一種線性的合成多肽g及其抗病毒應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種線性的合成多肽G及其抗病毒應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的線性的合成多肽G具有序列列表中SEQ?ID?No.1所示的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)特征；該線性的合成多肽G衍生自序列列表中SEQ?ID?No.2所示中國(guó)明對(duì)蝦抗脂多糖因子ALFFc的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域；經(jīng)對(duì)本發(fā)明涉及的線性的合成多肽G進(jìn)行生物功能體外驗(yàn)證，證實(shí)其對(duì)病毒的增殖具有很強(qiáng)的抑制作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種線性的合成多肽G及其抗病毒應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種線性的合成多肽G及其抗病毒應(yīng)用，具體地說(shuō)是一種合成的衍生自中國(guó)明對(duì)蝦抗脂多糖因子ALFFc的脂多糖(LPS)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的線性多肽及其抗病毒應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]對(duì)蝦的養(yǎng)殖在我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位，近些年來(lái)，對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中的病害問(wèn)題已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了其養(yǎng)殖生產(chǎn)的健康發(fā)展，抗生素的濫用與環(huán)境的惡化使海水養(yǎng)殖動(dòng)物的病害難以從根本上得到控制。
[0003]抗菌肽(蛋白)被認(rèn)為是魚(yú)、蝦、貝等防御細(xì)菌、病毒等外源病原感染的重要效應(yīng)分子，在動(dòng)物的先天免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前從甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽種類(lèi)繁多，抗脂多糖因子(ant1-lipopolysaccharide factor, ALF)就是其中一種重要的抗菌肽。1982年，Tanaka 等首次從中國(guó)當(dāng)(Tachypleus tridentatus)和北美當(dāng)(Limulus polyphemus)的血細(xì)胞中分離得到ALF，并發(fā)現(xiàn)其能抑制LPS介導(dǎo)的凝血反應(yīng)的激活。1985年，Morita等發(fā)現(xiàn)ALF還具有很強(qiáng)的抗革蘭氏陰性菌活性。之后，人們相繼在斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)、中國(guó)明對(duì)蟲(chóng)下(Fenneropenaeus chinensis)、臼本囊對(duì)蟲(chóng)下(Marsupenaeusjaponicus)、凡納濱對(duì)蟲(chóng)下(Litopenaeus vannamei)> 桃紅對(duì)蟲(chóng)下(Farfantepenaeusduorarum)等多種甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)ALF基因的存在,并證實(shí)ALF的重組蛋白具有廣泛的抗革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的活性。另外，研究還發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)預(yù)先與重組表達(dá)的ALF蛋白一起孵育后再注射入蝦體中，能抑制蝦體中WSSV的復(fù)制。
[0004]與傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)理不同，ALF直接中和細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖，溶解細(xì)菌，因此不易產(chǎn)生細(xì)菌的耐藥性。ALF對(duì)病毒的作用機(jī)理目前仍不清楚。隨著抗生素的應(yīng)用，許多病原菌對(duì)現(xiàn)有抗生素逐步產(chǎn)生耐藥性，而新型抗生素的發(fā)現(xiàn)又極其困難，因此，ALF的研究為開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物開(kāi)辟了廣闊的前景。
[0005]研究發(fā)現(xiàn)，ALF氨基酸序列中的兩個(gè)保守半胱氨酸之間形成二硫鍵，并與之間的氨基酸序列共同形成一段陰離子多肽，具有與LPS結(jié)合的能力，這段保守的結(jié)構(gòu)命名為L(zhǎng)PS結(jié)合結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為是ALF降解革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂多糖的功能域。2011年，Sachin Sharma等研究了根據(jù)鋸緣青蟹(Scylla serrata) ALF的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域合成的具24個(gè)氨基酸殘基的多肽在抗菌免疫過(guò)程中作用，發(fā)現(xiàn)合成多肽SsALF24具有結(jié)合LPS的活性并且對(duì)大腸桿菌都具有明顯的抑制作用，其最小抑制濃度為16.16~32.32uM (Sharma S, Yedery RD,PatgaonkarMS, Selvaakumar C，Reddy KV.Antibacterialactivity of a synthetic peptide that mimics the LPS binding domain of Indianmud crab, Scylla serrata ant1-lipopoIysaccharide factor (SsALF)also involved inthe modulation of vaginal immune functions through NF_kB signaling.Microbialpathogenesis2011;50:179-191.)。
[0006]令人感興趣的是，不同種類(lèi)的ALF多肽所抵御病原的種類(lèi)及其活性大小均具有明顯的差異，提示我們可以通過(guò)改變LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域中個(gè)別氨基酸的種類(lèi)獲得具有高抗性或特異抗性的多肽分子?；诖嗽O(shè)想，我們基于已發(fā)現(xiàn)的中國(guó)明對(duì)蝦ALFFc (Liu FS, LiuYC, Li FH, Dong B,Xiang JH.Molecular cloning and expression profile of putativeantilipopoIysaccharide factor in Chinese shrimp(Fenneropenaeus chinensis).Marine Biotechnology2005; 7:600-608.)的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行的部分氛基酸殘基的改變，利用化學(xué)合成的方法獲得了線性多肽G，該線性多肽具有明顯的特異抗病毒生物學(xué)活性，具有重要的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明旨在提供一種衍生自中國(guó)明對(duì)蝦抗脂多糖因子ALFFc的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域的線性的合成多肽G，具有明顯的抗病毒活性。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0009]利用化學(xué)合成的方法獲得了線性的合成多肽G，具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，其序列特征為:
[0010]Ac-EC(Me)KFTVKPYIKRFQLYYKGRMWC(Me)P-NH2。
[0011]所述的線性的合成多肽G氨基酸序列中的兩個(gè)半胱氨酸殘基C為甲基化修飾的半胱氨酸殘基C (Me);多肽的氨基端E的氨基被乙?；?Ac-),羧基端P的羧基被酰胺化(-NH2) ο
[0012]所述的線性的合成多肽G，所述的線性的合成多肽G衍生自中國(guó)明對(duì)蝦抗脂多糖因子ALFFc的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0013]所述的中國(guó)明對(duì)蝦抗脂多糖因子ALFFc的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有序列列表中SEQID N0.2所示的氨基酸序列，具體序列為:ECKFTVKPYIKRFQLYYKGRMWCP。
`[0014]所述的線性的合成多肽G具有明顯的抗病毒活性。具體為:對(duì)病毒的增殖具有很強(qiáng)的抑制作用。
[0015]所述線性的合成多肽G可作為抗病毒的活性成份，可用于制備抗病毒的藥物或制劑中。
[0016]本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn):
[0017]1、本發(fā)明確定了一種衍生自中國(guó)明對(duì)蝦抗脂多糖因子ALFFc的抗病毒多肽G及其結(jié)構(gòu)特征。
[0018]2、通過(guò)本發(fā)明可開(kāi)發(fā)有效的對(duì)蝦病毒類(lèi)疾病的防治藥物。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1合成多肽G的骨架結(jié)構(gòu)圖；
[0020]圖2合成多肽G的空間結(jié)構(gòu)圖；
[0021 ] 圖3合成多肽G的HPLC純度檢測(cè)圖；
[0022]圖4合成多肽G的MS質(zhì)譜鑒定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。[0024]一種化學(xué)合成的具有明顯抗病毒活性的對(duì)蝦線性多肽G，其序列及來(lái)源序列信息如下:
[0025](I) SEQ ID N0.1 的信息
[0026](a)序列特征
[0027]*長(zhǎng)度:24氨基酸
[0028]*類(lèi)型:氨基酸
[0029]*鏈型:單鏈
[0030]*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性，兩個(gè)半胱氨酸被甲基化修飾
[0031]*空間結(jié)構(gòu):具有I)圖1所示骨架結(jié)構(gòu):線性多肽序列中的半胱氨酸(C)被甲基化修飾，甲基化修飾的巰基用加深黑色表示，C骨架及其它原子用灰色表示；和2)圖2所示空間結(jié)構(gòu):多肽序列形成兩個(gè)相連的β折疊結(jié)構(gòu)。
[0032](b)分子類(lèi)型:蛋白
[0033]序列描述:SEQID N0.1
[0034]Ac-EC(Me)KFTVKPYIKRFQLYYKGRMWC(Me)P-NH2
[0035]其中括號(hào)內(nèi)的Me表示其前的半胱氨酸為甲基化的半胱氨酸C ；Ac-表示氨基酸E的氨基被乙酰化；-NH2表示氨基酸P的羧基被乙?；?。
[0036](2) SEQ ID N0.2 的信息
[0037](a)序列特征
[0038]*長(zhǎng)度:24氨基酸
[0039]*類(lèi)型:氨基酸
[0040]*鏈型:單鏈
[0041]*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
[0042](b)分子類(lèi)型:蛋白
[0043]序列描述:SEQID N0.2
[0044]ECKFTVKPYIKRFQLYYKGRMWCP[0045]所述抗病毒多肽G的合成、純化、鑒定及生物活性分析:
[0046]通過(guò)人工化學(xué)合成途徑，利用固相合成方法獲得粗品多肽，經(jīng)質(zhì)譜鑒定和液相色譜純化獲得合成多肽G。具體為:
[0047]I)多肽合成
[0048]采用9-荷甲氧羰基(Fmoc)合成策略，從C端向N端方向合成。用IOmgRink-Amide-Resin樹(shù)脂(AAPPTec，貨號(hào)RRZOOI)作為載體，依靠載體本身的活性基團(tuán)與5mg被Fmoc進(jìn)行氨基保護(hù)的第一個(gè)氨基酸(Fmoc-Pro-NH2)的羧基相連(詳細(xì)方法參考文獻(xiàn):Panagiotis Stathopoulos, Serafim Papas, Vassilios Tsikaris.C-terminalN-alkylated peptide amides resulting from the linker decomposition of the Rinkamide resin.A new cleavage mixture prevents their formation.Journal of PeptideScience2006;12:227-232.)。
[0049]用N-甲基毗咯皖酣(NMP)沖洗樹(shù)脂除去多余保護(hù)氨基酸，向反應(yīng)器(固相合成器)中加入20%哌啶/NMP溶液(體積分?jǐn)?shù))脫除Fmoc基團(tuán)，反應(yīng)20min，排空反應(yīng)器，用5mLNMP振蕩沖洗樹(shù)脂，重復(fù)3次，脫除第一個(gè)氨基酸殘基的Fmoc保護(hù)；裸露出的活性氨基基團(tuán)與下一個(gè)被Fmoc進(jìn)行氨基保護(hù)的氨基酸(5mg)的羧基相連,形成第一個(gè)肽鍵(Pro-Cys)。此段的以上步驟循環(huán)進(jìn)行(不同之處在于:只是每次需采用對(duì)應(yīng)的被Fmoc進(jìn)行氨基保護(hù)的氨基酸)直至多肽序列Ac-EC (Me) KFTVKPYIKRFQLYYKGRMWC (Me) P-NH2合成完畢，其中合成過(guò)程中所用的半胱氨酸C殘基為甲基化修飾的半胱氨酸C(Me),最后得到約20mg的線性合成多肽。
[0050]2)多肽純化和鑒定
[0051 ] 用50mL切肽試劑三氟乙酸:苯甲硫醚:苯酚:乙二硫醇:雙蒸水(體積比82.5:5:5:2.5:5)將合成的20mg線性多肽從載體樹(shù)脂上裂解下來(lái)，2小時(shí)后，加入4°C預(yù)冷的乙醚100ml使多肽沉淀，離心收集沉淀物，并用乙醚洗滌3遍，真空抽干，得到的多肽粗品經(jīng)反向液相色譜純化，純化后的多肽凍干后進(jìn)行HPLC純度檢測(cè)(圖3)和質(zhì)譜鑒定(圖4)。檢測(cè) HPLC 色譜柱為 250*4.6mm, Kromasi1-C18-5 μ m ;流動(dòng)相 A:0.1%TFA/ 乙腈,流動(dòng)相 B:0.1%TFA/H20 ;線性洗脫梯度:15%A-100%A ;流速為lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ;—次進(jìn)樣量為10 μ I。HPLC和MS檢測(cè)結(jié)果顯示，合成多肽G的純度為95.76%，分子量為3158.84，與預(yù)測(cè)分子量(3154.82)基本一致。
[0052]3)病毒中和實(shí)驗(yàn)
[0053]按實(shí)施例抑菌試驗(yàn)步驟用PBS溶解合成多肽G，用終濃度50 μ mol/L的合成多肽在室溫下與WSSV (white spot syndrome virus,白斑綜合癥病毒)孵育2h ;用相同濃度的無(wú)關(guān)多肽(相同長(zhǎng)度的綠色熒光蛋白GFP肽段)作為陰性對(duì)照在相同條件下孵育WSSV，孵育后的WSSV分別注射脊尾白奸(Exopalaemon carinicauda),每尾奸的注射量為IO4拷貝WSSV粒子；注射24h后取脊尾白蝦游泳足，采用天根生化科技有限公司的DNA提取試劑盒(貨號(hào):DP324)提取總DNA ;梯度稀釋W(xué)SSV作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用WSSV拷貝數(shù)檢測(cè)引物對(duì)VP28rF(5，-AAACCTCCGCATTCCTGTGA-3’)和 VP28rR (5，-TCCGCATCTTCTTCCTTCAT-3’)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品`和待測(cè)對(duì)蝦DNA樣品中VP28基因的表達(dá)量(詳細(xì)檢測(cè)方法參考文獻(xiàn):Yumiao Sun, Fuhua Li, Jianhai Xiang.Analysis on the dynamic changes ofthe amount of WSSV in Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis during infection.Aquaculture2013; 376-379:124-132.)，然后換算成待測(cè)對(duì)蝦DNA樣品中WSSV的拷貝數(shù)。
[0054]結(jié)果表明，合成多肽G處理組的WSSV拷貝數(shù)為5.07 X 103/ng DNA,而GFP陰性對(duì)照組的WSSV拷貝數(shù)為1.50 XioVng DNA，處理組中WSSV的拷貝數(shù)明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明合成多肽G具有明顯的抗病毒活性。
[0055]該多肽G的發(fā)現(xiàn)及生物活性鑒定，在新型抗病毒藥物的開(kāi)發(fā)上具有重要的應(yīng)用前
旦
-5^ O
【權(quán)利要求】
1.一種線性的合成多肽G，其特征在于:具有序列列表中SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的線性的合成多肽G，其序列特征在于:SEQID N0.1:Ac-EC(Me)KFTVKPYIKRFQLYYKGRMWC(Me)P-NH2。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的線性的合成多肽G，其結(jié)構(gòu)特征為: 所述的線性的合成多肽G氨基酸序列中的兩個(gè)半胱氨酸C殘基為甲基化(Me)修飾的半胱氨酸殘基C (Me)。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的線性的合成多肽G，其特征在于:所述的線性的合成多肽G衍生自中國(guó)明對(duì)蝦抗脂多糖因子ALFFc的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
5.按照權(quán)利要求4所述的線性的合成多肽G，其特征在于:所述的中國(guó)明對(duì)蝦抗脂多糖因子ALFFc的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有序列列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，具體為:ECKFTVKPYIKRFQLYYKGRMWCP。
6.一種權(quán)利要求1-4任一所述線性的合成多肽G的應(yīng)用，其特征在于: 所述線性的合成多肽G對(duì)病毒的增殖具有抑制作用，其可用于抗病毒的制劑中。
7.按照權(quán)利要求6所述線性的合成多肽G的應(yīng)用，其特征在于: 所述線性的合成多肽G可作為抗病毒的活性成份，用于制備抗病毒的藥物或制劑中。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK103554232SQ201310534388
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月1日
【發(fā)明者】李富花, 李詩(shī)豪, 郭書(shū)悅, 相建海 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所