miR-17-5p及miR-20a在制備依托泊苷耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明通過(guò)揭示腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物依托泊苷（etoposide，又稱(chēng)VP-16、足葉乙甙）耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理，公開(kāi)了診斷及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷耐藥性的新方法。發(fā)明人通過(guò)檢測(cè)對(duì)依托泊苷具有不同敏感性的腫瘤細(xì)胞中miRNA及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-17-5p和miR-20a在對(duì)依托泊苷高度敏感的細(xì)胞中低表達(dá)，而其靶基因Bim-S促凋亡蛋白則呈現(xiàn)高表達(dá)。相反，在對(duì)依托泊苷具有耐藥性的細(xì)胞中，miR-17-5p和miR-20a的表達(dá)量較高，而B(niǎo)im-S蛋白則呈現(xiàn)低表達(dá)。使用miR-17-5p和/或miR-20a的抑制劑可以有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷的耐藥性。本發(fā)明提供了檢測(cè)和/或預(yù)后癌癥對(duì)依托泊苷耐藥性的全新且簡(jiǎn)單有效的方法，并且提出逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的手段，這在腫瘤的臨床診斷和個(gè)性化治療中具有潛在的巨大應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】miR-17-5p及miR-20a在制備依托泊苷耐藥逆轉(zhuǎn)劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物領(lǐng)域，涉及腫瘤耐藥性診斷和治療，更具體涉及通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志性微RNA和凋亡調(diào)控蛋白的表達(dá)預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物依托泊苷的敏感性和/或耐受性的方法，以及通過(guò)改變miR-17-5p、miR-20a微RNA的表達(dá)和Bim-S促凋亡蛋白的表達(dá)而降低腫瘤對(duì)依托泊苷耐藥性的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]化療是腫瘤臨床治療的主要手段之一。然而，腫瘤細(xì)胞的耐藥性常常使得化療藥物的療效被大大削弱，其結(jié)果是腫瘤病人對(duì)藥物治療不再敏感，并導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。因此，在臨床診斷中檢測(cè)或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，并開(kāi)發(fā)逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的藥物，是提聞化療療效及腫瘤治愈率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
[0003]目前研究發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥的分子機(jī)制非常復(fù)雜，主要包括藥物靶基因突變或擴(kuò)增、藥物外排作用相關(guān)蛋白表達(dá)增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡途徑異常和DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)增強(qiáng)等。最近的研究表明細(xì)胞凋亡和抗凋亡關(guān)鍵途徑的異常是腫瘤耐藥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。由于化療主要是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡的方式治療腫瘤，因此腫瘤細(xì)胞凋亡途徑的缺陷將使得凋亡程序無(wú)法被啟動(dòng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)治療產(chǎn)生抗性。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抗性主要與以下幾個(gè)方面有關(guān):(I)促凋亡蛋白失活，其中線粒體凋亡途徑的激發(fā)者Bim和執(zhí)行者Bax起著至關(guān)重要的作用。例如，Bax的低表達(dá)可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者對(duì)化療藥物的抗性以及低生存率。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡的敏感性與Bim而非Bcl-2家族其他成員的表達(dá)相關(guān)。過(guò)表達(dá)Bim可以使原本對(duì)紫杉醇不敏感的細(xì)胞轉(zhuǎn)變成敏感的細(xì)胞，而敲低Bim的表達(dá)則可以降低紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡。類(lèi)似的結(jié)果在乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞株中都可以觀察到。另外，Bim的缺失可影響B(tài)MK負(fù)瘤小鼠對(duì)于紫杉醇的敏感性。(2)過(guò)表達(dá)抗凋亡基因，如Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-l等。(3)p53的缺失或位點(diǎn)突變。
[0004]針對(duì)腫瘤耐藥產(chǎn)生的原因，逆轉(zhuǎn)耐藥性常用的策略包括對(duì)藥物與靶基因結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行修飾、采用鈣離子通道阻滯劑、增強(qiáng)細(xì)胞凋亡程度等。由于微RNA (miRNA)對(duì)細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的廣泛調(diào)控，其在腫瘤治療中的應(yīng)用也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，尤其是微RNA在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性方面表現(xiàn)出了良好的運(yùn)用前景。例如，在膽管癌病人中miR-21高表達(dá)，通過(guò)抑制miR-21的表達(dá)水平可提高膽管癌細(xì)胞對(duì)化療藥物吉西他濱的敏感性。在乳腺癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)高于正常乳腺細(xì)胞，用反義寡核苷酸降低MCF-7乳腺癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，可以抑制MCF-7的體外和體內(nèi)增殖并提高M(jìn)CF-7對(duì)化療藥物托泊替康的敏感性。關(guān)于微RNA與腫瘤化療耐藥性的相關(guān)性研究正如火如荼，有望為成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的新療法。
[0005]依托泊苷又稱(chēng)VP-16或足葉乙甙，是一種細(xì)胞周期特異性的抗腫瘤藥物，主要作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II，形成藥物-酶-DNA穩(wěn)定的可逆性復(fù)合物從而阻礙DNA修復(fù)。依托泊苷被廣泛應(yīng)用于癌癥的化療方案，但由于化療存在著比較嚴(yán)重的骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)和肝腎損傷等，故需與其他藥物聯(lián)合使用。另外，依托泊苷也存在耐藥性問(wèn)題，通過(guò)聯(lián)合用藥不僅可以降低化學(xué)藥物的細(xì)胞毒性，減少副作用，也能增強(qiáng)化療效果。
[0006]研究表明微RNA與依托泊苷的耐藥性密切相關(guān)，在MCF-7/VP-16乳腺癌耐藥細(xì)胞中miR-326表達(dá)下降，而在多藥耐藥(包括依托泊苷、順鉬、阿霉素等)的小細(xì)胞肺癌中miR-134表達(dá)下降，這兩個(gè)微RNA都是以多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP-1為靶點(diǎn)而起作用的。尋找凋亡相關(guān)的微RNA作為依托泊苷耐藥性診斷的標(biāo)志物，并通過(guò)將微RNA模擬物或抑制劑與依托泊苷聯(lián)合用藥來(lái)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，對(duì)腫瘤的個(gè)性化診斷和治療具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供診斷腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷耐藥性的新試劑和新方法。
[0008]本發(fā)明具體的思路是提供了 miR-17_5p和/或miR_20a在診斷腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性和/或耐受性中的應(yīng)用，Bim-S促凋亡蛋白在診斷腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性和/或耐受性中的應(yīng)用；以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷耐藥性的新手段，具體為將miR-17-5p和/或miR-20a的抑制劑與依托泊苷聯(lián)合用于腫瘤治療。
[0009] 申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-5p和miR_20a在對(duì)依托泊苷高度敏感的腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，而其靶基因Bim-S促凋亡蛋白則呈現(xiàn)高表達(dá)。相反，在對(duì)依托泊苷具有耐藥性的腫瘤細(xì)胞中，miR-17-5p和miR-20a的表達(dá)量較高，而B(niǎo)im-S蛋白則呈現(xiàn)低表達(dá)。通過(guò)使用miR-17-5p和/或miR-20a的抑制劑，可以有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷的耐藥性。兩種藥物聯(lián)合使用對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用顯著大于單一藥物的效果或者兩種藥物單獨(dú)使用效果的簡(jiǎn)單加和。
[0010]發(fā)明提供了以下多個(gè)技術(shù)方案:
miR-17-5p和/或miR-20a在制備檢測(cè)和/或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性和/或耐受性的試劑中的應(yīng)用。
[0011]miR-17-5p和/或miR_20a表達(dá)水平測(cè)定試劑在制備檢測(cè)和/或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性和/或耐受性的試劑中的應(yīng)用。
[0012]Bim-S促凋亡蛋白在制備檢測(cè)和/或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性和/或耐受性的試劑中的應(yīng)用。
[0013]Bim-S促凋亡蛋白表達(dá)水平測(cè)定試劑在制備檢測(cè)和/或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性和/或耐受性的試劑中的應(yīng)用。
[0014]Bim-S促凋亡蛋白表達(dá)促進(jìn)劑在提高腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性藥物上的應(yīng)用。
[0015]miR-17-5p和/或miR_20a的抑制物在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷耐受性藥物中的應(yīng)用。所述miR-17-5p或miR-20a的抑制物是針對(duì)miR-17_5p或miR_20a的反義寡核苷酸或其他小分子化合物。
[0016]miR-17-5p和/或miR_20a的抑制物與依托泊苷聯(lián)合在制備腫瘤治療藥物上的應(yīng)用。所述的腫瘤治療藥物為抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或誘導(dǎo)腫瘤凋亡的藥物。
[0017]上述所說(shuō)的腫瘤可以為miR-17及miR_20a高表達(dá)的腫瘤，包括白血病、淋巴瘤、肺癌、肝癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等。
[0018]同時(shí)，發(fā)明提供了以下方法:
(I)通過(guò)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中的miR-17-5p和/或miR_20a的成熟體的表達(dá)水平檢測(cè)和/或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性和/或耐受性。miR-17-5p和/或miR-20a成熟體表達(dá)水平高的腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷具有耐受性，miR-17-5p和/或miR-20a成熟體表達(dá)水平低的腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷不具有耐受性。miR-17-5p和/或miR-20a的成熟體的表達(dá)水平的檢測(cè)方法可以為半定量RT-PCR、定量RT-PCR等。
[0019](II)Bim-S促凋亡蛋白在檢測(cè)和預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性和/或耐受性中的應(yīng)用。通過(guò)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中的Bim-S的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)和/或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性和/或耐受性。Bim-S蛋白表達(dá)水平低的腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷具有耐受性，Bim-S蛋白表達(dá)水平高的腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷不具有耐受性。Bim-S蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)方法可以為蛋白免疫印記、免疫組化等。
[0020](III)同時(shí)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中的miR-17-5p和/或miR_20a的成熟體的表達(dá)水平以及Bim-S的蛋白表達(dá)水平檢 測(cè)和/或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性和/或耐受性。
[0021](IV)miR-17-5p和/或miR_20a的抑制物在逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷耐受性中的應(yīng)用。miR-17-5p或miR-20a的抑制物可以是針對(duì)miR-17_5p或miR_20a的反義寡核苷酸或其他小分子化合物。通過(guò)使用miR-17-5p和/或miR-20a的抑制物降低miR-17_5p和/或miR-20a的表達(dá)，可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性。通過(guò)使用miR-17_5p和/或miR-20a抑制物上調(diào)Bim-S促凋亡蛋白的表達(dá)，可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性。
[0022](V)將miR-17_5p和/或miR_20a的抑制物與依托泊苷聯(lián)合用于腫瘤治療能夠顯著增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了檢測(cè)和/或預(yù)后癌癥對(duì)依托泊苷耐藥性的方法，其中miR-17-5p和miR-20a成熟體的表達(dá)可通過(guò)定量PCR等方法進(jìn)行檢測(cè)，Bim-S蛋白的表達(dá)可通過(guò)免疫印跡或免疫組化等方法進(jìn)行檢測(cè)，技術(shù)簡(jiǎn)單易行，檢測(cè)周期短，可操作性強(qiáng)，臨床意義十分重大。
[0024]本發(fā)明提供了使用miR-17_5p和miR_20a的抑制劑逆轉(zhuǎn)依托泊苷耐藥性的方法，為靶向治療腫瘤提供了思路，對(duì)依托泊苷耐受腫瘤的臨床治療具有潛在的巨大應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1.實(shí)施例1中依托泊苷對(duì)K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響，其中A為不同濃度VP-16處理下細(xì)胞的存活率；B為Annexin V/PI雙染得到的細(xì)胞凋亡率。
[0026]圖2.實(shí)施例2中K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞中miR-17-5p、miR-20a以及Bim-S蛋白的表達(dá)差異，其中A為miR-17-5p和miR_20a的相對(duì)表達(dá)水平；B為Bim-S蛋白的表達(dá)檢測(cè)。
[0027]圖3.實(shí)施例3中miR-17-5p、miR-20a抑制劑或Bim-S表達(dá)載體對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響，其中A為轉(zhuǎn)染miR-17-5p、miR-20a抑制劑后Annexin V/PI雙染法指示細(xì)胞凋亡為免疫印跡確認(rèn)Bim蛋白表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)；C為轉(zhuǎn)染Bim-S蛋白表達(dá)載體后Annexin V/PI雙染法指示細(xì)胞凋亡。
[0028]圖4.實(shí)施例4 miR-17-5p或miR-20a的抑制劑增強(qiáng)K562細(xì)胞對(duì)VP-16的敏感性，其中A為不同miRNA抑制劑對(duì)Bim-S蛋白表達(dá)影響；B為轉(zhuǎn)染miR-17_5p或miR_20a的抑制劑后K562細(xì)胞在不同濃度依托泊苷處理下的存活抑制率；C為轉(zhuǎn)染miR-17-5p或miR-20a的抑制劑后K562細(xì)胞在依托泊苷處理下的細(xì)胞凋亡率。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明。實(shí)施例中用到的主要材料如下:
依托泊苷:購(gòu)自Sigma公司，使用二甲基亞楓(DMSO)配置成100 mmol/L的儲(chǔ)液，凍于-20度，每次使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。
[0030]細(xì)胞系:實(shí)施例中所用細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。
[0031]抗體:Bim抗體購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology 公司。
[0032]miRNA抑制劑:實(shí)施例中所用miRNA抑制劑均購(gòu)自美國(guó)Dharmacon公司。
[0033]miRNA定量PCR試劑盒:購(gòu)自丹麥Exiqon公司。
[0034]Neon電轉(zhuǎn)染系統(tǒng):購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。
[0035]實(shí)施例1 K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞對(duì)化療藥物依托泊苷的敏感性差異
將K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞按3X 105/mL的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后分別加入0.1~100 μ mo I/L依托泊苷處理24小時(shí)(以DMSO作為對(duì)照)，然后采用MTT檢測(cè)細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1A，在各個(gè)測(cè)試濃度下，依托泊苷均不能有效降低K562細(xì)胞的存活率，100 μ mol/L依托泊苷僅能使K562細(xì)胞的存活率降低約10%。相反，依托泊苷對(duì)HL60細(xì)胞的抑制作用與藥物劑量呈現(xiàn)正相關(guān)性，100 μ mol/L依托泊苷即可使HL60細(xì)胞的存活率降低至40%以下。
[0036]將K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞按3 X 105/mL的密度接種于48孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后分別加入10-100 μ mol/L依托泊苷處理24小時(shí)(以DMSO作為對(duì)照)。24小時(shí)后收集細(xì)胞通過(guò)AnnexinV-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在各個(gè)測(cè)試濃度下，依托泊苷均不能有效誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖1B)。相反，低濃度(10 μ mol/L)的依托泊苷即可使90%以上的HL60細(xì)胞發(fā)生凋亡。這些結(jié)果表明K562細(xì)胞對(duì)依托泊苷具有耐藥性，而HL60細(xì)胞則對(duì)依托泊苷具有很高的敏感性。
[0037]實(shí)施例2 K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞中miR-17_5p、miR-20a以及Bim-S蛋白的表達(dá)差
巳
升
收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞,使用Trizol Reagent(美國(guó)Invitrogen公司)進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。然后將提取的總RNA用 miRCURY LNA ? Universal RT microRNA PCR (丹麥 Exiqon 公司)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(42° C I hr，95 ° C 5 min)及實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以U6 snRNA的表達(dá)水平作為內(nèi)對(duì)照分析miR-17-5p和miR-20a成熟體miRNA在K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞中的表達(dá)差異。結(jié)果表明，K562細(xì)胞中的miR-17-5p和miR_20a成熟體miRNA的表達(dá)水平均高于HL60細(xì)胞，約為HL60細(xì)胞的3倍(圖2A)。
[0038]收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞，使用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞總蛋白，并用BCA Protein Assay Kit (美國(guó)Thermo Fisher公司)進(jìn)行蛋白定量。取等量的K562總蛋白和HL60總蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳和免疫印跡檢測(cè)，以GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶)看家基因的蛋白產(chǎn)物的表達(dá)水平作為內(nèi)對(duì)照分析促凋亡蛋白Bim-S在K562細(xì)胞和HL60細(xì)胞中的表達(dá)差異。如圖2B所示，Bim-S蛋白在K562細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于其在HL60中的表達(dá)水平。
[0039]實(shí)施例3抑制miR-17_5p、miR_20a或過(guò)表達(dá)Bim-S對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
為了研究miR-17-5p和miR-20a在細(xì)胞凋亡中的作用，我們使用Neon電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將單鏈的miR-17-5p或miR-20a的抑制劑轉(zhuǎn)染進(jìn)K562細(xì)胞。48小時(shí)后收集細(xì)胞通過(guò)AnnexinV-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。與陰性對(duì)照相比，miR-17_5p或miR_20a的抑制劑均可顯著提高K562細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例(圖3A)。
[0040]為了研究Bim-S蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，我們構(gòu)建了過(guò)表達(dá)Bim-S的表達(dá)載體。首先使用如下引物(由廣州英濰捷基有限公司合成)擴(kuò)增K562細(xì)胞中的Bim cDNA:
上游引物:TTGGATCCCGCCACCATGGCAAAGCAACCTTCTGATG，
下游引物:TTGAATTCTCAATGCATTCTCCACACCAGG。
[0041]割膠回收大小符合Bim-S的DNA條帶，使用BamHI和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切并克隆至PCDNA3載體中，得到Bim-S表達(dá)載體并測(cè)序確認(rèn)。使用Neon電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將Bim-S表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)K562細(xì)胞。48小時(shí)后收集細(xì)胞，部分用于免疫印跡檢測(cè)(圖3B)，部分通過(guò)AnnexinV-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡(圖3C)。與空載相比，Bim-S表達(dá)載體可顯著提高K562細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例(圖3C)。
[0042]實(shí)施例4 miR-17-5p或miR_20a的抑制劑可逆轉(zhuǎn)K562細(xì)胞對(duì)依托泊苷的耐藥性 使用 Neon 電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將 miR-17-5p、miR-18、miR_19a、miR-19b 或 miR_20a 的抑制劑
轉(zhuǎn)染進(jìn)K562細(xì)胞。48小時(shí)后收集細(xì)胞，使用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞總蛋白，并用BCAProtein Assay Kit進(jìn)行蛋白定量。取等量的總蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳和免疫印跡檢測(cè)，以GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶)看家基因的蛋白產(chǎn)物的表達(dá)水平作為內(nèi)對(duì)照分析各miRNA抑制劑對(duì)促凋亡蛋白Bim-S的表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示僅miR-17-5p和miR-20a的抑制劑能上調(diào)Bim-S蛋白的表達(dá)(圖4A)。
[0043]使用Neon電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將miR-17_5p或miR_20a的抑制劑轉(zhuǎn)染進(jìn)K562細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)染后的K562細(xì)胞接種于96孔板中。48小時(shí)后，分別加入10-80 μ mol/L依托泊苷處理細(xì)胞24小時(shí)(以DMSO作為對(duì)照)，然后采用MTT檢測(cè)細(xì)胞活性。如圖4B所示，miR-17_5p或miR-20a的抑制劑可以增加依托泊苷對(duì)K562細(xì)胞存活率的抑制，并且這種抑制作用與依托泊苷的劑量呈現(xiàn)正相關(guān)性。
[0044]使用Neon電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將miR-17_5p或miR_20a的抑制劑轉(zhuǎn)染進(jìn)K562細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)染后的K562細(xì)胞接種于48孔板中。48小時(shí)后，分別加入40 μ mol/L依托泊苷處理細(xì)胞24小時(shí)(以DMSO作為對(duì)照)，然后收集細(xì)胞通過(guò)AnnexinV-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。miR-17-5p或miR-20a的抑制劑均可提高K562細(xì)胞在依托泊苷下的凋亡率(圖4C)，這些結(jié)果說(shuō)明通過(guò)miR-17-5p或miR-20a的抑制劑抑制miR-17_5p或miR_20a的表達(dá)，可以上調(diào)Bim-S促凋亡蛋白的表達(dá)并逆轉(zhuǎn)K562細(xì)胞對(duì)依托泊苷的耐藥性。
【權(quán)利要求】
1.miR-17-5p和/或miR_20a在制備檢測(cè)和/或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性和/或耐受性的試劑中的應(yīng)用。
2.miR-17-5p和/或miR_20a表達(dá)水平測(cè)定試劑在制備檢測(cè)和/或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性和/或耐受性的試劑中的應(yīng)用。
3.Bim-S促凋亡蛋白在制備檢測(cè)和/或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性和/或耐受性的試劑中的應(yīng)用。
4.Bim-S促凋亡蛋白表達(dá)水平測(cè)定試劑在制備檢測(cè)和/或預(yù)后腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷敏感性和/或耐受性的試劑中的應(yīng)用。
5.Bim-S促凋亡蛋白表達(dá)促進(jìn)劑在提高腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷的敏感性藥物上的應(yīng)用。
6.miR-17-5p和/或miR_20a的抑制物在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)依托泊苷耐受性藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述miR-17-5p或miR_20a的抑制物是針對(duì)miR-17-5p或miR-20a的反義寡核苷酸或其他小分子化合物。
8.miR-17-5p和/或miR_20a的抑制物與依托泊苷聯(lián)合在制備腫瘤治療藥物上的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤治療藥物為抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或誘導(dǎo)腫瘤凋亡的藥物。
10.如上述任一權(quán)利要 求所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為miR-17和/或miR-20a高表達(dá)的腫瘤。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK103520722SQ201310274073
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月2日
【發(fā)明者】翁桁游, 黃慧琳, 周惠, 屈良鵠 申請(qǐng)人:中山大學(xué)