人工抗菌肽ma-d4的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及人工抗菌肽MA-D4的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明人工設(shè)計(jì)出人工抗菌肽MA-D4的氨基酸序列，并采用大腸桿菌偏好性密碼子設(shè)計(jì)編碼該抗菌肽的核苷酸序列；采用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法合成目的基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21或Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)腸激酶酶切處理和鎳離子親和層析純化后，即可獲得本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4。該抗菌肽具備較強(qiáng)的廣譜抗菌活性，可抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌，同時(shí)不具有溶血活性。因此，其可作為一類新型抗菌藥物，在食品防腐、疾病治療等方面具有良好的應(yīng)用前景，極具開發(fā)潛力。本發(fā)明制備方法表達(dá)效率高，分離純化簡單，生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性好，可應(yīng)用于規(guī)模化生產(chǎn)。
【專利說明】人工抗菌肽MA-D4的制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及人工抗菌肽MA-D4的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]抗生素長期在臨床治療上廣泛地不恰當(dāng)應(yīng)用，使得許多病原菌產(chǎn)生了明顯耐藥性，現(xiàn)已成為威脅人類和動(dòng)物健康的重大問題。更為嚴(yán)重的是臨床上出現(xiàn)了多重耐藥菌株，2010年發(fā)現(xiàn)的超級(jí)病菌NDM-1更是對(duì)絕大多數(shù)抗生素均不敏感。目前，開發(fā)一種新的抗生素一般需要10年左右，而產(chǎn)生一代耐藥菌只需2年?？垢腥拘蝿?shì)非常嚴(yán)峻，開發(fā)設(shè)計(jì)新型抗菌藥物已迫在眉睫。
[0003]抗菌肽是一類由宿主產(chǎn)生的能夠抵抗外界病原體感染的小分子多肽，是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，由特定基因編碼產(chǎn)生。其生物功能具有多樣性，除了具備廣譜抗菌活性外，還具備抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲等生物活性?？咕膹V泛存在于各種生物體內(nèi)，在微生物、植物和動(dòng)物中均有發(fā)現(xiàn)并成功分離獲得。在適當(dāng)?shù)臐舛认?，抗菌肽能夠與生物膜/壁組成成分或胞內(nèi)細(xì)胞器等多種微生物靶位相互作用，前者破壞細(xì)胞質(zhì)膜的完整性，后者干擾細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。更重要的是抗菌肽能作為免疫效應(yīng)分子，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)宿主免疫防御體系，保護(hù)宿主免受病原微生物侵害?？咕莫?dú)特的作用機(jī)理，使得其具有抗菌譜廣泛、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，且對(duì)目前已產(chǎn)生耐藥性的菌株同樣可發(fā)揮作用。因此，抗菌肽或能替代傳統(tǒng)抗生素藥品，扭轉(zhuǎn)抗生素應(yīng)用的惡性循環(huán)，是一類具備廣闊的市場(chǎng)前景和發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬铩?br> [0004]蛙類皮膚裸露、潮濕，是極好的微生物生存環(huán)境，但蛙類基于適應(yīng)生存環(huán)境的需要，在長期的自然選擇中，逐漸形成了防御機(jī)制，即由皮膚分泌多種結(jié)構(gòu)特殊、功能多樣的抗菌肽類物質(zhì)，用以抵抗病原微生物的侵襲。從非洲爪蛙皮膚上發(fā)現(xiàn)的爪蟾抗菌肽Magainin，具有23個(gè)氨基酸殘基，分子量約為2.5kD。其天然分離物在微克分子濃度下即可對(duì)多種細(xì)菌、真菌、原生生物、腫瘤細(xì)胞和病毒表現(xiàn)出殺傷作用。從葉泡蛙皮膚上發(fā)現(xiàn)的抗菌肽Dermaseptin-4,同樣具有23個(gè)氨基酸殘基,分子量約為2.5kD。其天然分離物可對(duì)多種細(xì)菌、真菌和原生生物表現(xiàn)出殺傷作用，尤其是致病性絲狀真菌和酵母菌。
[0005]生物體內(nèi)抗菌肽含量較低，直接提取的工藝要求高，難度大，無法應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)。人工化學(xué)合成雖可獲得與天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但是常常不能形成正確的空間結(jié)構(gòu)，且因存在昂貴的成本，使其目前僅停留在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)階段。通過基因工程途徑合成人工抗菌肽是規(guī)?；a(chǎn)制備的理想選擇。除此之外，天然抗菌肽的生物活性不強(qiáng)、存在細(xì)胞毒性和溶血活性使其推廣應(yīng)用受到一定的限制。研究表明，雜合不同抗菌肽分子可以有效改善其生物活性，消除或降低其細(xì)胞毒性和溶血活性。迄今尚無將抗菌肽Magainin和Dermaseptin-4雜合并進(jìn)行高效表達(dá)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有天然抗菌肽生物活性低，且存在溶血活性的問題，提供一種具有高生物活性、無溶血活性的人工抗菌肽MA-D4，以及適用于規(guī)?；a(chǎn)的基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高效制備方法，同時(shí)提供人工抗菌肽MA-D4針對(duì)多種細(xì)菌的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
[0008]根據(jù)GenBank 中的抗菌妝 Magainin (N0.474452717)和 Dermaseptin-4 (N0.P84924.1)成熟肽氨基酸序列，人工設(shè)計(jì)出本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4的氨基酸序列SEQ IDN0.1，采用大腸桿菌偏好性密碼子設(shè)計(jì)編碼該抗菌肽的核苷酸序列，并在兩端分別添加核酸限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，形成目的基因序列SEQ ID N0.2。
[0009]采用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法合成上述目的基因。設(shè)計(jì)兩兩互補(bǔ)的4條PCR引物，所述引物 P1、P2、P3 和 P4 分別具有 SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列，通過多步PCR獲得目的基因。
[0010]將獲得的目的基因與原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21或Rosetta中，篩選基因工程陽性菌。添加IPTG誘導(dǎo)基因工程菌表達(dá)，超聲波裂解菌體后進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)蛋白表達(dá)量。
[0011]使用腸激酶酶切處理表達(dá)產(chǎn)物后，通過鎳離子親和層析純化獲得本發(fā)明人工抗菌肽 MA-D4。
[0012]通過微量稀釋法測(cè)定人工抗菌肽MA-D4對(duì)于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、豬鏈球菌2型和炭疽桿菌的最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。
[0013]通過測(cè)定抗菌肽MA-D4針對(duì)小鼠紅細(xì)胞的溶血率，判斷其溶血性。
[0014]本發(fā)明具有積極有益的效果。
[0015]本發(fā)明依據(jù)GenBank中的抗菌肽Magainin和Dermaseptin-4成熟肽氨基酸序列，人工設(shè)計(jì)出本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4，并采用大腸桿菌偏好性密碼子設(shè)計(jì)編碼該抗菌肽的核苷酸序列，通過原核表達(dá)系統(tǒng)大量獲取人工抗菌肽MA-D4。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4具備較強(qiáng)的廣譜抗菌活性，可抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，同時(shí)不具有溶血活性。因此，其可作為一類新型抗菌藥物，在食品防腐、疾病治療等方面具有良好的應(yīng)用前景，極具開發(fā)潛力。
[0016]本發(fā)明制備方法表達(dá)效率高，分離純化過程簡單，生產(chǎn)成本低，穩(wěn)定性好，可應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1目的基因的多步PCR擴(kuò)增。
[0018]M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.目的基因前半部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.目的基因后半部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3.完整目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0019]圖2通過鎳離子親和層析法純化人工抗菌肽MA-D4。
[0020]M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化處理的溶液；2.未純化處理的溶液。
[0021 ] 圖3人工抗菌肽MA-D4溶血活性檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1:構(gòu)建原核表達(dá)載體和基因工程菌。[0023]根據(jù)GenBank 中的抗菌妝 Magainin (N0.474452717)和 Dermaseptin-4 (N0.P84924.1)成熟肽氨基酸序列，將抗菌肽Magainin第21位的甲硫氨酸(Met)替換成色氨酸(Trp)，人工設(shè)計(jì)出本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4的氨基酸序列SEQ ID N0.1，其中DDDDK為腸激酶酶切位點(diǎn)。之后采用大腸桿菌偏好性密碼子設(shè)計(jì)編碼該抗菌肽的核苷酸序列，并在兩端分別添加核酸限制性內(nèi)切酶通ο和及麗71識(shí)別位點(diǎn)，形成目的基因，序列如SEQ ID N0.2所示。
[0024]設(shè)計(jì)的目的基因序列為5' -cacctcgaggatgatgatgataaacatcatggtattggtaaatttctgcatagcgcaaaaa
aatttggtaaagcatttgttggtgaaatttggaatagccatcatgcactgtggaaagatattctgaaaaatgcaggtaaagcagcactgaatgaaattaatcagattgttcagcatcatgatgatgatgataaaggatccaat-3r ，總序列共有204bp，下劃線分別為核酸限制性內(nèi)切酶ZAo I和及?" Λ別位點(diǎn)。
[0025]采用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法合成上述目的基因。設(shè)計(jì)兩兩互補(bǔ)的4條PCR引物，其中Ρ1、Ρ2之間，Ρ2、Ρ3之間和Ρ3、Ρ4之間均含有15個(gè)重疊堿基。所述引物Ρ1、Ρ2、Ρ3和Ρ4 分別具有 SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 所示的核苷酸序列，由廣州英駿生物有限公司合成。
[0026]使用上述引物進(jìn)行多步PCR獲得目的基因。先以Pl和Ρ2為引物擴(kuò)增目的基因前半部分序列，再以Ρ3和Ρ4為引物擴(kuò)增目的基因后半部分序列，最后以前兩次PCR產(chǎn)物為模板，Pl和Ρ4為引物擴(kuò)增獲得完整的目的基因。反應(yīng)體系(50yL)如下:2XTaq PCRMastermix 25 μ L，上游引物和下游引物各1.0 μ L，ddH20 23 μ L0 PCR程序如下:95°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)30次；72°C終延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后使用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行DNA電泳分析，參見附圖1。產(chǎn)物經(jīng)深圳華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序，確認(rèn)與設(shè)計(jì)完全一致，置于-20°C保存。
[0027]使用通O)和核酸限制性內(nèi)切酶對(duì)獲得的目的基因和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)同時(shí)進(jìn)行雙酶切操作。純化酶切產(chǎn)物后，將目的基因片段與pET-32a(+)質(zhì)粒連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS或Rosetta中，利用氨節(jié)西林鑒定篩選基因工程陽性菌。在200mL的LB液態(tài)培養(yǎng)基中添加IPTG大規(guī)模誘導(dǎo)基因工程菌表達(dá)目的蛋白，于4°C下5000r/min離心IOmin收集菌體，使用PBS清洗三次后超聲波裂解菌體，12000r/min離心15min后收集上清液進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量。
[0028]實(shí)施例2:獲取和純化人工抗菌肽MA-D4。
[0029]使用腸激酶按下述酶切體系對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酶切處理:10XBuffer 10.0 μ L,ddH20 38.Ομ L,目的蛋白 50.0 μ L，腸激酶 2.Ομ L，置于 23。。下 20h。
[0030]利用Thermo Scientific 公司的 HisPur N1-NTA Spin Purification Kit,通過鎳離子親和層析純化獲得本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4。按說明書預(yù)處理樹脂柱后，加入與High-capacity nickel-1MAC resin等量的酶切處理過的上清液,置于4°C環(huán)境中結(jié)合Ih后，洗脫蛋白，收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，參見附圖2。可見4.6-10.0kD之間有明顯的蛋白條帶，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)大小，即為人工抗菌肽MA-D4。通過Bradford法測(cè)定其濃度為486.75 μ g/mL。
[0031 ] 實(shí)施例3:人工抗菌肽MA-D4生物活性檢測(cè)。[0032]通過微量稀釋法測(cè)定人工抗菌肽MA-D4對(duì)于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、豬鏈球菌2型和炭疽桿菌的最小抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:將實(shí)驗(yàn)菌株制備成106cfu/mL的菌液，分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔90 μ L0使用PBS將人工抗菌肽MA-D4溶液分別稀釋成40.0,20.0、10.0,8.0,6.0,4.0、2.0、1.0、0.5 μ g/mL,并加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔10 μ L。設(shè)置空白對(duì)照組僅含LB液態(tài)培養(yǎng)基，條件對(duì)照組僅含有實(shí)驗(yàn)菌株的菌液，酶切對(duì)照組添加有未經(jīng)腸激酶處理的目的蛋白溶液和實(shí)驗(yàn)菌株的菌液。置于37°C培養(yǎng)箱中過夜，翌日測(cè)定每孔的649_?值。可完全抑制細(xì)菌生長的最低溶液濃度即為人工抗菌肽MA-D4針對(duì)該實(shí)驗(yàn)菌株的MIC。將MIC以上的組按1:100比例接種LB液態(tài)培養(yǎng)基，并取其中100 μ L均勻涂布在LB固態(tài)培養(yǎng)基上，置于37°C培養(yǎng)箱中12h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。固態(tài)培養(yǎng)基上少于5個(gè)菌落的最高溶液濃度即為人工抗菌肽MA-D4針對(duì)該實(shí)驗(yàn)菌株的MBC。人工抗菌肽MA-D4對(duì)以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌、以豬鏈球菌2型為代表的革蘭氏陽性菌和目前耐藥性最嚴(yán)重的金黃色葡萄球菌均具有生物活性，說明其具有廣譜抗菌活性。
[0033]各實(shí)驗(yàn)菌株的MIC和MBC單位:μ g/mL
【權(quán)利要求】
1.一種人工抗菌肽MA-D4，其特征在于，其是具備序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的多肽，或由SEQ ID N0.1所示氨基酸序列經(jīng)過環(huán)化、N末端和/或C末端修飾、L-型氨基酸和D-型氨基酸互相轉(zhuǎn)變、序列末端缺失中的至少一種處理而得到的功能等同的多肽。
2.一種多核苷酸，其特征在于，其是具備序列表中SEQ ID N0.2所示核苷酸序列或與之互補(bǔ)的多核苷酸，可編碼SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。
3.—種載體,其特征在于,具備權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
4.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，具備權(quán)利要求3所述的載體。
5.權(quán)利要求1所述的人工抗菌肽MA-D4的制備方法，包括如下步驟: (1)根據(jù)GenBank中的抗菌肽Magainin和Dermaseptin_4成熟肽氨基酸序列，人工設(shè)計(jì)出本發(fā)明人工抗菌肽MA-D4的氨基酸序列SEQ ID N0.1，之后采用大腸桿菌偏好性密碼子設(shè)計(jì)編碼該抗菌肽的核苷酸序列，并在兩端分別添加核酸限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，形成目的基因序列SEQ ID N0.2 ； (2)采用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法合成上述目的基因，設(shè)計(jì)兩兩互補(bǔ)的4條PCR引物，通過多步PCR獲得的目的基因； (3)將獲得的目的基因與原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21或Rosetta中，篩選基因工程陽性菌； (4)添加IPTG誘導(dǎo)基因工程菌表達(dá)，超聲波裂解菌體后進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)蛋白表達(dá)量; (5)使用腸激酶酶切處理表達(dá).產(chǎn)物后，通過鎳離子親和層析純化獲得本發(fā)明人工抗菌肽 MA-D4。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人工抗菌肽MA-D4的制備方法，其特征在于，所述目的基因序列如SEQ ID N0.2所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人工抗菌肽MA-D4的制備方法，其特征在于，所述4條PCR引物序列如SEQ ID N0.3~5所示。
8.權(quán)利要求1所述的人工抗菌肽MA-D4的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于制備抗菌劑。
9.權(quán)利要求8所述的人工抗菌肽MA-D4應(yīng)用于制備抗菌劑，其特征在于，針對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、豬鏈球菌2型和炭疽桿菌。
【文檔編號(hào)】A61K38/16GK103467580SQ201310427278
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】劉誠 申請(qǐng)人:劉誠