富勒烯衍生物的應(yīng)用及其疫苗佐劑和疫苗制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種富勒烯衍生物，所述富勒烯衍生物是以通式C60OxHy(10＜y≤x＜50)表示的富勒醇或以通式C60(C(COOH)2)n(n為1-4的整數(shù))表示的富勒烯羧基衍生物，該富勒烯衍生物在溶劑中的納米顆粒物的直徑范圍為1-400nm。本發(fā)明還提供了所述富勒烯衍生物疫苗佐劑在疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用，其安全性好且能通過(guò)不同的免疫途徑顯著提高疫苗的免疫原性，具有極大的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】富勒烯衍生物的應(yīng)用及其疫苗佐劑和疫苗制劑
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年12月24日、申請(qǐng)?zhí)枮?01010621120.5、發(fā)明名稱為“富勒烯衍生物的應(yīng)用及其疫苗佐劑和疫苗制劑”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種富勒烯衍生物，具體地說(shuō),涉及富勒醇顆粒C6tlOxHy(10 < y ^ X< 50)和富勒烯羧基衍生物C6tl (C(COOH)2)n(η為1_4的整數(shù))以及該富勒烯衍生物的疫苗佐劑、疫苗制劑和其在疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)和疫苗領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]在預(yù)防和治療重大疾病尤其是傳染病方面，疫苗發(fā)揮了極其重要的作用。在疫苗的研究和開(kāi)發(fā)過(guò)程中，主要通過(guò)抗原和疫苗載體或佐劑的設(shè)計(jì)優(yōu)化來(lái)獲得安全有效的疫苗。目前，臨床上唯一批準(zhǔn)使用的佐劑為鋁佐劑，其能較好地促進(jìn)機(jī)體的體液免疫水平，在疾病的預(yù)防過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。然而，鋁佐劑在一定程度上抑制了機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，同時(shí)其在注射部位能引起一定的炎癥和過(guò)敏反應(yīng)，這些都在一定程度上限制了鋁佐劑在臨床中的廣泛應(yīng)用。目前研究開(kāi)發(fā)的傳統(tǒng)意義上的疫苗佐劑則由于安全性或有效性方面的缺陷難以投入臨床。
[0004]在免疫反應(yīng)的發(fā)生過(guò)程中，抗原呈遞細(xì)胞尤其是樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendriticcells, DC)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞的活化，機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)得以快速有效地發(fā)生。因此，DC疫苗佐劑的研發(fā)成為目前人們關(guān)注的重點(diǎn)。
[0005]近年來(lái)，納米技術(shù)的快速發(fā)展已滲透至各個(gè)領(lǐng)域。納米材料由于其粒徑小、比表面積大而呈現(xiàn)出塊體材料所不具備的新穎特性。同時(shí)納米材料易進(jìn)行表面修飾加工，從而實(shí)現(xiàn)不同的目的。這將為疫苗載體或佐劑的研發(fā)注入新的活力。
`[0006]富勒烯C6tl是一種由碳原子構(gòu)成的納米尺度的球狀分子，具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景。由于富勒烯本身屬疏水性物質(zhì)，這極大地限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。近年來(lái)水溶性富勒烯及其衍生物的成功合成為其應(yīng)用提供了保證。同時(shí)富勒烯衍生物在水環(huán)境體系中可通過(guò)與自身或其他物質(zhì)的相互作用而團(tuán)聚成納米顆粒物，且其安全性問(wèn)題得到了解決。在眾多的納米材料中，富勒烯衍生物尤其是金屬富勒醇(GdOC82(OH)22)和富勒醇(C6tlOxHy)顯示出良好的抗腫瘤活性(專利申請(qǐng)?zhí)?200610152170.7,200710175456.1)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)金屬富勒醇和富勒醇主要通過(guò)增強(qiáng)小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)發(fā)揮其抑瘤作用，且金屬富勒醇可誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，且富勒烯衍生物具有良好的生物安全性(Ying Liu, Fang Jiao, Yang Qiu, et al.Biomaterials, 2009，30:3934-3945.Ying Liuj Fang Jiao, Yang Qiuj et al.Nanotechnology, 2009, 20:415102.De Yang，Yuliang Zhao, Hua Guoj et al.ACS Nano，2010，4:1178-1186.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明人在對(duì)富勒烯衍生物的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，其可作為佐劑，顯著提高小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫水平。因此本發(fā)明的目的在于提供一種富勒烯衍生物，在其表面引入親水基團(tuán)，如羥基(-0H)、羧基(-COOH)等，能夠解決富勒烯水溶性差的問(wèn)題，為其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述富勒烯衍生物疫苗佐劑和疫苗制劑，以及該富勒烯衍生物在疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用，其可以增強(qiáng)疫苗的免疫原性，能夠解決傳統(tǒng)佐劑在安全性和/或有效性方面的缺陷。
[0008]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0009]一方面，本發(fā)明提供的一種富勒烯衍生物在制備用于基因傳遞的載體和/或用于提高疫苗的免疫原性的藥物中的應(yīng)用。
[0010]進(jìn)一步，所述富勒烯衍生物是由以下分子式I表示的富勒醇或以式2表示的富勒烯羧基衍生物:
[0011]式1:C6(l0xHy，其中，10 < y X < 50 ;優(yōu)選地,x=y=10_50 ;更優(yōu)選地 x=y=15_25 ；
[0012]式2 =C6tl(C(COOH)2)n，其中，η為1_4的整數(shù)；優(yōu)選地，η=1_3 ;更優(yōu)選地，η=2。
[0013]另一方面，本發(fā)明提供的一種疫苗佐劑，所述佐劑包含富勒烯衍生物，該佐劑可以與疫苗同時(shí)混合后對(duì)受試者進(jìn)行免疫，還可以先為受試者注射該佐劑，之后對(duì)受試者進(jìn)行疫苗免疫，或者可以對(duì)受試者進(jìn)行疫苗免疫后再注射該佐劑，優(yōu)選該佐劑與疫苗同時(shí)混合后對(duì)受試者進(jìn)行免疫。所述佐劑與疫苗對(duì)受試者免疫的部位相同或不同。
[0014]進(jìn)一步，所述富勒烯衍生物在溶劑中的納米顆粒物的直徑范圍為l_400nm。
[0015]又一方面，本發(fā)明提供的一種疫苗制劑，所述制劑包含所述的疫苗佐劑。
[0016]進(jìn)一步，所述疫苗包括，但不限于:艾滋病病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗和人乳頭狀瘤病毒疫苗等重大傳染病疫苗。本發(fā)明`人以編碼艾滋病病毒包膜蛋白基因的(HIV-1Env)表達(dá)質(zhì)粒(DNA)為研究對(duì)象，比較了富勒烯衍生物作為佐劑對(duì)HIV DNA疫苗免疫原性的影響，發(fā)現(xiàn)該佐劑與DNA疫苗混合免疫小鼠后，可顯著增強(qiáng)DNA的免疫原性，且在相同的免疫次數(shù)情況下，低劑量DNA+佐劑和單獨(dú)高劑量DNA引發(fā)的免疫反應(yīng)水平無(wú)顯著差異。同時(shí)，相同劑量的DNA+佐劑在少免疫一次的情況下，所引發(fā)的免疫反應(yīng)水平和單獨(dú)免疫DNA疫苗無(wú)顯著差異。
[0017]進(jìn)一步，所述疫苗制劑的免疫途徑選自:皮下注射、滴鼻免疫、腹腔注射、肌肉注射和皮內(nèi)注射，上述免疫途徑均可發(fā)揮富勒烯衍生物的免疫佐劑作用。
[0018]本發(fā)明提供的一種富勒烯衍生物疫苗佐劑與傳統(tǒng)佐劑相比，其有益效果如下:
[0019]1.本發(fā)明提供的疫苗佐劑安全性好，對(duì)注射部位無(wú)明顯的刺激作用；
[0020]2.本發(fā)明提供的疫苗佐劑可顯著提高機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫水平，同時(shí)可減少抗原的使用劑量或減少免疫次數(shù)；
[0021]3.本發(fā)明提供的疫苗佐劑具有抗氧化和清除自由基的功能，在充當(dāng)免疫佐劑的同時(shí)，還可能提高機(jī)體抗氧化的防御能力，使機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中:
[0023]圖1為本發(fā)明富勒醇的原子力顯微鏡表征圖片；
[0024]圖2為本發(fā)明富勒醇的掃描電子顯微鏡表征圖片；
[0025]圖3為本發(fā)明富勒醇的動(dòng)態(tài)光散射儀檢測(cè)結(jié)果；[0026]圖4為本發(fā)明富勒醇對(duì)HEK (Human embryonic kidney) 293細(xì)胞活力的影響；
[0027]圖5為本發(fā)明富勒醇對(duì)HEK293細(xì)胞形態(tài)的影響；
[0028]圖6 為本發(fā)明富勒醇對(duì) NIH3T3 (Mouse embryonic fibroblast cell line)細(xì)胞活力的影響；
[0029]圖7為本發(fā)明富勒醇對(duì)NIH3T3細(xì)胞形態(tài)的影響；
[0030]圖8為本發(fā)明富勒醇對(duì)HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，其中熒光顯微鏡的放大倍數(shù)為16X20 ；
[0031]圖9為本發(fā)明富勒醇對(duì)小鼠細(xì)胞免疫水平的影響；
[0032]圖10為本發(fā)明富勒醇對(duì)特異性抗體滴度的影響。
[0033]圖11為采用不同免疫途徑時(shí)本發(fā)明富勒醇對(duì)小鼠細(xì)胞免疫水平的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0035]在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
[0036]實(shí)施例1富勒醇Cp(OH)^的合成
[0037]首先，將Iml的40%四丁基氫氧化銨溶液(TBAH)和2ml氫氧化鈉溶液(2.22g/ml)加至30ml的C6tl (Sigma公司)甲苯溶液(1.5mg/ml)中，劇烈攪拌下反應(yīng)24h ;棄去有機(jī)相，并用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV06-ML 1-B，德國(guó))除去水相；用50ml甲醇洗滌樣品，甲醇通過(guò)真空蒸發(fā)除去，如此反復(fù)洗滌3-5次；之后，將IOml去離子水加至樣品中，持續(xù)攪拌至溶液呈透明的紅棕色，繼續(xù)加入20ml去離子水，并用Sephadex G_25色譜柱(Amersham公司，英國(guó))純化樣品，最后真空干燥，即可獲得富勒醇納米顆粒。通過(guò)調(diào)節(jié)氫氧化鈉的加入量可獲得含不同數(shù)量羥基的富勒醇。
[0038]利用原子力顯微鏡(Atomicforce microscopy, AFM) (BMT AFM3000,德國(guó))和掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope, SEM) (S-4800,日本日立公司)對(duì)所得富勒醇進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1和圖2所示，富勒醇的平均粒徑約為120nm。
[0039]利用動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀(DLS) (Zetasizer Nano,英國(guó)馬爾文公司)檢測(cè)所得富勒醇的電位，結(jié)果如圖3所示，富勒醇表面帶負(fù)電荷，平均電勢(shì)約為-51.6mv。
[0040]利用X射線光電子能譜儀(XPS，日本電子株式會(huì)社)對(duì)富勒醇所含的羥基數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1，由表1可知羥基(-0H)數(shù)量為:(18.78/55.73) X 60=200
[0041]表1不同碳原子的XPS檢測(cè)結(jié)果
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種富勒烯衍生物在制備用于提高疫苗的免疫原性的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述富勒烯衍生物是由以下分子式I表示的富勒醇或以式2表示的富勒烯羧基衍生物: 式 1:C6(l0xHy,其中，10 < y ≤ X < 50 ;優(yōu)選地，x=y=10_50 ;更優(yōu)選地，x=y=15_25 ； 式2 =C6tl(C(COOH)2)n，其中，η為1_4的整數(shù)；優(yōu)選地，η=1_3 ;更優(yōu)選地，η=2。
3.一種富勒烯衍生物在制備疫苗佐劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述富勒烯衍生物為以下分子式I表示的富勒醇或以式2表 示的富勒烯羧基衍生物: 式 1:C6(l0xHy,其中，10 < y ≤ X < 50 ;優(yōu)選地，x=y=10_50 ;更優(yōu)選地，x=y=15_25 ； 式2 =C6tl(C(COOH)2)n，其中，η為1_4的整數(shù)；優(yōu)選地，η=1_3 ;更優(yōu)選地，η=2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述佐劑為富勒烯衍生物納米顆粒溶液制劑，其中，所述富勒烯衍生物在溶劑中的納米顆粒物的直徑范圍為l_400nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述佐劑以以下方式對(duì)受試者進(jìn)行免疫: 1)與疫苗同時(shí)混合后對(duì)受試者進(jìn)行免疫； 2)先為受試者注射該佐劑,之后對(duì)受試者進(jìn)行疫苗免疫；或 3)對(duì)受試者進(jìn)行疫苗免疫后再注射該佐劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述佐劑與疫苗同時(shí)混合后對(duì)受試者進(jìn)行免疫。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述佐劑與疫苗對(duì)受試者免疫的部位相同或不同。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK103495164SQ201310357325
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月24日
【發(fā)明者】陳春英, 邵一鳴, 許利耕, 郝彥玲, 劉穎, 劉野 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心, 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心