一種dpp-ⅳ抑制多肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種DPP-Ⅳ抑制多肽及其應(yīng)用，所述抑制多肽為羊乳酪蛋白經(jīng)蛋白酶精細(xì)水解轉(zhuǎn)換的天然產(chǎn)物，即羊奶酪蛋白酶解功能多肽。當(dāng)經(jīng)過胰蛋白酶在pH8.0、底物濃度5.0%、溫度37℃、酶與底物比2%、水解時(shí)間為6h的酶解反應(yīng)條件下，水解度為16.57%，DPP-Ⅳ抑制率（0.625mg/ml多肽濃度下）65.29%。所述DPP-Ⅳ抑制多肽具有天然，安全，高效特點(diǎn)，可用于制備預(yù)防或輔助治療受益于DPP-IV抑制的疾病的藥物或功能食品。
【專利說明】—種DPP-1V抑制多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及具有DPP-1V抑制活性的羊乳酪蛋白酶解物。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病(diabetes mellitus, DM)是由多種遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的一組慢性代謝異常綜合癥，它是由于胰島素相對或絕對缺乏，以及周圍靶組織不同程度對胰島素抵抗引起的碳水化合物、蛋白質(zhì)，脂肪代謝紊亂綜合癥。如果得不到及時(shí)、有效治療，糖尿病可導(dǎo)致失明、心腦血管疾病、腎功能衰竭、神經(jīng)病變、肢體壞疽以致截肢、昏迷等多種并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人類健康。糖尿病是目前世界范圍內(nèi)增長速度最快和發(fā)病率最為廣泛的疾病之一，已經(jīng)成為僅次于腫瘤和心血管疾病的“第三號殺手〃。據(jù)世界糖尿病基金會統(tǒng)計(jì)，2010年糖尿病成年患者約為2.85億，預(yù)計(jì)2030年將達(dá)到4.39億，其中2型糖尿病(type2diabetesmelzitus, T2DM)占患者總數(shù)的 90-95%。
[0003]T2DM的發(fā)生主要伴隨著外周組織(如肌肉和脂肪)中的胰島素抵抗、體內(nèi)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌減少以及肝臟糖異生作用的增加。由于糖尿病的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，現(xiàn)有藥物治療不能從根本上解決這個(gè)問題。因此，人們正在尋找新的治療方案，包括提高靶細(xì)胞中胰島素的活性、刺激糖和脂肪的分解、減少內(nèi)源性葡萄糖的生成、增加胰腺P -細(xì)胞的再生、提高胰島素的分泌等。許多新的藥物靶點(diǎn)因而被開發(fā)，其中，尤以DPP-1V為靶點(diǎn)的藥物研究最為突出。
[0004]DPP-1V (二肽基肽酶-1V)是一類多功能膜上結(jié)合的絲氨酸氨肽酶，其催化活性中心位于胞外分子C末端區(qū)域，DPP-1V能夠切割多肽，改變其生物學(xué)活性或使之失活，凡N端第二位為脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)的多肽是該酶發(fā)揮活性的主要底物。其中與糖代謝緊密相關(guān)的腸降血糖素GLP-1就是其底物之一，GLP-1在體內(nèi)主要由腸道L細(xì)胞分泌，具有降血糖，延遲胃排空，促進(jìn)飽脹感，抑制肝糖合成，提高胰島素分泌，促進(jìn)3細(xì)胞分化增殖、抑制凋亡等作用，所以圍繞GLP-1開發(fā)的藥物是2型糖尿病新藥研發(fā)的一個(gè)重要靶點(diǎn)。但GLP-1在體內(nèi)很容易被DPP-1V為主的酶降解從而失去生物學(xué)活性，半衰期小于2分鐘，難于臨床應(yīng)用。故尋找能有效延長GLP-1半衰期，增強(qiáng)葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌，調(diào)節(jié)血糖濃度的DPP-1V抑制劑已成為糖尿病新藥研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
[0005]DPP-1V抑制劑的結(jié)構(gòu)與DPP-1V的天然底物相似，含有Xaa-Pro類似結(jié)構(gòu)，可以競爭性的結(jié)合DPP-1V活化部位，從而改變DPP-1V的構(gòu)象，降低其催化活性。自從2006年8月默克公司研制的DPP-1V抑制劑西他列汀在墨西哥上市后，國外越來越多的人致力于化學(xué)合成的DPP-1V抑制劑，目前有很多已進(jìn)入待批和I1、III期臨床階段。這些化學(xué)合成藥物雖然在臨床前和臨床實(shí)驗(yàn)中并未表現(xiàn)出嚴(yán)重的副作用，只是出現(xiàn)一些諸如惡心、瘙癢和鼻咽炎等的不良反應(yīng)，但因?yàn)镈PP-1V本身也擔(dān)負(fù)著許多生理學(xué)功能，比如和⑶45 —起發(fā)揮共刺激作用可促進(jìn)T細(xì)胞激活、增殖，也可以使一些趨化因子、神經(jīng)肽和小肽類激素失活等，長期服用是否會產(chǎn)生副作用的爭議一直都存在。因此，如果能從天然藥物或天然食物中獲得具有DPP-1V抑制活性的功能物質(zhì)，將對人類健康產(chǎn)生重大的影響。
[0006]近兩年來從食物來源中尋找具有DPP-1V抑制活性的小分子活性肽已成為研究熱點(diǎn)。DPP-1V抑制活性肽指的是一類具有抑制DPP-1V活性的、相對分子量較小的多肽物質(zhì)，這些多肽的氨基酸序列和肽鏈長度各不相同，但都具有類似的功能。目前發(fā)現(xiàn)從食物蛋白經(jīng)酶解或發(fā)酵產(chǎn)生的DPP-1V活性肽，一般鏈長含2-14個(gè)氨基酸殘基，分子量低于lOOODa，并且認(rèn)為，肽C末端氨基酸為Pro，Phe, Tyr或序列中含有疏水氨基酸的肽段具有較高的DPP-1V抑制活性。
[0007]我國具有非常豐富的羊奶資源，在陜西，羊奶是僅次于蘋果產(chǎn)業(yè)的第二大支柱產(chǎn)業(yè)。羊奶營養(yǎng)價(jià)值很高，與牛奶相比，羊奶營養(yǎng)組成更接近人奶，特別適合體弱和胃腸功能紊亂的人群飲用。羊奶脂肪球細(xì)小，中、短鏈脂肪酸含量高，酪蛋白與乳清蛋白比例更接近母乳，蛋白凝塊細(xì)而軟，這些特性都造成羊奶比牛奶更易被人體消化吸收；并且羊奶中幾乎不含a Si酪蛋白，過敏風(fēng)險(xiǎn)低，更適合嬰幼兒食用；羊奶的礦物質(zhì)和維生素含量大都高于牛奶，且富含表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、核苷酸、?；撬岬榷喾N活性因子。但目前，對羊奶及羊奶制品的研究開發(fā)卻明顯滯后于牛奶，產(chǎn)品附加值很低，明顯不能滿足市場對其日益膨脹的需求，亟需加大對羊奶資源的開發(fā)力度。
[0008]目前關(guān)于乳源活性肽的研究大多集中在牛乳方面，而對羊乳源蛋白肽的研究甚少。羊奶中酪蛋白含量非常豐富，約占75%以上，利用羊奶酪蛋白開發(fā)具有DPP-1V抑制活性的功能肽具有很大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，它既可作為食品補(bǔ)充劑，又可作為保健食品的功能成分，還可以應(yīng)用于生產(chǎn)新 一代的藥物，前景非常廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種具有DPP-1V抑制活性的多肽及其制備方法。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供了一種DPP-1V抑制多肽，所述DPP-1V抑制多肽為羊乳酪蛋白經(jīng)過蛋白酶分解的酶解物，所述蛋白酶為堿性蛋白酶或胰蛋白酶。
[0011]其中，所述羊乳酪蛋白是以羊奶為原料，經(jīng)脫脂、等電點(diǎn)沉淀，離心、多次洗滌、沉淀經(jīng)冷凍干燥得到的。
[0012]作為優(yōu)選,所述蛋白酶為胰蛋白酶。
[0013]進(jìn)一步地，所述DPP-1V抑制多肽的制備方法包括如下步驟:
[0014]I)羊乳酪蛋白的制備；
[0015]2)將步驟I)制得的羊乳酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解；
[0016]3)使步驟2)酶解后的水解液中的胰蛋白酶失活；
[0017]4)脫鹽精制。
[0018]所述步驟I)為將全脂羊奶粉溶于蒸餾水中制成12.5% (w/w)的復(fù)原羊乳，在40°C下水化30min以上,充分溶解后4°C下、10000r/min離心15min,得脫脂羊乳；用lmol/L HCL調(diào)節(jié)pH至羊奶酪蛋白等電點(diǎn)4.4-4.5,靜止30min后4000r/min離心15min,離心后沉淀以3倍體積蒸餾水洗滌3-4次，沉淀經(jīng)冷凍干燥，即得羊乳酪蛋白。
[0019]所述步驟2)的酶解反應(yīng)條件為pH8.0、底物濃度5.0%、溫度37°C、酶與底物比2%、水解時(shí)間為6h。[0020]所述步驟3)將步驟2)酶解后的水解液經(jīng)沸水浴IOmin滅胰蛋白酶，迅速冷卻。
[0021]所述步驟4)將步驟3)所得水解液通過離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽，濃縮、冷凍干燥后即得DPP-1V抑制多肽。
[0022]本發(fā)明還提供了前述DPP-1V抑制多肽在制備預(yù)防或輔助治療受益于DPP-1V抑制的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明所述的DPP-1V抑制多肽，可以作為藥物，或者膳食補(bǔ)充劑，或作為食品基料加入到普通食品如飲料、乳制品等中，作為2型糖尿病患者，或者有肥胖、免疫低下、心腦血管等病癥的慢性代謝綜合紊亂癥人群的預(yù)防或者輔助治療。
[0024]本發(fā)明的有益效果在于:
[0025]本發(fā)明提供的DPP-1V抑制多肽，在0.625mg/ml多肽濃度下，DPP-1V抑制活性達(dá)到 65.29%。開發(fā)具有DPP-1V抑制活性的天然功能物質(zhì)是目前糖尿病治療的研究熱點(diǎn)，國際專利公布號為W02009/128713A1的發(fā)明專利顯示了牛乳酪蛋白經(jīng)4種蛋白酶酶解后酶解物的DPP-1V抑制活性，其中鮮味酶酶解后的水解物具有最高抑制活性，其DPP-1V的IC50值為2.7±1.9mg/ml。相比較而言，本發(fā)明提供的羊奶酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后制得的多肽物，具有更高的DPP-1V抑制活性。另外，羊奶酪蛋白在組成上與牛奶相比，僅含有1-3%的致敏蛋白a si酪蛋白(牛奶含有43%)，具有更低的致敏性。a si酪蛋白是酪蛋白中最主要的過敏源，羊奶酪蛋白的這種組成優(yōu)勢使得以羊奶酪蛋白為原料制備具有DPP-1V抑制活性的水解物的致敏幾率也大大降低，其應(yīng)用范圍變得更加廣泛，因此，本發(fā)明利用羊乳酪蛋白經(jīng)過蛋白酶分解，制備具有DPP-1V抑制活性的物質(zhì)，相比牛乳具有更好的應(yīng)用價(jià)值。
[0026]本發(fā)明所述的DPP-1V抑制多肽，可直接加工成藥劑形式、或者制成膳食補(bǔ)充劑，直接面對糖尿病患者等特定消費(fèi)群體，另外也可作為保健食品的功能成分，針對食品加工企業(yè)這個(gè)市場領(lǐng)域，用于加工成具有抗糖尿病保健作用的食品，尤其適合加入到羊奶中制成具有保健功能的羊奶制品。羊奶 本身比牛奶營養(yǎng)和保健價(jià)值都要高，普遍被認(rèn)為是高端飲品，更被稱作“奶中之王”和“貴族奶”。與牛奶、魚肉、雞蛋等其它食物蛋白相比，以羊奶本身含有的酪蛋白制備的DPP-1V抑制多肽加入到羊奶中再進(jìn)一步加工成各種產(chǎn)品，無論從營養(yǎng)特性還是消費(fèi)心理方面，都更容易為消費(fèi)者和市場所接受。國內(nèi)外還沒有與此相同的產(chǎn)品。
[0027]本發(fā)明所述的DPP-1V抑制多肽，是從天然食物中獲得具有DPP-1V抑制活性的功能物質(zhì)，以特色乳資源羊奶為原料開發(fā)此類產(chǎn)品，相比現(xiàn)有技術(shù)具有安全、高效、價(jià)格低等特點(diǎn)。同時(shí)也加大了對羊奶資源的開發(fā)力度，提高了羊奶產(chǎn)品附加值，豐富了羊奶消費(fèi)市場的產(chǎn)品種類，滿足市場對其日益膨脹的需求，有助于羊奶產(chǎn)業(yè)向良性、健康方向發(fā)展。
【具體實(shí)施方式】
[0028]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0029]實(shí)施例1羊奶酪蛋白的制備
[0030]全脂羊奶粉溶于蒸餾水中制成12.5% (w/w)的復(fù)原羊乳，在40°C下水化30min以上，使其充分溶解，然后4°C下，10000r/min離心15min進(jìn)行脫脂,得脫脂羊乳。用lmol/LHCL調(diào)節(jié)pH至羊奶酪蛋白等電點(diǎn)4.4-4.5,靜止30min后4000r/min離心15min,離心后沉淀以3倍體積蒸餾水洗滌3-4次，得到的酪蛋白沉淀冷凍干燥即得到羊乳酪蛋白粉。[0031]實(shí)施例2羊奶酪蛋白水解物的制備及DPP-1V抑制活性測定
[0032]羊乳酪蛋白粉以5% (w/w)的濃度溶于0.05mol/L NaOH,充分溶解后調(diào)至酶解反應(yīng)溫度和PH值，然后加入蛋白酶，在最適條件下分別用堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解6h (蛋白酶的最適酶解條件見表1)。反應(yīng)中保持?jǐn)嚢?，并不斷添加IM NaOH或IM HCl維持反應(yīng)體系PH值。反應(yīng)結(jié)束后，水解液經(jīng)沸水浴IOmin滅酶，迅速冷卻，接著通過離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽，濃縮、冷凍干燥后得到具有DPP-1V抑制活性的羊奶酪蛋白多肽。羊奶酪蛋白水解物的DPP-1V抑制活性和水解程度見表1。
[0033]表1羊奶酪蛋白酶解反應(yīng)的最適條件及酶解物的水解度和DPP-1V抑制活性
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種DPP-1V抑制多肽，其特征在于，所述抑制多肽為羊乳酪蛋白經(jīng)過蛋白酶分解的酶解物，所述蛋白酶為堿性蛋白酶或胰蛋白酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DPP-1V抑制多肽，其特征在于，所述羊乳酪蛋白是以羊奶為原料，經(jīng)脫脂、等電點(diǎn)沉淀，離心、多次洗滌、沉淀經(jīng)冷凍干燥得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DPP-1V抑制多肽，其特征在于，所述蛋白酶為胰蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DPP-1V抑制多肽，其特征在于，所述DPP-1V抑制多肽的制備方法包括如下步驟: 1)羊乳酪蛋白的制備； 2)將步驟I)制得的羊乳酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解； 3)使步驟2)酶解后的水解液中的胰蛋白酶失活； 4)脫鹽精制。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DPP-1V抑制多肽，其特征在于，所述步驟I)為將全脂羊奶粉溶于蒸餾水中制成12.5%(w/w)的復(fù)原羊乳，在40°C下水化30min以上，充分溶解后4°C下、10000r/min離心15min,得脫脂羊乳；用lmol/L HCL調(diào)節(jié)pH至羊奶酪蛋白等電點(diǎn)4.4-4.5,靜止30min后4000r/min離心15min，離心后沉淀以3倍體積蒸餾水洗滌3_4次，沉淀經(jīng)冷凍干燥，即得羊乳酪蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DPP-1V抑制多肽，其特征在于，所述步驟2)的酶解反應(yīng)條件為pH8.0、底物濃度5.0%、溫度37°C、酶與底物比2%、水解時(shí)間為6h。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DPP-1V抑制多肽，其特征在于，所述步驟3)將步驟2)酶解后的水解液經(jīng)沸水浴IOmin滅胰蛋白酶,迅速冷卻。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DPP-1V抑制多肽，其特征在于，所述步驟4)將步驟3)所得水解液通過離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽，濃縮、冷凍干燥后即得DPP-1V抑制多肽。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的DPP-1V抑制多肽在制備預(yù)防或輔助治療受益于DPP-1V抑制的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P9/00GK103483418SQ201310415133
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】陳尚武, 張穎 申請人:陳尚武