藥物的微針結(jié)構(gòu)具有的在皮膚或上皮細(xì)胞內(nèi)的溶解速率與僅包括CMC和藥物(即，沒有LDH納米粒子)的微針結(jié)構(gòu)的溶解速率相比更快或更慢不會(huì)超過25%。在一些實(shí)施例中，包含納米材料的微針結(jié)構(gòu)的溶解速率在不包含納米材料的相對(duì)照微針結(jié)構(gòu)的溶解速率的10%內(nèi)。在一些實(shí)施例中，包含納米材料的微針結(jié)構(gòu)的溶解速率在不包含納米材料的相對(duì)照微針結(jié)構(gòu)的溶解速率的I%內(nèi)。[0026]在一些實(shí)施例中，納米材料具有與聚合物的相互作用，例如共價(jià)鍵合、靜電相互作用和/或形成氫鍵。該相互作用有助于使得納米材料良好地分布于聚合物中。在一些實(shí)施例中，聚合物包含帶有負(fù)電荷的官能團(tuán)。當(dāng)聚合物在溶液中帶有負(fù)電荷時(shí)，其可結(jié)合到至少一個(gè)表面上具有正電荷的納米材料內(nèi)層中。這可允許納米材料均勻地分散于整個(gè)聚合物中。納米材料的該一致性的分散導(dǎo)致微針結(jié)構(gòu)機(jī)械性能的增強(qiáng)。在一些實(shí)施例中，聚合物是羧甲基纖維素鈉(CMC)。[0027]相對(duì)于工程塑料而言，納米材料增強(qiáng)的聚合物諸如LDH增強(qiáng)的CMC非常快速地溶解于水，而工程塑料通常不溶于水，或需要數(shù)月到數(shù)年才能溶解。聚合物和納米材料的組合具有與不添加納米材料的聚合物相比的較高彈性模量。在一些實(shí)施例中，添加納米材料增加的彈性模量超過純粹聚合物彈性模量的50%和500%之間。在一些實(shí)施例中，添加納米材料增加的彈性模量超過純粹聚合物彈性模量的100%至400%之間。在一些實(shí)施例中，添加納米材料增加的彈性模量超過純粹聚合物彈性模量的150%和400%之間。在一些實(shí)施例中，添加納米材料增加的彈性模量超過純粹聚合物彈性模量的200%和400%之間。在一些實(shí)施例中，添加納米材料增加的彈性模量超過純粹聚合物彈性模量的250%和350%之間。[0028]用于形成機(jī)械強(qiáng)度增加的微針結(jié)構(gòu)的復(fù)合溶液包括至少一種可溶解聚合物和至少一種納米材料。在一些實(shí)施例中，層狀雙金屬氫氧化物納米粒子以相對(duì)于復(fù)合溶液中所述聚合物質(zhì)量的0.5%(重量)和20%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，層狀雙金屬氫氧化物納米粒子以相對(duì)于復(fù)合溶液中所述聚合物質(zhì)量的0.5%(重量)和15%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，層狀雙金屬氫氧化物納米粒子以相對(duì)于復(fù)合溶液中所述聚合物質(zhì)量的1%(重量)和10%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，層狀雙金屬氫氧化物納米粒子以相對(duì)于復(fù)合溶液中所述聚合物質(zhì)量的2%(重量)和15%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，層狀雙金屬氫氧化物納米粒子以相對(duì)于復(fù)合溶液中所述聚合物質(zhì)量的2%(重量)和10%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，層狀雙金屬氫氧化物納米粒子以相對(duì)于復(fù)合溶液中所述聚合物質(zhì)量的2%(重量)和5%(重量)之間的濃度存在。[0029]在一些實(shí)施例中，可溶解聚合物以相對(duì)于溶液中溶劑質(zhì)量的0.5%(重量)和99.5%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，可溶解聚合物以相對(duì)于溶液中溶劑質(zhì)量的2%(重量)和90%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，可溶解聚合物以相對(duì)于溶液中溶劑質(zhì)量的2%(重量)和50%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，可溶解聚合物以相對(duì)于溶液中溶劑質(zhì)量的2%(重量)和10%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，可溶解聚合物以相對(duì)于溶液中溶劑質(zhì)量的20%(重量)和90%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，可溶解聚合物以相對(duì)于溶液中溶劑質(zhì)量的1%(重量)和50%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，可溶解聚合物以相對(duì)于溶液中溶劑質(zhì)量的20%(重量)和50%(重量)之間的濃度存在。在一些實(shí)施例中，可溶解聚合物以相對(duì)于溶液中溶劑質(zhì)量的40%(重量)和90%(重量)之間的濃度存在。在大多數(shù)實(shí)施例中，溶劑是水或水性的。[0030]在一些實(shí)施例中，微針可進(jìn)一步包括至少一種藥物或生物分子。在一些實(shí)施例中，藥物或生物分子帶有負(fù)電荷。藥物或生物分子在聚合物溶解后釋放到皮膚或上皮細(xì)胞內(nèi)。[0031]除了除其機(jī)械增強(qiáng)功能之外，納米材料(諸如LDH)還可有助于大分子諸如DNA和SiRNA滲透過膜以便進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。DNA和SiRNA不能通過簡(jiǎn)單的擴(kuò)散滲透過細(xì)胞膜，而是它們必須進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)以便能夠發(fā)揮作用。由于微針被應(yīng)用到皮膚和上皮細(xì)胞，因此聚合物溶解之后這些大分子也將被釋放。這種微針結(jié)構(gòu)也可在受控釋放很重要的情況下來使用，通過調(diào)節(jié)聚合物和納米材料的組分和濃度而可以控制溶解速度。此外，納米材料結(jié)構(gòu)通過在注入到皮膚或上皮細(xì)胞內(nèi)之后提供保護(hù)而可協(xié)助提高藥物和生物分子的穩(wěn)定性。在一些實(shí)施例中，藥物或生物分子可與納米材料相結(jié)合以便形成納米藥物。在這些實(shí)施例中，在帶有或不帶有相結(jié)合納米材料的情況下，藥物或生物分子可被釋放到對(duì)象的皮膚或上皮細(xì)胞內(nèi)，或進(jìn)入到皮膚或上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核內(nèi)。例如通過共價(jià)鍵合、靜電吸引或形成氫鍵或通過將藥物或生物分子裝載到納米材料內(nèi)腔內(nèi)而認(rèn)為藥物或生物分子與納米材料“相結(jié)合”。[0032]在一些實(shí)施例中，微針包括:在至少一個(gè)表面上帶有正電荷的層狀雙金屬氫氧化物納米粒子；包括帶有負(fù)電荷官能團(tuán)的聚合物；以及藥物或生物分子。[0033]在一些實(shí)施例中，微針針尖的平均半徑在50納米和2微米之間。在一些實(shí)施例中，微針針尖的平均半徑在50納米和I微米之間。在一些實(shí)施例中，微針針尖的平均半徑在50納米和750納米之間。在一些實(shí)施例中，微針針尖的平均半徑在50納米和500納米之間。在一些實(shí)施例中，微針針尖的平均半徑在50納米和250納米之間。在一些實(shí)施例中，微針針尖的平均半徑在50納米和100納米之間。[0034]對(duì)于每個(gè)微針的形狀沒`有限制，只要實(shí)現(xiàn)能夠足夠地插入到皮膚或上皮細(xì)胞內(nèi)即可。在一些實(shí)施例中，每個(gè)微針的形狀是金字塔形的。在其它實(shí)施例中，每個(gè)微針的形狀是圓錐形的。仍在其它實(shí)施例中，每個(gè)微針針尖的形狀是楔形的或斜面的。[0035]所述高寬比限定為微針的高度與同一微針寬度(在基部處的寬度)之間的比率。在一些實(shí)施例中，微針具有在I到200之間的高寬比。在其它實(shí)施例中，高寬比在I到100之間。在一些實(shí)施例中，高寬比在I到50之間。仍在其它實(shí)施例中，高寬比在I到10之間。在其它實(shí)施例中，高寬比在I到5之間。在其它實(shí)施例中，高寬比在I到3之間。在其它實(shí)施例中，高寬比在2到10之間。在其它實(shí)施例中，高寬比在2到5之間。[0036]在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均高度在10到1000微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均高度在100到500微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均高度在100到300微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均高度在100到200微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均高度在150到300微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均高度在150到250微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均高度在150到200微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均高度在60到300微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均高度在125到175微米之間。[0037]對(duì)于本公開的目的而言，寬度被限定為在微針結(jié)構(gòu)基部處的微針兩個(gè)最寬點(diǎn)之間的直線距離；這將包括基本上呈圓錐形微針的直徑。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針底部的平均寬度在5到500微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均寬度在10到300微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均寬度在10到200微米之間。在一些實(shí)施例中,微針結(jié)構(gòu)的微針平均寬度在10到100微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均寬度在10到50微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均寬度在20到50微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均寬度在20到100微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均寬度在50到200微米之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針平均寬度在50和100微米之間。[0038]在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針密度在每平方厘米1，000到20，000個(gè)之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針密度在每平方厘米10，000到20，000個(gè)之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針密度在每平方厘米5，000到10，000個(gè)之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針密度在每平方厘米10，000到15，000個(gè)之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針密度在每平方厘米11，000到12，000個(gè)之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針密度在每平方厘米1，000到5，000個(gè)之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針密度在每平方厘米5,000到20，000個(gè)之間。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)的微針密度在每平方厘米1，000到10,000個(gè)之間。[0039]微針結(jié)構(gòu)的微針的高度、寬度和密度應(yīng)該是如此的，以至于大多數(shù)微針足夠強(qiáng)以便能夠?qū)崿F(xiàn)足夠地插入到皮膚或上皮細(xì)胞內(nèi)即可。機(jī)械增強(qiáng)的可溶解聚合物可用于制備適于藥物遞送的密集排布的較小微針，其增強(qiáng)免疫反應(yīng)。取決于微針結(jié)構(gòu)上的微針密度，高度較高的微針可能會(huì)需要較寬的寬度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將無需過多的實(shí)驗(yàn)就能夠確定高度、寬度和密度之間的必要關(guān)系。[0040]在一些實(shí)施例中，公開了用于制備微針結(jié)構(gòu)的方法。在一些實(shí)施例中，該微針結(jié)構(gòu)具有與僅包括聚合物即沒有納米材料的微針結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度相比的增加機(jī)械強(qiáng)度。在該方法中，形成包括至少一種可溶解聚合物和納米材料的復(fù)合溶液。在一些實(shí)施例中，納米材料包括在至少一個(gè)表面上帶有正電荷的層狀雙金屬氫氧化物納米粒子，而聚合物包括帶有負(fù)電荷的官能團(tuán)。在一些實(shí)施例中，復(fù)合溶液還可包括如上所述的一種或多種藥物或生物分子。還在另一些實(shí)施例中，納米藥物通過將至少`一種藥物或生物分子與納米材料相結(jié)合而形成。在一些實(shí)施例中，藥物或生物分子帶有負(fù)電荷。在這些實(shí)施例中，復(fù)合溶液的形成包括將該納米藥物與至少一種可溶解聚合物相結(jié)合。復(fù)合溶液的組分良好地分散以及納米材料基本上均勻地分布于聚合物中則是有利的。[0041]然后將該復(fù)合溶液添加到微針結(jié)構(gòu)模具的表面上。然后迫使復(fù)合溶液進(jìn)入到微針結(jié)構(gòu)模具空腔內(nèi)。在一些實(shí)施例中，復(fù)合溶液可通過使得微針結(jié)構(gòu)模具離心而被迫進(jìn)入到空腔內(nèi)。在其它實(shí)施例中，可利用真空迫使復(fù)合溶液進(jìn)入到微針結(jié)構(gòu)模具空腔內(nèi)。在迫使復(fù)合溶液進(jìn)入到微針結(jié)構(gòu)模具空腔內(nèi)的步驟完成之后，可將殘留于微針結(jié)構(gòu)模具表面(即，在初始應(yīng)用復(fù)合溶液之處)上的任何復(fù)合溶液移除以便盡量減少材料浪費(fèi)。然而，在一些實(shí)施例中，有利的是將一些復(fù)合溶液保留于微針結(jié)構(gòu)模具表面上，從而使得微針連接到一起。然后將包含于微針結(jié)構(gòu)模具空腔內(nèi)的復(fù)合溶液干燥以便形成微針結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施例中，例如如果在真空中執(zhí)行迫使步驟或用其它方法諸如微波來干燥復(fù)合溶液，則干燥步驟可與迫使步驟同時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，可根據(jù)需要重復(fù)這些步驟，即添加復(fù)合溶液，迫使復(fù)合溶液進(jìn)入到微針結(jié)構(gòu)模具空腔內(nèi)，以及干燥復(fù)合溶液以便形成微針結(jié)構(gòu)；可一次或多次地進(jìn)行步驟的上述重復(fù)。步驟的重復(fù)可允許相同的復(fù)合溶液或不同的溶液進(jìn)行層疊，在每一層中可包含不同的組分。在一些實(shí)施例中，人們可以制備“單層”微針結(jié)構(gòu)，其中所有步驟都用復(fù)合溶液以一個(gè)回合完成，這樣微針結(jié)構(gòu)的微針和基部都由相同的復(fù)合溶液構(gòu)成。在一些實(shí)施例中，這些步驟可重復(fù)一次以上，但在每一回合的步驟中使用相同的復(fù)合溶液。在這些實(shí)施例中，可添加第一層復(fù)合溶液，迫使復(fù)合溶液進(jìn)入到微針結(jié)構(gòu)模具空腔內(nèi)以及在微針結(jié)構(gòu)模具空腔內(nèi)干燥，然后添加更多的復(fù)合溶液以便形成微針結(jié)構(gòu)基部。在其它實(shí)施例中，微針可以是多層結(jié)構(gòu)。在這些實(shí)施例中，可在每一層中利用不同的復(fù)合溶液或在某些層中利用純粹的聚合物溶液(即，沒有納米材料或藥物)來重復(fù)這些步驟。例如，在一些實(shí)施例中，在通過利用一種或多種復(fù)合溶液形成微針之后，可根據(jù)需要添加更多的復(fù)合溶液或備選的純粹聚合物溶液以便形成微針結(jié)構(gòu)的基部。然后將微針結(jié)構(gòu)從微針結(jié)構(gòu)模具中取出。用于制備微針結(jié)構(gòu)方法的這樣的一個(gè)實(shí)施例在圖1中示出且在下文進(jìn)行更充分地描述。[0042][0042]在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)在約4°C到37°C之間的溫度下制備。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)在約20°C到37°C之間的溫度下制備。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)在約4°C到25°C之間的溫度下制備。在一些實(shí)施例中，微針結(jié)構(gòu)在約20°C到25°C之間的溫度下制備。[0043]在本文所述微針結(jié)構(gòu)中的納米材料可以是多功能的，因?yàn)閷⒓{米材料添加到聚合物中不僅增加聚合物的機(jī)械強(qiáng)度(從而增加微針的機(jī)械強(qiáng)度)，而且也允許微針有效地遞送藥物或生物分子，否則這些藥物或生物分子可能無法進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。因此，在一些實(shí)施例中，納米材料可包含藥物或生物分子以便起到一項(xiàng)以上的功能:它們通過提高聚合物的強(qiáng)度來增強(qiáng)微針的機(jī)械性能，以及當(dāng)納米材料與藥物或生物分子相結(jié)合時(shí)，它們用作納米藥物。在一些實(shí)施例中，公開用于將藥物或生物分子遞送到上皮細(xì)胞或經(jīng)皮地遞送藥物或生物分子的方法。為了本公開的目的，經(jīng)皮包括“通過皮膚”的傳統(tǒng)定義，而上皮遞送包括將微針結(jié)構(gòu)應(yīng)用到任何可觸及到的上皮細(xì)胞內(nèi)，包括嘴部的上皮細(xì)胞。例如，本文所公開的微針結(jié)構(gòu)也可用于將局部麻醉劑注入到牙齒組織的周圍內(nèi)。該方法的步驟包括將生物相容性的可溶解微針結(jié)構(gòu)應(yīng)用(或施加)到對(duì)象的皮膚或上皮細(xì)胞。微針結(jié)構(gòu)包括:a)至少一種可溶解的聚合物；b)被遞送的藥物或生物分子；以及c)良好地分散于每一整個(gè)微針中的納米材料。微針結(jié)構(gòu)的應(yīng)用(或施加)應(yīng)該是如此的，以至于微針結(jié)構(gòu)的微針穿透皮膚或上皮細(xì)胞以及在微針溶解后釋放藥物或生物分子。在一些實(shí)施例中，藥物或生物分子可與納米材料相結(jié)合以便形成納米藥物；在這些實(shí)施例中，在微針溶解之后釋放納米藥物。在一些實(shí)施例中，微針溶解大致在穿透皮膚或上皮細(xì)胞的五分鐘內(nèi)發(fā)生。在一些實(shí)施例中，微針溶解大致在穿透皮膚或上皮細(xì)胞的一分鐘內(nèi)發(fā)生。在一些實(shí)施例中，微針包括在至少一個(gè)表面上帶有正電荷的層狀雙金屬氫氧化物納米粒子以及帶有負(fù)電荷官能團(tuán)的可溶解聚合物。[0044]在一些實(shí)施例中，公開用于將藥物或生物分子遞送到皮膚或上皮細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核內(nèi)的方法。這對(duì)于用于將否則將無法進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的那些藥物分子或生物分子遞送到皮膚或上皮細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核內(nèi)而言是特別有用的。這些分子通常由于各種諸如大小、不穩(wěn)定性、親水性或表面帶有負(fù)電荷的原因而不能夠滲透過細(xì)胞膜。[0045]該方法的步驟包括將生物相容性的可溶解微針結(jié)構(gòu)應(yīng)用到對(duì)象的皮膚或上皮細(xì)胞。微針結(jié)構(gòu)包括:a)至少一種可溶解聚合物；b)被遞送的藥物或生物分子；以及c)良好地分散于每一整個(gè)微針內(nèi)的納米材料。微針結(jié)構(gòu)的應(yīng)用(或施加)應(yīng)該是如此的，以至于微針結(jié)構(gòu)的微針穿透皮膚或上皮細(xì)胞以及在微針溶解后釋放藥物或生物分子。在一些實(shí)施例中，藥物或生物分子可與納米材料相結(jié)合以便形成納米藥物；在這些實(shí)施例中，在微針溶解之后釋放納米藥物。在一些實(shí)施例中，微針溶解大致在穿透皮膚或上皮細(xì)胞的五分鐘內(nèi)發(fā)生。在一些實(shí)施例中，微針溶解大致在穿透皮膚或上皮細(xì)胞的一分鐘內(nèi)發(fā)生。在一些實(shí)施例中，微針包括在至少一個(gè)表面上帶有正電荷的層狀雙金屬氫氧化物納米粒子以及帶有負(fù)電荷官能團(tuán)的可溶解聚合物。[0046]當(dāng)納米材料良好地分散時(shí)，微針的機(jī)械強(qiáng)度增加超過僅具有聚合物的微針機(jī)械強(qiáng)度。為了本公開的目的，“良好地分散”并不一定意味著均勻地分布。雖然良好的分散性是所需的，但是納米材料的分布沒有必要在整個(gè)微針中是均勻的以便獲得所需結(jié)果。良好分散地但非均勻分布的納米材料仍會(huì)導(dǎo)致性能優(yōu)化。相反，其中納米材料基本上位于或接近微針針尖的微針將不會(huì)具有所需的機(jī)械強(qiáng)度增加，而當(dāng)納米材料遍布整個(gè)微針分布時(shí)，發(fā)現(xiàn)機(jī)械強(qiáng)度增加。對(duì)于如上文所述的藥物或生物分子是否與納米材料相結(jié)合諸如以便形成納米藥物而言同樣是真實(shí)的。如在下面的實(shí)例中所驗(yàn)證的那樣，納米材料在復(fù)合溶液相(具有聚合物)中的良好分散性導(dǎo)致所得到的微針結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度增加。[0047]縮略語[0048][0047]以下縮略語和術(shù)語在全文中具有如下所表示的含義:[0049]APCs=抗原呈遞細(xì)胞[0050]CMC=羧甲基纖維素鈉鹽[0051]DMSO=二甲基亞砜[0052]LDH=層狀雙金屬氫氧化物[0053]PBS=磷酸鹽緩沖鹽水[0054]PDMS=聚二甲基硅氧烷[0055]PVP=聚乙烯吡咯烷酮[0056]UV=紫外線[0057]實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)[0058]材料:氫氧化鈉、氯化鎂和氯化鋁均從美國(guó)國(guó)際實(shí)驗(yàn)室獲得。CMC(分子量90，000)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)以及Hoechst33342購自Sigma-Aldrich公司(澳大利亞新南威爾士州城堡山)。葡聚糖熒光素(分子量70，000)來自生命科技公司(LifeTechnologiesCorporation)(香港)。所有的材料在沒有進(jìn)行進(jìn)一步純化的情況下使用。[0059]Mg2Al-LDH納米粒子的制備:根據(jù)Xu等人所述的方法來制備Mg2Al-LDH納米粒子(Z.P.Xu,G.Stevenson,C.Lu,G.Q.Lu,在水溶液中對(duì)層狀雙金屬氫氧化物納米粒子的分散及尺寸控制(Dispersionandsizecontroloflayereddoublehydroxidenanoparticlesinaqueoussolutions),J.Phys.Chem.BllO(2006)16923-16929;以及Z.P.Xu,G.Stevenson,C.Lu,G.Lu,P.Bartlett,P.Gray,層狀雙金屬氫氧化物納米粒子在水溶液中的穩(wěn)定懸浮(Stablesuspensionoflayereddoublehydroxidenanoparticlesinaqueoussolution),J.AM.Chem.Soc.128(2006)36-37)。簡(jiǎn)單而言，在劇烈攬拌下將0.15M的40毫升NaOH溶液中與含有2.0毫摩爾氯化鎂和1.0毫摩爾AlCl3的10毫升溶液相混合。將容器密封并將攪拌該溶液10分鐘。接著，將該溶液離心分離并用水洗滌一次。將所得到的懸浮體分散于40ml的水中，并在氣密性容器中在80°C下水熱處理4小時(shí)。LDH的濃度為約0.4%(重量)。LDH的質(zhì)量由從懸浮體所收集的LDH質(zhì)量稱重而得到。[0060]CMC-LDH納米復(fù)合材料的制備:將具有不同濃度的LDH溶液與CMC粉末混合以便制備復(fù)合溶液。簡(jiǎn)單而言，將具有不同濃度的10毫升LDH溶液與200毫克的CMC混合以便制備復(fù)合溶液，然后放置于通風(fēng)櫥中并干燥以便得到聚合物納米復(fù)合材料。所制備的納米復(fù)合材料含有2%(重量)，5%(重量)和10重量％的LDH納米粒子。重量百分比是LDH納米粒子與CMC的質(zhì)量比。在微針的制備過程中，在3000Xg的條件下在模具上將CMC-LDH溶液離心10分鐘。為了針對(duì)另一批樣品模擬該過程，將含25mgLDH納米粒子的10毫升溶液與500毫克的CMC混合，并將混合物超聲處理30分鐘。在這之后，在4000Xg的條件下將溶液離心10分鐘。離心到溶液底部的納米粒子的量是微不足道的。收集上層溶液，超聲處理30分鐘以便用于制備納米壓痕樣品和微針陣列。[0061]微針貼片的制備:硅微針陣列用作陽模。根據(jù)文獻(xiàn)中所述的方法來制備陣列(例如參見R.Bhandati,S.Negi,F.Solzbacher,晶片規(guī)模制備穿透神經(jīng)微電極陣列(Wafer-scalefabricationofpenetratingneuralmicroelectrodearrays),Biomed.Microdevicesl2(2010)797-807)。簡(jiǎn)單而言，用金剛石刀片切割硅晶片以便形成所需尺寸和間距的硅微柱。使用利用硝酸和氫氟酸混合物的兩步各向同性蝕刻來制備尖銳的微針。用乙醇洗滌該硅微針陣列陽模3次，在空氣中干燥，然后將PDMS緩慢地倒在硅微針陣列的表面上。將浸入PDMS內(nèi)的硅微針陣列陽模放置于通風(fēng)櫥中固化24小時(shí)。固化后，剝離硅微針陣列陽模，在澆鑄之前用水和乙醇洗滌PDMS陰模3次。圖1示出用于制備可溶解聚合物微針補(bǔ)片的步驟。圖1-1示出PDMS模具。為了制備微針貼片，首先，將30微升的LDH-CMC復(fù)合溶液添加到模具表面上(圖1-2)。然后將模具密封(圖1-3)以及在3000Xg的條件下離心10分鐘。離心后，用移液管收集殘留于模具表面上的溶液以及將模具放置于通風(fēng)櫥中以便干燥30分鐘。在干燥期間，制備固體微針針尖(圖1-5)。接著，將40微升的LDH-CMC復(fù)合溶液添加到表面上(圖1-6)以及將模具密封(圖1-7)并離心10分鐘。最后，將200微升的LDH-CMC復(fù)合溶液添加到離心模具的表面上并放置于通風(fēng)櫥中以便干燥。8小時(shí)后，將模具放置于密封的干燥器中。當(dāng)微針貼片完全干燥時(shí)，將其從模具中取出(圖1-9)，并儲(chǔ)存于干燥器中直至使用`[0062]納米復(fù)合材料的機(jī)械性能以及微針貼片的形態(tài)表征:由MTS納米壓痕器XP?(MTScooperation,納米儀器科技創(chuàng)新中心(NanoInstrumentInnovationCenter),NT)和三棱錐(Berkovich)金剛石壓痕器進(jìn)行納米壓痕。壓痕器以恒定的應(yīng)變率(0.051/s)從樣品表面壓入材料到深為2000納米。通過掃描電子顯微鏡(JEOLJSM-820和FEG-SEMJEOLJSM-6335F)觀察所制備的聚合物微針貼片。樣品相對(duì)于SEM傾斜45°。[0063]細(xì)胞系和培養(yǎng)條件:人類肺腺癌上皮細(xì)胞(A549)和人類宮頸癌細(xì)胞(HeLa)在添加有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)高濃度葡萄糖中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞在含有5%CO2的加濕大氣中保持在37°C下。細(xì)胞在組織培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)。在超過80%融合之后，將細(xì)胞用胰蛋白酶處理及洗滌以及細(xì)胞懸浮體接種到96-孔板中。[0064]細(xì)胞活性測(cè)試:將A549和HeLa細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA洗滌兩次。[0065]將懸浮于DMEM(含有10%FBS，1%青霉素/鏈霉素)中的細(xì)胞接種于96-孔板中，每個(gè)孔盛放2000個(gè)細(xì)胞。在用LDH納米粒子處理之前，細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)48小時(shí)。用200微升DMEM(含有10%FBS，1%青霉素/鏈霉素)中不同濃度的LDH納米粒子培養(yǎng)細(xì)胞額外的72小時(shí)。隨后將每個(gè)孔中的原始培養(yǎng)基移除。添加160微升的DMEM(無血清)和40微升的MTT原液(在PBS中為5毫克/毫升)并培養(yǎng)4小時(shí)。將含有MTT的培養(yǎng)基完全移除，然后將200微升的DMSO和25微升的甘氨酸緩沖液(0.1M甘氨酸，0.1M氯化鈉，pH值為10.5)添加到每個(gè)孔內(nèi)。利用BioTekPowerwaveXS-酶標(biāo)儀通過讀取在570nm和750nm下的吸光度來測(cè)定細(xì)胞活性。[0066]微針貼片的共聚焦顯微鏡研究及其在人體皮膚和豬皮中的應(yīng)用:從本地屠宰場(chǎng)(澳大利亞格倫伊格爾斯(Gleneagle)的HighchesterPtyLtd)獲得離體豬耳朵。輕輕剃光耳朵腹側(cè)，之后徹底沖洗。然后使用鑷子和手術(shù)刀將腹側(cè)皮膚(表皮和真皮)從耳朵分離(軟骨)。從腹部整形手術(shù)患者獲得切下的人體皮膚。在到達(dá)目的地后，使用手術(shù)刀去除脂肪組織并對(duì)皮膚進(jìn)行漂洗。所有患者均簽署由亞歷山德拉公主醫(yī)院研究委員會(huì)(PrincessAlexandraHospitalResearchCommittee)批準(zhǔn)的第097/090號(hào)知情同意書。皮膚(豬皮和人體皮膚)使用前在_20°C下儲(chǔ)存。對(duì)于微針應(yīng)用而言，皮膚(豬皮或人體皮膚)被解凍，沖洗，干燥，然后固定繃緊在覆蓋板上。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不使用時(shí)所述組織存儲(chǔ)在生理鹽水濕潤(rùn)的紗布上。然后利用彈簧施加器應(yīng)用微針陣列I分鐘，2分鐘或5分鐘(針對(duì)每一皮膚類型，n=3)。應(yīng)用微針之后，從處理區(qū)域切離8毫米的活檢組織切片以及將組織在I毫升的含4%多聚甲醛的甲醇中固定(fix)I小時(shí)。在固定之后，將組織取出，在I毫升的0.1M磷酸鹽緩沖鹽水中在10分鐘內(nèi)洗滌3次。然后將樣品儲(chǔ)存在4°C下，直到成像。[0067]使用VivaSCOpe?1500Multilaser(美國(guó)紐約羅切斯特的LucidInc.)制備反射共聚焦顯微鏡。協(xié)議自先前公布的程序(E.M.TWurm,C.Longo,C.Curchin,H.P.Soyer,T.ff.Prow,G.Pellacani，使用反射共聚焦顯微鏡在前臂皮膚內(nèi)進(jìn)行實(shí)足老化和光老化的體內(nèi)評(píng)估(Invivoassessmentofchronologicalageingandphotoageinginforearmskinusingreflectanceconfocalmicroscopy),BR.J.Dermatol.167(2012)270-279)進(jìn)行改編。簡(jiǎn)單而言，用激光二極管激發(fā)在830nm處的組織。使用ImageJ(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH))來分析圖像。利用ZeissLSM5IOMeta(德國(guó)的卡爾?蔡司公司(CarlZeissInc.))來制備激光掃描共聚焦顯微鏡。在成像之前，將組織用H0echst33342染色，細(xì)胞核染色。在二甲基亞砜中制備10毫克/毫升的Hoechst33342原液。通過以1:1000的比例稀釋0.1M磷酸緩沖鹽水來制備操作溶液。在室溫下用著色劑(stain)將組織培養(yǎng)I小時(shí)，然后在0.1M磷酸鹽緩沖液中在10分鐘`內(nèi)進(jìn)行三次洗滌步驟。用于激發(fā)FITC-葡聚糖和Hoechst33342的波長(zhǎng)分別為488nm和405nm。[0068]結(jié)果[0069]Mg2Al-CL-LDH納米粒子的表征:制備平均粒徑為80nm且在不含水和緩沖劑溶液中zeta電位為40毫伏的Mg2Al-CL_LDH納米粒子(圖2a_c)。所制備的水懸浮液包含良好懸浮的LDH納米粒子而沒有聚集(圖2a-b)。X射線衍射圖譜示出Mg2Al-Cl-LDH納米粒子的典型特征(圖2d)。在原始LDH納米粒子的X射線衍射圖譜中所示的衍射峰對(duì)應(yīng)于LDH的(003)，(006)和(009)的平面反射。[0070]CMC和CMC-LDH納米復(fù)合材料的機(jī)械性能:將變化量的LDH混入到2重量％CMC水溶液中以便測(cè)試LDH納米粒子對(duì)CMC機(jī)械性能的增強(qiáng)效果。在樣品干燥后，使用納米壓痕器來測(cè)量其彈性模量和硬度。圖3a示出具有不同LDH納米粒子濃度的CMC聚合物的典型負(fù)載-位移曲線。納米壓痕周期包括三個(gè)階段:加載-保持-卸載。加載力以恒定的速度增加以在加載階段期間納米壓痕器尖端穿透進(jìn)入到材料內(nèi)，其導(dǎo)致彈性和塑性變形。在加載階段期間堅(jiān)固的材料需要較高的力來達(dá)到同樣的穿透深度。如從圖3a可以觀察到的那樣，當(dāng)LDH納米粒子的濃度的增加從0%(重量)增加到2%，5%和10%(重量)(相對(duì)于樣品中CMC的質(zhì)量)時(shí)，為了穿透相同的深度需要更大的負(fù)載。顯然，將LDH納米粒子添加到CMC中可顯著提高其抗壓痕性且使得CMC-LDH復(fù)合材料比純粹的CMC強(qiáng)度更高。圖3b和圖3c示出分別從卸載計(jì)算出的聚合物彈性模量和硬度。純粹CMC的彈性模量為0.993±0.065GPa。加載2%(重量)LDH的CMC的彈性模量增加至1.489±0.036GPa。隨著LDH的濃度增加至5%(重量)，彈性模量達(dá)到2.878±0.123GPa。當(dāng)5%(重量)的LDH納米粒子添加到CMC(p〈0.001)時(shí)，彈性模量增加至純粹CMC聚合物彈性模量的290%。當(dāng)LDH的濃度增加至10重量％時(shí)，納米復(fù)合材料的彈性模量開始減小。應(yīng)該指出的是純粹CMC聚合物的硬度為0.067±0.0OlGPa0將LDH納米粒子添加到CMC使得復(fù)合材料的硬度增加，對(duì)于分別具有2%(重量)，5%(重量)和10%(重量)的LDH納米粒子的CMC復(fù)合材料而言，分別增加至0.080±0.0OlGPa,0.111±0.004GPa以及0.118±0.0OlGPa0[0071]根據(jù)這些結(jié)果，將具有5%(重量)LDH納米粒子的CMC復(fù)合材料選擇作為用于制備微針陣列的起始原料。由于利用離心(在3000Xg的條件下離心10分鐘)來迫使粘性聚合物溶液填充到微針PDMS模具的微小空腔內(nèi)，CMC水溶液的濃度增加至5%(重量)，以避免LDH納米粒子在離心后微針內(nèi)的不均等分布。當(dāng)將5%(重量)的LDH(相對(duì)于CMC的質(zhì)量)添加到5%(重量)的CMC溶液中之后在4000Xg的條件下離心10分鐘，通過簡(jiǎn)單地觀察混合溶液可以發(fā)現(xiàn)沉淀了量可以忽略不計(jì)的LDH[0072]納米粒子。丟棄溶液的底層而用上清液來進(jìn)行納米壓痕測(cè)量。結(jié)果表明，5%(重量)CMC/5%(重量)LDH的彈性模量為2.486±0.186GPa。值略低于從混入5%(重量)LDH的2%(重量)的CMC溶液干燥得到的樣品最高彈性模量，但它仍然遠(yuǎn)高于純粹CMC(p〈0.001)的彈性模量。然后用5%(重量)CMC/5%(重量)LDH的懸浮液來制備微針。[0073]CMC和CMC-LDH微針貼片的表征:將LDH納米粒子混入CMC內(nèi)可以顯著增加聚合物機(jī)械性能的假設(shè)驗(yàn)證支持使用該納米填料改進(jìn)的聚合物來制備和測(cè)試微針陣列。圖4a和圖4b是硅微針陽模的代表性SEM圖像，所述陽模用于制備適于聚合物微針制備的PDMS陰模。硅微針的高度和密度分別為218微米和每平方厘米11900個(gè)突起。圖4c和圖4d示出本發(fā)明的可溶解聚合物微針的典型SEM圖像。聚合物微針具有均一的形態(tài)和幾何形狀。微針為錐體形狀且針尖半徑為500nm以下。這些所制備的聚合物突起的長(zhǎng)度為165±3微米(n=20個(gè)突起)。這表明與陽模微針的長(zhǎng)度相比在長(zhǎng)度上減少24±I%。這減少的主要原因在于在干燥過程中基于CMC復(fù)合材料的收縮和固化。[0074]CMC-LDH納米復(fù)合材料微針貼片的細(xì)胞毒性:由于在材料配方中使用納米材料來制備微針陣列，在進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試之前，對(duì)納米復(fù)合材料的微針貼片進(jìn)行生物相容性的研究。通過MTT檢測(cè)(圖5，在72小時(shí)后鍍敷)測(cè)定LDH納米粒子增強(qiáng)的復(fù)合材料微針貼片對(duì)HeLa細(xì)胞(圖5a)和A549細(xì)胞(圖5b)的細(xì)胞毒性。納米復(fù)合材料處理后細(xì)胞的細(xì)胞存活率對(duì)劑量呈依賴關(guān)系。與對(duì)照組相比，當(dāng)LDH納米粒子濃度從0.0625增加至0.5毫克/毫升時(shí)，細(xì)胞的存活率保持在80%以上。即使當(dāng)LDH的濃度進(jìn)一步增加到I毫克/毫升時(shí)，HeLa和A459細(xì)胞的存活率仍在70%以上。[0075]納米復(fù)合材料微針貼片在人體皮膚和豬皮內(nèi)的滲透和傳遞有效負(fù)載的共聚焦顯微鏡研究:一旦成功地制備出納米復(fù)合材料微針貼片，接下來的關(guān)鍵問題在于這些微針是否能夠可靠地穿透角質(zhì)層和將有效負(fù)載傳遞至皮膚。為了執(zhí)行該項(xiàng)研究，將FITC-葡聚糖與CMC-LDH納米粒子溶液簡(jiǎn)單地混合作為可見藥物和生物分子的替代，然后將其添加到微針針尖上；然后在離體的豬皮和人體皮膚內(nèi)進(jìn)行納米填料復(fù)合微針穿透的測(cè)試。為了確定微針是否可以均勻地穿透皮膚，使用反射共聚焦顯微鏡(RCM)來對(duì)處理后的豬皮和人體皮膚進(jìn)行成像(代表圖6a-d中所示的圖像)。應(yīng)用到豬皮的納米復(fù)合材料微針導(dǎo)致成功地刺穿角質(zhì)層以及在整個(gè)陣列中均勻地穿透到皮膚內(nèi)(圖6a)。從RCM圖像分析得到的穿透深度為71±7微米組(n=40個(gè)突起)。這些結(jié)果不同于針對(duì)僅包含CMC的微針?biāo)^察到的那樣，僅有CMC的微針不均勻地穿透(圖6b)。中心區(qū)域示出穿透，但在其余區(qū)域中不能清晰地觀察到穿透孔。在中心區(qū)域中的穿透深度被認(rèn)為是46±12微米(n=40個(gè)突起，在穿透豬皮的CMC和CMC-LDH微針之間的p〈0.001)。納米復(fù)合材料微針也導(dǎo)致成功地刺穿以及以深度64±9微米(n=40個(gè)突起)穿透到人體皮膚內(nèi)(圖6c)。僅包含CMC的微針以最小穿透深度39±8微米(n=40個(gè)突起，在穿透人體皮膚的CMC和CMC-LDH微針之間的p〈0.001)(圖6d)導(dǎo)致皮膚表面上的壓痕，其中。除了在豬皮和人體皮膚中實(shí)現(xiàn)明顯的更深穿透深度之外，CMC-LDH納米復(fù)合材料微針可更可靠地成功應(yīng)用，而CMC微針由于微針有時(shí)在皮膚表面上彎曲而導(dǎo)致在整個(gè)陣列中的非一致性穿透。[0076]然后利用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)對(duì)RCM樣品進(jìn)行成像以便確定在皮膚內(nèi)的有效負(fù)載溶解和擴(kuò)散(在圖7a_h中示出應(yīng)用微針五分鐘后的代表性圖像)。對(duì)于應(yīng)用于皮膚樣品的純粹CMC微針而言，圖像選自于微針穿透到皮膚內(nèi)的區(qū)域。從皮膚樣品的頂視圖(參見圖7a，7c，7e和7g)可清楚地觀察到遞送地點(diǎn)，這進(jìn)一步證實(shí)聚合物微針能夠刺穿角質(zhì)層。相應(yīng)的3-D圖像(圖7b，7d，7f和7h)證實(shí)微針溶解于皮膚中以及FITC有效負(fù)載被傳遞到皮膚表面下方的薄層上。CMC-LDH納米復(fù)合材料微針可以可靠地穿透皮膚且將有效負(fù)載傳遞到皮膚內(nèi)。與CMC微針相比，納米材料增強(qiáng)的微針導(dǎo)致在遍布整個(gè)貼片區(qū)域內(nèi)更一致地穿透到皮膚內(nèi)。[0077]為了研究機(jī)械增強(qiáng)的微針是否仍然可以快速地溶解于皮膚內(nèi)，在應(yīng)用到皮膚內(nèi)之前以及在穿透皮膚后的1，2和5分鐘觀察微針。結(jié)果在圖8a_d中示出。該圖示出在應(yīng)用到皮膚之前和之后微針的合并后的熒光和反射共聚焦顯微鏡圖像。在應(yīng)用之前，熒光有效負(fù)載可以在整個(gè)微針軸中以綠色清楚地看到(圖8a)?？稍陉嚵械幕刻帣z測(cè)到無熒光信號(hào)，其通過借助于減少藥物浪費(fèi)來節(jié)約藥物而具有額外的降低成本的益處。由于該原因，由于有效負(fù)載在突起內(nèi)施放而不是在微針的背襯層中被“浪費(fèi)”，會(huì)在微針之間的表面上看到最少的熒光。在皮膚應(yīng)用之后，可以看出僅僅在I分鐘之后幾乎所有的微針都溶解于皮膚內(nèi)。在皮膚內(nèi)的快速溶解對(duì)于很短的施用時(shí)間而言是至關(guān)重要的。為了便于與以前的報(bào)告進(jìn)行比較，將甲基丙烯酸(MAA)與乙烯基吡咯烷酮(VP)共聚以便形成聚(乙烯基吡咯烷酮-共-甲基丙烯酸)(PVP-MAA)以便提高所制備微針的機(jī)械強(qiáng)度。然而，由于添加MAA，微針的溶解速率顯著減慢。例如，PVP-MAA微針(25%MAA)需要2小時(shí)在豬皮內(nèi)溶解，而同樣大小的純粹PVP微針在15分鐘內(nèi)溶解。[0078]通過添加LDH納米粒子顯著增強(qiáng)CMC的機(jī)械強(qiáng)度。CMC/LDH復(fù)合材料微針的彈性模量可與工程塑料的彈性模量相當(dāng)，例如對(duì)于尼龍而言為2-4GPa以及對(duì)于聚碳酸酯而言為2.0-2.6GPa。此項(xiàng)改進(jìn)具有增加藥物和生物分子配方靈活性的能力，其可混入到可溶解的微針陣列內(nèi)。主要包括蛋白質(zhì)和鹽的藥物和生物分子的添加會(huì)以依賴于濃度的方式劣化結(jié)構(gòu)聚合物的機(jī)械性能。添加增強(qiáng)納米填料可有助于遏制該效果，使得最終的微針陣列仍然對(duì)動(dòng)物和人類應(yīng)用非常有用。[0079]如上所述的制備工藝在室溫下操作(23°C)。降低溫度以便優(yōu)化藥物和生物分子的穩(wěn)定性可利用這種鑄型技術(shù)進(jìn)行研究。整個(gè)制備工藝不需要加熱、紫外線照射或任何其它惡劣條件或處理；因此，該技術(shù)適于將藥物和需要慎重處理的生物分子混入到微針內(nèi)以便隨后經(jīng)皮遞送。納米微針具有優(yōu)良的生物相容性，類似于其它廣泛研究且通常被認(rèn)為是諸如納米金的生物相容性納米粒子，如由細(xì)胞活性測(cè)試證實(shí)的那樣。CMC/LDH復(fù)合材料微針的增強(qiáng)機(jī)械性能成功地刺穿豬皮和人體皮膚以便遞送FITC-標(biāo)記的葡聚糖有效負(fù)載。重要的是，納米粒子增強(qiáng)聚合物微針保留僅在I分鐘內(nèi)快速溶解的能力。復(fù)合材料微針遞送FITC-標(biāo)記的葡聚糖有效負(fù)載高達(dá)約人體皮膚表面下方的64±9微米。人類表皮層含有高密度的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，以及將人體前臂背側(cè)表皮用作實(shí)例的情況下其厚度為61.3±11.0微米。這意味著大部分的有效負(fù)載被遞送到目標(biāo)層內(nèi)。[0080]雖然本文已經(jīng)描述和示出了本發(fā)明的幾個(gè)方面，對(duì)于本【
技術(shù)領(lǐng)域：
】的那些熟練技術(shù)人員而言可進(jìn)行替代性的方面以便實(shí)現(xiàn)同樣的目的。因此，所附權(quán)利要求預(yù)期涵蓋落入本發(fā)明真實(shí)精神和范圍之內(nèi)的所有這些`替代性方面。【權(quán)利要求】1.一種微針結(jié)構(gòu)，其包括多個(gè)微針，其中每個(gè)所述微針包括至少一種可溶解聚合物和納米材料，其特征在于所述納米材料良好地分散于每一整個(gè)所述微針中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微針結(jié)構(gòu)，其特征在于所述納米材料選自于納米粒子、納米薄片、納米纖維、納米線和納米管的至少一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微針結(jié)構(gòu)，其特征在于所述納米材料包括在至少一個(gè)表面上的正電荷。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微針結(jié)構(gòu)，其特征在于所述納米材料包括層狀雙金屬氫氧化物納米粒子。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微針結(jié)構(gòu)，其特征在于所述層狀雙金屬氫氧化物納米粒子包括鎂、鋁、鐵、鈷、鋅、鈣和錳的至少一種。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微針結(jié)構(gòu)，其特征在于所述聚合物包括帶有負(fù)電荷的官能團(tuán)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微針結(jié)構(gòu)，其特征在于所述微針進(jìn)一步包括至少一種藥物或生物分子，并且其特征在于所述藥物或生物分子可任選地與所述納米材料相結(jié)合以便形成納米藥物。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微針結(jié)構(gòu)，其特征在于所述微針包括:層狀雙金屬氫氧化物納米粒子，其包括在至少一個(gè)表面上的正電荷；聚合物，其包括帶有負(fù)電荷的官能團(tuán)；以及藥物或生物分子。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微針結(jié)構(gòu)，其特征在于所述聚合物是羧甲基纖維素鈉。10.用于制備機(jī)械強(qiáng)度增加的微針結(jié)構(gòu)的方法，其包括:a.形成復(fù)合溶液，其包括至少一種可溶解聚合物和納米材料以及任選地至少一種藥物或生物分子，其中所述納米材料良好地分散于整個(gè)所述復(fù)合溶液中；b.將所述復(fù)合溶液添加到微針結(jié)構(gòu)模具的表面上；c.迫使所述復(fù)合溶液進(jìn)入到微針結(jié)構(gòu)的模具空腔內(nèi)；d.干燥所述復(fù)合溶液以便形成微針結(jié)構(gòu)；以及e.從所述微針結(jié)構(gòu)模具取出所述微針結(jié)構(gòu)；其特征在于所述藥物或生物分子可任選地與所述納米材料相結(jié)合以便形成納米藥物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于將步驟b、C和d重復(fù)一次或多次。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述納米材料包括在至少一個(gè)表面上帶有正電荷的層狀雙金屬氫氧化物納米粒子，以及其特征在于所述聚合物包括帶有負(fù)電荷的官能團(tuán)。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于層狀雙金屬氫氧化物納米粒子以相對(duì)于復(fù)合溶液中所述聚合物質(zhì)量的0.5%(重量)和20%(重量)之間的濃度存在。14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述方法在約4°C到37°C之間的溫度下進(jìn)行。15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述藥物或生物分子帶有負(fù)電荷。16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述微針結(jié)構(gòu)的溶解速率在包括至少一種可溶解聚合物但不包括納米材料的微針結(jié)構(gòu)溶解速率的25%內(nèi)。17.用于經(jīng)皮遞送藥物或生物分子或用于將藥物或生物分子遞送到上皮細(xì)胞或遞送到皮膚或上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核的一種方法，所述方法包括將包括多個(gè)微針的生物相容性的可溶解微針結(jié)構(gòu)應(yīng)用到對(duì)象的皮膚或上皮細(xì)胞，其中每個(gè)所述微針包括:a)至少一種可溶解聚合物；b)納米材料；以及c)藥物或生物分子；其特征在于所述納米材料良好地分散于每一整個(gè)所述微針中；所述應(yīng)用使得微針結(jié)構(gòu)的微針穿透皮膚或上皮細(xì)胞以及在所述微針溶解后釋放藥物或生物分子，以及其特征在于在皮膚或上皮細(xì)胞的所述穿透的五分鐘內(nèi)大致發(fā)生所述微針的所述溶解；其特征在于所述藥物或生物分子可任選地與所述納米材料相結(jié)合以便形成納米藥物，以及其特征在于在所述微針溶解后釋放所述納米藥物。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述微針包括在至少一個(gè)表面上帶有正電荷的層狀雙金屬氫氧化物納米粒子以及包括帶有負(fù)電荷的官能團(tuán)的聚合物。19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于所述微針的所述溶解大致在皮膚或上皮細(xì)胞的所述穿透的一分鐘內(nèi)發(fā)生。【文檔編號(hào)】A61M37/00GK103816611SQ201310573710【公開日】2014年5月28日申請(qǐng)日期:2013年11月15日優(yōu)先權(quán)日:2012年11月16日【發(fā)明者】嚴(yán)礪,陳獻(xiàn)峰申請(qǐng)人:香港城市大學(xué)