中藥復方藥物組合物的新用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了含有下述重量配比的原料藥在制備用于輔助生殖的藥物中的用途：川牛膝1-16份、龜板膠1-16份。本發(fā)明還提供了一種促卵母細胞體外成熟的方法，它包括如下步驟：a、取未成熟卵母細胞；b、置于M199培養(yǎng)液中，采用微滴法培養(yǎng)24h，即得成熟卵母細胞；其中培養(yǎng)液中含有2%的藥物。本發(fā)明藥物體外可以促進未成熟卵母細胞生長發(fā)育，主要是促進卵母細胞核成熟，并且不增加成熟卵母細胞的細胞骨架異常的幾率。本發(fā)明藥物還可以對精子穿卵能力產(chǎn)生影響，為臨床防治男性精子功能障礙，提高IVF成功率，減少ICSI的使用率，提供可靠的依據(jù)。
【專利說明】中藥復方藥物組合物的新用途
[0001]本申請是專利申請?zhí)?201210292197.1的分案申請。原案申請?zhí)枮?201210292197.1，申請日為:2012年8月16日，發(fā)明名稱:中藥復方藥物組合物的新用途。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種中藥復方藥物組合物的新用途，具體地，是在制備用于輔助生殖的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0003]近年來，由于環(huán)境污染嚴重、工作壓力加大、飲食習慣改變、生殖系統(tǒng)疾病等因素對正常受孕造成不利影響，不孕癥患者數(shù)量呈上升勢頭，發(fā)病率約為12.5%~15%，且有逐年增加趨勢。因此世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布將不孕癥與心血管病、腫瘤并列為當今影響人類生活和健康的三大主要疾病。
[0004]自1978年全球首例試管嬰兒誕生以來，以體外授精-胚胎移植(IVF-ET)為代表的輔助生殖技術(shù)(ART)的引入給不孕不育癥的成功治療提供了更大的可能。助孕的相關(guān)研究對于解決不孕不育患者的實際問題具有現(xiàn)實的意義。IVF-ET俗稱試管嬰兒，其成功率(指臨床妊娠率)還不太令人滿意，一般為30%~40%[1]，并且容易造成卵巢過度刺激綜合征(0HSS)。此外，一些卵巢反應(yīng)低下或卵子成熟障礙的患者如多囊卵巢綜合征(PC0S)、卵巢早衰(P0F)，還有一些不能接受超排卵治療如乳腺癌、卵巢癌術(shù)后的患者，仍無法解決生育問題。因而，卵母細胞的體外成熟(IVM)作為IVF-ET的衍生新興技術(shù)之一日益受到關(guān)注。與傳統(tǒng)的IVF相比，IVM避免了 OHSS的發(fā)生。此外，容易獲得的未成熟卵母細胞，還可為卵母細胞捐供提供來源。然而IVM目前仍存在很多亟待解決的問題，包括卵母細胞成熟率低、受精率低等。ICSI (Intracyt oplasmic sperm injection)即卵胞衆(zhòng)內(nèi)單精子注射技術(shù),也就是第二代“試管嬰兒”，該技術(shù)是借助顯微操作系統(tǒng)將單一精子注射入卵子內(nèi)使其受精。該技術(shù)僅需數(shù)條精子可以達到受精、妊娠，是嚴重男性因素不育患者的最有效治療方法。
[0005]補腎中藥介入輔助生殖技術(shù)，具有調(diào)經(jīng)、助孕、促卵泡發(fā)育及排卵、提高卵細胞質(zhì)量以及提高卵子受精率、促進早期胚胎發(fā)育的作用[2_5]，已得到證實。補腎中藥的上述作用與激素、細胞因子等因素有關(guān)[6_9]。目前在輔助生殖技術(shù)中與補腎中藥聯(lián)系較為緊密的環(huán)節(jié)主要是超促排卵和胚胎移植。研究主要以卵細胞質(zhì)量體外受精及胚胎發(fā)育[5，11]、子宮內(nèi)膜容受性[I15]為切入點。補腎中藥對卵母細胞體外成熟的影響研究尚未見報道。
[0006]生殖激素是哺乳動物卵母細胞成熟的基本調(diào)節(jié)物。卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)和雌二醇(E2)是常用激素。孕馬血清促性腺激素(PMSG)也能使卵母細胞體外成熟。哺乳動物卵母細胞成熟通常分為核和胞質(zhì)的成熟:核成熟通常以卵母細胞的第一極體排出為代表而胞質(zhì)成熟則主要指卵母細胞具有受精能力及相應(yīng)的早期胚胎發(fā)育能力。(I) FSH0FSH在早期卵泡體外發(fā)育中起到了關(guān)鍵作用，在卵母細胞體外成熟中促進核及胞質(zhì)的成熟，對于卵裂及囊胚的發(fā)育有積極作用。人未成熟卵-冠-丘復合物(OCCCs)中的顆粒細胞上可以檢測到FSH受體mRNA的存在。FSH和LH對在不含血清的TCM199中的卵母細胞體外成熟有顯著影響，卵丘細胞的擴張受劑量依賴的FSH和LH的濃度的影響，在體內(nèi)卵丘細胞的擴張有利于精子穿透、受精和合子發(fā)育。FSH以環(huán)腺苷酸(cAMP)作為細胞內(nèi)第二信使，通過影響卵母細胞和卵泡中cAMP的濃度控制未成熟卵母細胞的核成熟和減數(shù)分裂的恢復。FSH對哺乳動物卵母細胞核和胞質(zhì)的成熟均有作用，主要調(diào)節(jié)卵母細胞核成熟。FSH的最佳作用劑量為100IU/L。(2)E2。研究證實，卵泡液中留體類激素的存在對卵母細胞成熟至關(guān)重要。雌激素在多種哺乳動物中能促進卵母細胞的體外成熟。一定濃度的17 P-E2有促進卵細胞胞質(zhì)成熟的作用，有利于受精和胚胎進一步發(fā)育，但濃度過高則會降低受精及卵裂能力。E2可保持卵母細胞減數(shù)分裂停滯，從而使細胞核及胞漿成熟同步化，有利于卵母細胞的發(fā)育。另外，在卵母細胞內(nèi)有E2受體，說明E2可以直接與卵母細胞結(jié)合，調(diào)節(jié)卵母細胞胞質(zhì)成熟。E2的最佳作用劑量為lmg/L或1.5mg/L。但E2是類固醇激素，一般須要溶于特殊溶劑如二甲基亞砜(DMSO)或乙醇?？紤]到DMSO有一定的細胞毒性，卵細胞對乙醇比較敏感，這兩種溶劑的濃度不易控制，加之前期預實驗也證實了這一點，故不采用E2作為陽性對照品。(3)PMSG。孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotrophin, PMSG)是取自早期妊娠馬血清中的糖蛋白促性腺激素，是由孕馬子宮內(nèi)膜杯狀細胞合成分泌到血液中的糖蛋白性激素，兼有卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)的作用，類似于人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)。孕馬血清促性腺激素(PMSG)能使卵母細胞體外成熟。其最佳作用劑量在牛為40和50IU/mL，在狗為100IU/mL。目前還未見PMSG在小鼠卵母細胞體外成熟中的應(yīng)用報道。(4)目前尚無其它公認的促卵母細胞體外成熟的藥物面世。
[0007]左、右歸丸出自明代溫補名家張景岳的《景岳全書?新方八陣》，為補益腎陰、腎陽的經(jīng)典方，臨床上均可用于治療女性絕經(jīng)前后諸癥。左歸丸治療圍絕經(jīng)期綜合征，可消除烘熱汗出、煩躁易怒、口干咽燥等癥狀，能增加陰道分泌物，改善外陰、陰道干澀癥狀，對雌激素不足的閉經(jīng)也有較好的療效(朱玲，陳彬彬，黃泉智，等.左歸丸臨床與實驗研究進展[J].國醫(yī)論壇，2003，18(2):51-53。)“左歸丸”治真陰腎水不足，不能滋養(yǎng)營衛(wèi)，漸至衰弱，或虛熱往來，自汗盜汗，或神不守舍，血不歸原，或虛損傷陰，或遺淋不禁，或氣虛昏運，或眼花耳聾，或口燥舌干，或腰酸腿軟，凡精髓內(nèi)虧，津液枯涸等證，俱速宜壯水之主，以培左腎之元陰，而精血自充矣,宜此方主之?！坝覛w丸”治元陽不足，或先天稟衰，或勞傷過度，以致命門火衰，不能生土，而為脾胃虛寒，飲食少進，或嘔惡膨脹，或番胃噎膈，或怯寒畏冷，或臍腹多痛，或大便不實，瀉痢頻作，或小水自遺，虛淋寒疝，或寒侵溪谷而肢節(jié)痹痛，或寒在下焦而水邪浮腫?？傊骊柌蛔阏?，必神疲氣怯，或心跳不寧，或四體不收，或眼見邪祟，或陽衰無子等證，俱速宜益火之原，以培右腎之元陽，而神氣自強矣，此方主之。目前，有文獻報道左、右歸丸用于治療不孕癥，如:楊麗影，右歸丸在婦科疾病中的應(yīng)用體會，《河北中醫(yī)》，2001年23卷8期，張君滿，左歸丸加減在婦科疾病中的應(yīng)用，《四川中醫(yī)》，2007年25卷5期；韋艷萍，等，左歸丸治療黃體功能不健不孕癥的臨床研究，《現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志》，2010年19卷32期，方云蕓，等，右歸丸對雄激素致排卵障礙型不孕大鼠血清E2、T和IGF-1的水平影響，《環(huán)球中醫(yī)藥》，2010年3卷3期等。但是將左右歸丸用于輔助生殖，如卵母細胞的體外成熟(IVM)技術(shù)方面，目前尚無相關(guān)文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種中藥復方藥物組合物的新用途。具體地，是在制備用于輔助生殖的藥物中的用途。
[0009]本發(fā)明提供了含有下述重量配比的原料藥在制備用于輔助生殖的藥物中的用途:熟地18-30份、山茱萸9-12份、山藥8-16份、枸杞子9-12份、菟絲子8_16份、鹿角膠8_16份。
[0010]本發(fā)明還提供了含有下述重量配比的原料藥在制備用于輔助生殖的藥物中的用途:川牛膝1-16份、龜板膠1-16份。進一步優(yōu)選地，所述的原料藥的重量配比為:川牛膝9份、龜板膠12份。
[0011]本發(fā)明還提供了含有下述重量配比的原料藥在制備用于輔助生殖的藥物中的用途:杜仲1-16份、肉桂1-9份、當歸1-16份、制附子1-16份。
[0012]進一步優(yōu)選地，所述的原料藥的重量配比為:杜仲12份、肉桂6份、當歸9份、制附子6份。
[0013]其中，所述的藥物是促卵母細胞體外成熟的藥物。
[0014]其中，所述的藥物是治療不孕癥的藥物。
[0015]其中，所述的藥物是提高精子活力或精子受精能力的藥物。
[0016]其中，所述藥物是由下述重量配比的原料藥制備而成的藥劑:
[0017]熟地24份、山茱萸9-12份、山藥12份、枸杞子9_12份、菟絲子12份、鹿角膠12份。其中，所述的原料藥中還含有川牛膝9份、龜板膠12份。
[0018]進一步優(yōu)選地，所述的藥物是由下述重量配比的原料藥制備而成:
[0019]熟地24份、山茱萸12份、山藥12份、枸杞子12份、菟絲子12份、鹿角膠12份、川牛膝9份、龜板膠12份。
[0020]其中，所述的原料藥中還含有杜仲12份、肉桂6份、當歸9份、制附子6份。進一步優(yōu)選地，所述的藥物是由下述重量配比的原料藥制備而成:
[0021]熟地24份、山茱萸9份、山藥12份、枸杞子9份、菟絲子12份、鹿角膠12份、杜仲12份、肉桂6份、當歸9份、制附子6份。
[0022]本發(fā)明還提供了一種促卵母細胞體外成熟的方法，它包括如下步驟:
[0023]a、取未成熟卵母細胞；
[0024]b、置于含藥血清的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，即得成熟卵母細胞；其中血清中含有2%的權(quán)利要求1-13任意一項所述的藥物。
[0025]體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)中獲得適當多數(shù)目、高質(zhì)量的卵子是達到妊娠的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，通常需要采用控制性超排卵(COH)來實現(xiàn)。但是，COH始終存在不可忽視的安全性問題，容易造成卵巢過度刺激綜合征(0HSS)。一些卵巢反應(yīng)不良、卵子成熟障礙或不能接受COH的患者仍無法解決生育問題，可通過IVF-ET的衍生新興技術(shù)之一一卵母細胞的體外成熟(IVM)技術(shù)獲得妊娠。
[0026]本發(fā)明是將補腎中藥復方左右歸丸及其拆方組份用于促進卵母細胞體外成熟，具有重要意義，可以從一個側(cè)面反應(yīng)中醫(yī)調(diào)經(jīng)種子理論在輔助生殖技術(shù)中的指導價值，進而為試管嬰兒領(lǐng)域開拓新思路、新途徑，用于配合卵母細胞IVM技術(shù)治療不孕癥，有助于拓展ART的應(yīng)用空間。本發(fā)明藥物體外可以促進未成熟卵母細胞生長發(fā)育，主要是促進卵母細胞核成熟，并且不增加成熟卵母細胞細胞骨架的異常幾率。本發(fā)明藥物對精子穿卵能力產(chǎn)生影響，為臨床應(yīng)用防治男性精子功能障礙，提高IVF成功率，減少ICSI的使用率，提供可靠的實驗室依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1:含藥鼠血清對體外成熟卵母細胞Cyclin BlmRNA表達的影響
[0028]圖2:圖2A體內(nèi)受精百分率；圖2B體外培養(yǎng)3天后囊胚生成百分率
[0029]圖3:體外受精百分率
[0030]圖4:圖4A兩組完整頂體百分率圖4B頂體酶活性檢測【具體實施方式】
[0031]實施例1本發(fā)明藥物組合物I的制備(左歸丸)
[0032]稱取原料:熟地黃200g、菟絲子100g、牛膝75g、龜板膠100g、鹿角膠100g、山藥100g、山茱萸100g、枸杞子100g ；
[0033]制備方法:以上八味，除鹿角膠、龜板膠外，其余熟地黃等六味粉碎成細粉，過篩混勻。取鹿角膠、龜板膠烊化，與上述細粉混勻。每100g粉末加煉蜜IOg與適量的水，泛丸，干燥，即得；或不加蜜，僅為粉末散劑。
[0034]實施例2本發(fā)明藥物組合物2的制備(右歸丸)
[0035]稱取原料:熟地黃24g、山藥12g、山茱萸9g、枸杞子9g、菟絲子12g、鹿角膠12g、杜仲12g、肉桂6g、當歸9g、制附子6g。
[0036]制備方法:將熟地蒸爛杵膏，余為細末，烘干密封保存，兌水服用，或加煉蜜為丸，如彈子大。每嚼服二三丸(6~9g)，以滾白湯送下。
[0037]實施例3本發(fā)明藥物的制備
[0038]稱取原料:熟地24g、山茱萸 12g、山藥12g、枸杞子12g、菟絲子12g、鹿角膠12g ；
[0039]制備方法:以上六味，除鹿角膠外，其余熟地黃等六味粉碎成細粉，過篩混勻。取鹿角膠烊化，與上述細粉混勻，烘干密封保存，兌水服用，或每100g粉末加煉蜜IOg與適量的水。
[0040]實施例4本發(fā)明藥物的制備
[0041]稱取原料:熟地24g、山茱萸9g、山藥12g、枸杞子9g、英絲子12g、鹿角膠12g ；
[0042]按實施例3方法制備。
[0043]實施例5本發(fā)明藥物的制備
[0044]稱取原料:熟地18g、山茱萸9g、山藥8g、枸杞子9g、英絲子8g、鹿角膠8g ;按實施例3方法制備。
[0045]實施例6本發(fā)明藥物的制備
[0046]熟地30g、山茱萸12g、山藥16g、枸杞子12g、英絲子16g、鹿角膠16g,按實施例3
的方法制備。
[0047]實施例7本發(fā)明藥物的制備
[0048]取川牛膝9g、龜板膠12g，按實施例1的方法制備。
[0049]實施例8本發(fā)明藥物制備
[0050]取杜仲12g、肉桂6g、當歸9g、制附子6g，按實施例3的方法制備。
[0051]上述原料可以用原生藥,也可以用原生藥的炮制品。[0052]以下是通過藥效實驗及臨床實驗證明本發(fā)明的有益效果。
[0053]試驗例I本發(fā)明藥物促卵母細胞體外成熟實驗
[0054]1、材料與方法
[0055]1.1實驗材料
[0056]1.1.1實驗動物
[0057]清潔級ICR雌性小白鼠，6~8周齡，體重22~26g，90只，清潔級ICR雄性小白鼠，8~10周齡，體重30~35g，6只，分批次購自四川省醫(yī)學科學院四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所，許可證號:SCXK(川)2006-18。二級實驗室，室溫為22~250C，濕度為45~65%，照明晝夜明暗交替時間為12:12，分籠喂養(yǎng)。
[0058]1.1.2實驗藥物
[0059]高效液相色譜(HPLC)監(jiān)測制備含左右歸丸及其拆方組份的鼠血清1#、2#、3# (其中1#組為實施例3、2#組為實施例7、3#組為實施例8)。
[0060]陽性對照品:r-hFSH:75IU, Laboratoires Serono S.A., Y11A9874
[0061]主要試劑:孕馬血清促性腺激素(PMSG)寧波市三生藥業(yè)有限公司獸藥字(2007)110044564 ；M199GIBC0 Lot: n0.507765 ;牛血清白蛋白(BSA) Sigma2039B054、透明質(zhì)酸酶Sigma H3506、無水乙醇、三氯甲燒、異丙醇、瓊脂糖、Tris-醋酸(Tris-acetate, TAE)、GoldView、焦憐酸二乙酯(die thyl pyrophosphate, DEPC)處理水等。
[0062]含藥鼠血清的制備:
[0063]分別取實施例1和實施例2制備的左歸丸、右歸丸原料藥，按標準方法加水煎煮，于4°C貯存。將制備的湯劑喂服小鼠14天，取血；血清通過HPLC檢測含有左歸丸或右歸丸的活性成分。含藥血清貯存于_80°C備用。
[0064]1.1.3主要儀器設(shè)備與耗材:
[0065]AIR-TECH 超凈工作臺、MiIIipore 純水儀、HERAEUS BB5060 培養(yǎng)箱、Olymbus SZX9體視顯微鏡、TOKAI HIT體視鏡用玻璃恒溫板、Olymbus CK40倒置顯微鏡、Olymbus BX51反射熒光顯微鏡等。
[0066]1.2實驗方法
[0067]1.2.1小鼠未成熟卵母細胞的采集
[0068]小鼠處死前46~48h腹腔注射10IU PMSG / 0.1mL /只，頸椎脫臼處死后，置于清潔托盤中，75%乙醇棉球擦拭消毒腹部，打開腹腔，取出卵巢，去除脂肪、輸卵管組織等附著物后放入盛有操作液的培養(yǎng)皿中，立即送至超凈工作臺。在解剖顯微鏡下，用Iml注射器針頭剔除卵巢周圍的脂肪結(jié)締組織，用操作液洗滌卵巢3次。用Iml注射器針頭刺破卵巢表面的卵泡，輕輕擠壓使丘細胞一卵母細胞復合體(COCs)溢出，并用吸卵管吸取。最后移入覆蓋石蠟油經(jīng)預平衡后的微滴培養(yǎng)液中，準備體外成熟培養(yǎng)(IVM)。
[0069]1.2.2實驗分組及觀測指標
[0070]245個未成熟COCs體外成熟培養(yǎng)，分為空白組(在M199培養(yǎng)液中未添加鼠血清)、空白鼠血清組(在M199培養(yǎng)液中添加了 2%空白鼠血清)、含藥鼠血清1#、2#、3# (在M199培養(yǎng)液中分別添加了 2%含本發(fā)明藥物鼠血清1#、2#、3#)，共五組，體視顯微鏡和倒置顯微鏡下計數(shù)觀察本發(fā)明藥物對小鼠卵母細胞體外成熟的影響。
[0071 ] 約238個未成熟COCs體外成熟培養(yǎng)，分為空白組、FSH組(在M199培養(yǎng)液中添加了100IU/L FSH)、空白鼠血清組、含藥鼠血清1#組四組，實驗分四批進行，第一批，顯微鏡計數(shù)觀察本發(fā)明藥物對小鼠卵母細胞體外成熟、受精及卵裂的影響，重復3次實驗。第二批，免疫熒光標記法結(jié)合熒光檢測儀觀察并定量分析本發(fā)明藥物對體外培養(yǎng)小鼠卵母細胞MPF調(diào)節(jié)亞基Cyclin BI表達的影響。第三批，免疫熒光標記法結(jié)合反射熒光顯微鏡觀察本發(fā)明藥物對體外培養(yǎng)小鼠卵母細胞細胞骨架(紡錘體、染色體)的影響。第四批，半定量RT-PCR法觀察本發(fā)明藥物對體外培養(yǎng)小鼠卵母細胞MPF調(diào)節(jié)亞基Cyclin BlmRNA的表達的影響。
[0072]上述未成熟卵母細胞即為初級卵母細胞。
[0073]1.2.3卵母細胞成熟率的測定
[0074]將礦物液滴入培養(yǎng)液上，各組丘細胞一卵母細胞復合體(COCs)于37°C、5%C02下微滴法培養(yǎng)24h后，用100IU / ml透明質(zhì)酸酶溶液處理5min，用口徑略大于卵母細胞直徑的吹卵管反復吹打卵丘細胞-卵母細胞復合體(cumulus oocyte complexes, COCs) Imin去除顆粒細胞，使之成為裸卵(denuded oocyte, DO)。顯微鏡下觀察卵母細胞形態(tài)，以生發(fā)泡破裂(GVBD)作為減數(shù)分裂啟動的標志，第一極體排出(PBl)作為第一次減數(shù)分裂完成的標志即卵母細胞核成熟標志。分別計算GVBD發(fā)生率、PBl排出率和GVBD+PB1發(fā)生率。
[0075]GVBD發(fā)生率=GVBD個數(shù)/卵母細胞總數(shù)
[0076]PBl排出率=PBl個數(shù)/卵母細胞總數(shù)
[0077]GVBD+PB1發(fā)生率=GVBD+PB1個數(shù)/卵母細胞總數(shù)
[0078]所述的成熟卵母細胞即為次級卵母細胞。
[0079]1.2.4小鼠精子的采集及處理
[0080]ICR雄性小白鼠， 周齡8~10周，體重30~35g，頸椎脫臼法處死，取附睪置于培養(yǎng)液中，用眼科剪剪開或注射針針頭刺破附睪并輕輕擠壓使精子釋出，將精子連同培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)板內(nèi)，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)I~2h。將培養(yǎng)獲能后的精子計數(shù)并調(diào)整濃度至I X IO6個/ mL~5 X IO6個/ mL。按精:卵比約為10000:1的比例將精子加入含有卵母細胞的培養(yǎng)液中繼續(xù)孵育5~6h。顯微鏡下觀察卵母細胞的形態(tài)，以出現(xiàn)2個原核(2PN)和第二極體為正常受精標志，計算受精率。24h后觀察受精卵卵裂及早期胚胎發(fā)育情況。
[0081 ] 受精率=受精卵個數(shù)/PBl個數(shù)
[0082]卵裂率=卵裂球個數(shù)/受精卵個數(shù)
[0083]1.2.5免疫突光標記法
[0084]免疫染色前將卵母細胞在0.3%B-PBS液中洗滌3次，每次5min，4%多聚甲醛37°C固定Ih ;固定好的卵母細胞在0.3%B-PBS液中洗滌3次，0.5%Triton-10037°C下作用15min后，0.3%B-PBS液洗滌3次，P/oB-PBS液封閉Ih ;再在0.3%B-PBS液洗滌3次，在清洗間隙即可用0.3%B-PBS稀釋一抗(1: 100)，并做成液滴，清洗好卵母細胞之后，將其置于加入一抗的PBS液滴中，放入暗濕盒，然后4°C孵育過夜；第二天用0.3%B-PBS液滴清洗卵母細胞3次，每次5min，同樣在清洗間隙用0.3%B-PBS稀釋二抗(FITC-山羊抗兔IgG) (1:100)，并做滴，然后將卵母細胞置于加入二抗的PBS液滴中，放入暗濕盒，37°C下孵育lh。
[0085]二抗染色完成后，若要觀察染色體則用含0.3%B-PBS清洗3次，用PI復染。
[0086]用0.3%B-PBS液洗滌3次，將卵母細胞在體視鏡下吸出，滴在載玻片上，吸去多余液體，再用甘油與PBS(9:1)及含抗熒光淬滅劑的混合液封片，反射熒光顯微鏡下觀察卵母細胞的熒光著色情況。
[0087]上述所有的清洗環(huán)節(jié)、抗體孵育和染色步驟均是在液滴中完成的，液滴做在培養(yǎng)皿中。
[0088]1.2.6熒光定量分析MPF調(diào)節(jié)蛋白B的表達強度:
[0089]免疫熒光染色步驟同1.2.5，二抗染色完成后，用PBS液洗滌3次，將卵母細胞在體視鏡下吸出，移至每孔預先滴有500 u I PBS液的24孔板內(nèi)，每組6孔，每孔8個卵母細胞，熒光定量檢測儀分析MPF調(diào)節(jié)蛋白BI的表達強度。
[0090]1.2.7卵母細胞細胞骨架的觀察方法
[0091]應(yīng)用免疫熒光標記法，在OLYMPUS BX51反射熒光顯微鏡下進行觀察。卵母細胞紡錘體分型:正常紡錘體:紡錘體呈對稱的桶型，且極性存在；異常紡錘體:紡錘體極性消失、縱軸上微管減少或斷裂、紡錘體消失、微管消散。
[0092]卵母細胞染色體分型:正常染色體:染色體緊密排列在赤道板；異常染色體:染色體結(jié)構(gòu)松散或凝結(jié)成團，從赤道板中脫落。
[0093]1.2.8RT-PCR檢測卵母細胞MPF調(diào)節(jié)亞基Cyclin BlmRNA的表達
[0094](I)卵母細胞總RNA的提取:未成熟卵母細胞200個，分為含藥鼠血清1#組和空白鼠血清組，每組100個，體外培養(yǎng)24h后，分別從對照組和含藥鼠血清1#組取出卵母細胞，透明質(zhì)酸酶去除卵丘細胞后，PBS洗兩次，采用Trizol法提取總RNA。
[0095](2)引物JhIiC yclin BI的特異片段為417bp，其引物序列參照文獻以Primer5.0軟件設(shè)計，其序列為:
[0096]5， -GTAATCCTTGCAGTGAGTGACG(525-546)；
[0097]5’ -CATCTCCATCTGTCTGATCTGG (920-941)。
[0098]以廣泛存在于細胞中的甘油醒-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogease, GAPDH)作為內(nèi)參照，其特異片段為321bp。
[0099](3)反應(yīng)體系:DEPC H2Ol.75 u I, Bufferl.25 u I, dNTPl.25 u l,MgCl22.5u I, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.25 u IjRAN酶抑制劑0.25111，了&9酶0.25 yl，正向及反向引物各0.5 yl，RNA樣品 1，總體積 12.1。反應(yīng)條件:50°C 30min,94°C 2min,隨后 94 °C 10s, 55 °C 10s,70°C 20s 重復 20 個循環(huán)，72°C 5min,擴增 GAPDH片段。50°C 30min, 90°C 2min,隨后 94°C 30s,56°C 30s, 68°C Imin 重復 40 個循環(huán)，72°C lOmin，擴增 Cyclin BI 片段。4°C保存。
[0100](4)結(jié)果檢測:PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外圖象掃描儀掃描并采用KODAK ID圖像分析軟件分析電泳帶的平均灰度并照相。結(jié)果以特異泳帶與GAPDH泳帶平均灰度的比值表示。
[0101]1.2.9 血清 FSH、E2 的測定
[0102]采用酶聯(lián)免疫法測定大鼠血清FSH、E2水平。嚴格按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明操作，于酶標儀450nm吸光度,讀取吸光度值(optical denstiy, 0D),根據(jù)標準品的濃度和OD值做出標準曲線，計算得出樣品中FSH、E2的濃度。
[0103]1.3統(tǒng)計學處理
[0104]以下所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理，均數(shù)比較采用t檢驗，率的比較采用卡方檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0105]2、結(jié)果[0106]2.1不同含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響
[0107]表1不同含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響
[0108]
卵母
試驗組細胞 PBl PB1% OVBD GVBD% GVBDi PB I (GVBDiPBI )%
_1?_
空白組48 8 16.672450.003266.67
空白鼠血清組48 11 22.922450.003572.92
本發(fā)明含藥血淸 I 組 52 22 42.31**tV 22 42.314484.62*
各發(fā)明含藥血淸 2 組 47 17 36.17* 2144.683880.85
本發(fā)明含藥血清 3 組 50 13 26.00_2652.0039_78.00_
[0109]注:與空白組比，*P < 0.05， **P < 0.01 ;與空白鼠血清組比，☆ P < 0.05
[0110]結(jié)果顯示，空白鼠血清、含藥鼠血清1#、2#、3#組均較空白組成熟率高；含藥鼠血清1#、2#、3#組均較空白鼠血清組成熟率高。GVBD+PB1，空白鼠血清、含藥鼠血清1#、2#、3#
組均較空白組高。
[0111]2.2含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響(重復3次實驗)結(jié)果見表2。
[0112]表2含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響
[0113]
試驗組卵母細胞數(shù) PBI PBI% GVBD GVBD% GVBD+PBI (fiVBD+PB I)%_TB 裂
空白組58 813.792746.553560.34I0
空白鼠血清組60 1423.331151.67 4575,004I
FSH 組69 2028.99*3449.285478.26*7I
本發(fā)明含藥血淸 I 組 59_;440.68**^2542.3749_83.05**_9I
[0114]注:與空白組比，*P < 0.05, **P < 0.01 ;與空白鼠血清組比，< 0.05
[0115]結(jié)果顯示，空白鼠血清、FSH、含藥鼠血清1#組均較空白組成熟率高。FSH、含藥鼠血清1#組均較空白鼠血清組成熟率高，空白鼠血清、FSH、含藥鼠血清1#組均較空白組高。
[0116]2.3含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響，結(jié)果見表3。
[0117]表3含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響
[0118]


受
寧白鉬卵母細胞數(shù) PBl PB1% t VBD GVBD GVBD+PB1 (GVBD+PBl)% 蝕卵裂_fc_
宇6 S
T:,T； ?5811 18.97 27 46.553865.222 0
血清組
FSHdi5612 21.43 27 48.213969.644 I
本發(fā)明
含藥血5620 35.71* 26 46.434682.14* 6 I
清I組
空白組_62 24 3K 71崎 28 45.16_52_83.87* 9 3
[0119]注:與空白組比，*P < 0.05 ;與空白鼠血清組比，< 0.05
[0120]結(jié)果顯示，空白鼠血清、FSH、含藥鼠血清1#組均較空白組成熟率高。FSH、含藥鼠血清1#組均較空白鼠血清組成熟率高。GVBD+PB1，空白鼠血清、FSH、含藥鼠血清1#組均較空白組高。[0121]2.4含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響，結(jié)果見表4。
[0122]表4含藥鼠血清對卵母細胞體外成熟的影響3-1
【權(quán)利要求】
1.含有下述重量配比的原料藥在制備用于輔助生殖的藥物中的用途:川牛膝1-16份、龜板膠1-16份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于:所述的原料藥的重量配比為:川牛膝9份、龜板膠12份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述的藥物是促卵母細胞體外成熟的藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述的藥物是治療不孕癥的藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述的藥物是提高精子活力或精子受精能力的藥物。
6. 一種促卵母細胞體外成熟的方法，它包括如下步驟: a、取未成熟卵母細胞； b、置于含藥血清的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，即得成熟卵母細胞；其中血清中含有2%的權(quán)利要求1_13任意一項所述的藥物。
【文檔編號】A61K35/56GK103479690SQ201310444946
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月23日
【發(fā)明者】陸華, 高小平, 劉志斌 申請人:成都中醫(yī)藥大學