冬凌草甲素聯(lián)合依托泊苷在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了以冬凌草甲素和依托泊苷（etoposide，又稱VP-16、足葉乙甙）為主要成分的組合藥物在治療腫瘤和制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明將兩種作用機制不同的抗腫瘤藥物進行組合，不僅克服了凋亡不敏感細胞對依托泊苷的耐受性，而且大大提高了對腫瘤細胞的抑制和殺傷效果。冬凌草甲素和依托泊苷聯(lián)合使用對腫瘤細胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用要大于兩種藥物單獨使用效果的簡單加和。因此在組合用藥中，可以大大降低冬凌草甲素和依托泊苷的使用劑量，但仍保持較好的抗腫瘤效果。這種高效低毒的抗腫瘤藥物組合可用于治療多種惡性腫瘤，尤其是白血病，包括對依托泊苷耐受的腫瘤。
【專利說明】冬凌草甲素聯(lián)合依托泊苷在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及通過聯(lián)合用藥的方法治療惡性腫瘤及制備抗腫瘤藥物，主要是以冬凌草甲素和依托泊苷為主要活性成分進行組合用藥，不僅能夠增強抗腫瘤療效，還能逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對依托泊苷的耐受性。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]世界衛(wèi)生組織的GL0B0CAN癌癥報告顯示，2008年全球新增癌癥病例約1266萬，其中因癌癥死亡的人數(shù)約為756萬，約占所有死亡人數(shù)的13%。該機構(gòu)也預(yù)測，至2030年，全球每年癌癥新發(fā)病例將增加69%，達2100萬人，而癌癥死亡病例預(yù)計上升72%，死亡人數(shù)將達1300萬人。癌癥仍是且仍將是全球范圍內(nèi)致人死亡的主要原因之一。因此，尋找新的行之有效的癌癥治療藥物或方法，或者改進已有的癌癥治療策略，將對全球人類的健康產(chǎn)生深遠的正面影響。
[0004]化療是腫瘤臨床治療的主要手段之一?；熕幬镆话阃ㄟ^誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的方式起到抗腫瘤的作用。然而，腫瘤細胞凋亡相關(guān)信號通路的紊亂常常導(dǎo)致其對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抗性，這也是腫瘤產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一。腫瘤細胞的耐藥性使得化療藥物的療效被大大削弱，其結(jié)果是腫瘤病人對藥物治療不再敏感。因此，開發(fā)逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的藥物，增強化療藥物的療效，是提高腫瘤治愈率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
[0005]依托泊苷又稱足葉乙甙或VP-16，是一種細胞周期特異性的抗腫瘤藥物，主要作用于細胞周期晚S期或G2期，其靶點為DNA拓撲異構(gòu)酶II，可形成由藥物-酶-DNA三者組成的穩(wěn)定可逆性復(fù)合物從而阻礙受損DNA的修復(fù)。依托泊苷被廣泛應(yīng)用于癌癥的化療方案，包括針對非小細胞肺癌、急性白血病、惡性淋巴瘤、睪丸腫瘤、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、絨毛膜上皮癌、卵巢癌等癌癥的治療。但是，依托泊苷化療存在著比較嚴重的骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)和肝腎損傷等，故需與其他藥物聯(lián)合使用。另外，依托泊苷也存在耐藥性問題。如何逆轉(zhuǎn)依托泊苷的耐藥性，增強其對腫瘤細胞的殺傷作用，是依托泊苷臨床用藥上的一個巨大挑戰(zhàn)。
[0006]冬凌草甲素是提取自我國傳統(tǒng)中草藥冬凌草的一種抗腫瘤活性成分。研究表明冬凌草甲素具有廣譜的抗腫瘤活性，可以通過靶向降解癌蛋白C-Myc從而抑制腫瘤細胞生長及誘發(fā)腫瘤細胞凋亡。另外，冬凌草甲素的活性與細胞中C-Myc蛋白的表達水平具有很好的相關(guān)性，高表達C-Myc的細胞對冬凌草甲素較為敏感，而c-Myc低表達的細胞對冬凌草甲素的敏感性較低。由于c-Myc在約70%的腫瘤中高表達而在正常細胞中呈現(xiàn)低表達，因此這也解釋了為什么冬凌草甲素具有廣譜的抗腫瘤活性以及具有相對較高的安全性。冬凌草甲素也可與化療藥物聯(lián)用起到更強的抗腫瘤作用，例如其與三氧化二砷聯(lián)用時對肝癌細胞的作用更為明顯。然而，至今未有冬凌草甲素與依托泊苷聯(lián)合使用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供新的藥物組合用于腫瘤治療。
[0008]更具體地說，是以冬凌草甲素和依托泊苷為主要成分的組合藥物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用；及冬凌草甲素在逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對依托泊苷耐受性中的應(yīng)用。
[0009]發(fā)明提供了以下技術(shù)方案:
冬凌草甲素或其衍生物或鹽類在制備miR-17-5p和miR-20a表達抑制劑上的應(yīng)用。
[0010]冬凌草甲素或其衍生物或鹽類在制備促凋亡蛋白Bim-S表達促進劑上的應(yīng)用。
[0011]冬凌草甲素或其衍生物或鹽類在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物上的應(yīng)用。
[0012]冬凌草甲素或其衍生物或鹽類在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對于依托泊苷耐藥性藥物上的應(yīng)用。
[0013]冬凌草甲素和依托泊苷聯(lián)用在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述的冬凌草甲素和依托泊苷的摩爾質(zhì)量比為1:廣1:8。
[0014]優(yōu)選地，所述的腫瘤為miR-17和/或miR_20a高表達的腫瘤，包括白血病、淋巴瘤、肺癌、肝癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或乳腺癌等。
[0015] 申請人:經(jīng)過大量研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素可通過抑制miR-17-5p和miR_20a微RNA的表達從而上調(diào)Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白Bim-S的表達，繼而引起腫瘤細胞的生長抑制和凋亡發(fā)生。依托泊苷與冬凌草甲素具有不同的作用機制。在對依托泊苷具有抗性的腫瘤細胞中聯(lián)合使用冬凌草甲素和依托泊苷進行處理，可以有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對于依托泊苷的抗性，使細胞的生長受到明 顯抑制并發(fā)生凋亡。另外，冬凌草甲素和依托泊苷聯(lián)合使用對腫瘤細胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用顯著大于兩種藥物單獨使用效果的簡單加和。
[0016]發(fā)明同時提供了一種治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物組合物，其特征在于以冬凌草甲素和依托泊苷為主要成分。該藥物組合物還可包括可接受的藥用載體制成各種藥學(xué)上可接受的制劑。
[0017]該藥物組合對依托泊苷耐受性的腫瘤也有較強的抑制和殺傷作用，可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對依托泊苷的耐藥性。冬凌草甲素和依托泊苷聯(lián)合使用對腫瘤細胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用要大于兩種藥物單獨使用效果的簡單加和。
[0018]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可用于逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對依托泊苷的耐受性。通過使用冬凌草甲素降低miR-17-5p和/或miR-20a的表達，可以提高腫瘤細胞對依托泊苷的敏感性。通過使用冬凌草甲素上調(diào)Bim-S促凋亡蛋白的表達，可以提高腫瘤細胞對依托泊苷的敏感性。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了冬凌草甲素與依托泊苷聯(lián)合用于制備抗腫瘤藥物的方法，這樣的組合用藥可以在取得較好的抗腫瘤效果的同時大大降低冬凌草甲素和依托泊苷的使用劑量，從而增加藥物的安全性。這種高效低毒的抗腫瘤藥物組合可用于治療多種惡性腫瘤，優(yōu)選的是白血病,包括對依托泊苷耐受的腫瘤。
[0020]另外，本發(fā)明提供了使用冬凌草甲素逆轉(zhuǎn)依托泊苷耐藥性的方法，冬凌草甲素提取自中國傳統(tǒng)草藥冬凌草，其制備工藝成熟，且在小鼠模型中未見明顯毒性，臨床可應(yīng)用性強，這對依托泊苷耐受腫瘤的臨床治療具有潛在的巨大應(yīng)用價值。【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1.實施例1冬凌草甲素與依托泊苷的抗腫瘤活性差異，其中A為冬凌草甲素處理下K562細胞的存活率；B為依托泊苷處理下K562細胞的存活率；C為冬凌草甲素處理下K562細胞的凋亡率；D為依托泊苷處理下K562細胞的凋亡率。
[0022]圖2.實施例2中冬凌草甲素與依托泊苷對miR-17-5p和miR-20a微RNA和Bim-S促凋亡蛋白表達的影響，其中A為定量PCR結(jié)果，顯示冬凌草甲素與依托泊苷對K562細胞中miR-17-5p和miR-20a微RNA成熟體表達的影響；B為免疫印記結(jié)果，顯示冬凌草甲素與依托泊苷對K562細胞中Bim-S蛋白表達水平的影響。
[0023]圖3.實施例3中冬凌草甲素與依托泊苷聯(lián)合的體外協(xié)同增效作用，其中A為冬凌草甲素與依托泊苷聯(lián)合對K562細胞存活率的抑制作用；B為冬凌草甲素與依托泊苷聯(lián)合對K562細胞凋亡率的促進作用。
[0024]圖4.實施例4中冬凌草甲素與依托泊苷聯(lián)合在小鼠移植瘤模型中表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實施例進一步解釋本發(fā)明。實施例中用到的主要材料如下:
冬凌草甲素:購自河南濟世藥業(yè)有限公司，純度經(jīng)高效液相色譜(HPLC)測定大于95%。使用二甲基亞楓(DMSO)配置成40 mmol/L的儲液，凍于-20度，每次使用時用培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。
[0026]依托泊苷:購自Sigma公 司，使用二甲基亞楓(DMSO)配置成100 mmol/L的儲液，凍于-20度，每次使用時用培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。
[0027]細胞系:實施例中所用K562細胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。
[0028]抗體:Bim抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司。
[0029]miRNA定量PCR試劑盒:購自丹麥Exiqon公司。
[0030]實施例1冬凌草甲素與依托泊苷的抗腫瘤活性差異
將K562細胞按3 X 105/mL的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24小時后加入不同5~20 μ mol/L冬凌草甲素或0.100 μ mo I/L依托泊苷處 理細胞(均以DMSO作為對照)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，采用MTT檢測細胞活性。如圖1A所示，冬凌草甲素可以有效抑制K562細胞的存活率，并且這種抑制作用呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。20 ymol/L冬凌草甲素可以使K562細胞的存活率下降60%以上。相比之下，依托泊苷則不能有效抑制K562細胞的存活率(圖1B)。100ymol/L依托泊苷僅能使K562細胞的存活率下降約10% (圖1B)。
[0031]將K562細胞按3X 105/mL的密度接種于48孔板，培養(yǎng)24小時后加入不同10~40μ mo I/L冬凌草甲素或10-100 μ mol/L依托泊苷處理細胞(均以DMSO作為對照)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后收集細胞通過AnnexinV-FITC/PI染色檢測細胞凋亡。冬凌草甲素可顯著誘導(dǎo)K562細胞發(fā)生凋亡。扣除DMSO的影響，冬凌草甲素濃度為20 μ mol/L時凋亡誘導(dǎo)率約60%，濃度為20 μ mol/L時凋亡誘導(dǎo)率約90% (圖1C)。相反，在各個測試濃度下，依托泊苷均不能有效誘導(dǎo)K562細胞發(fā)生凋亡(圖1D)。這些結(jié)果表明K562細胞對依托泊苷具有耐藥性，而對冬凌草甲素則具有很高的敏感性。[0032]實施例2冬凌草甲素與依托泊苷對miR-17-5p、miR-20a微RNA和Bim-S促凋亡蛋白表達的影響
將K562細胞按3X 105/mL的密度接種于24孔板，培養(yǎng)24小時后加入20 μ mol/L冬凌草甲素或10 μ mol/L依托泊苷處理細胞(以DMSO作為對照)。24小時后收集細胞使用Trizol Reagent進行細胞總RNA的提取。采用紫外分光光度計測定RNA濃度。然后將提取的總 RNA用 miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄(42 ° C I hr,95。C 5 min)及實時定量PCR反應(yīng)，以U6 snRNA的表達水平作為內(nèi)對照分析miR-17_5p和miR-20a成熟體微RNA在冬凌草甲素或依托泊苷處理下的表達變化。結(jié)果表明，冬凌草甲素可顯著下調(diào)K562細胞中的miR-17-5p和miR_20a微RNA成熟體的表達水平(圖2A)，而依托泊苷則不能下調(diào)miR-17-5p和miR-20a微RNA成熟體的表達(圖2A)。
[0033]將K562細胞按3 X 105/mL的密度接種于24孔板，培養(yǎng)24小時后加入20 μ mol/L冬凌草甲素或10 μ mol/L依托泊苷處理細胞(以DMSO作為對照)。24小時后收集細胞，使用RIPA細胞裂解液裂解細胞總蛋白，并用BCA Protein Assay Kit (美國Thermo Fisher公司)進行蛋白定量。取等量總蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳和免疫印跡檢測，以GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶)看家基因的蛋白產(chǎn)物的表達水平作為內(nèi)對照分析促K562細胞中促凋亡蛋白Bim-S在冬凌草甲素和依托泊苷處理下的表達變化。如圖2B所示，與DMSO對照組相比，Bim-S促凋亡蛋白在冬凌草甲素誘導(dǎo)下顯著增多，而在依托泊苷處理下則無明顯增加。
[0034]實施例3冬凌草甲素與依托泊苷的體外協(xié)同增效作用
將K562細胞按3 X 105/mL的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24小時后加入10 μ mol/L冬凌草甲素或等量DMSO以及10~80 μ mol/L VP-16或等量DMSO處理細胞。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，采用MTT檢測細胞活性。如圖3A所示，冬凌草甲素可以有效逆轉(zhuǎn)K562細胞對依托泊苷的耐藥性，并且與依托泊苷一起產(chǎn)生協(xié)同增效的作用?？鄢鼶MSO對照的影響，10 μ mol/L冬凌草甲素可使K562細胞的存 活率被抑制約18%，40 μ mol/L依托泊苷可使K562細胞的存活率被抑制約8%，而10 μ mol/L冬凌草甲素與40 μ mol/L依托泊苷聯(lián)合使用可大幅度抑制K562細胞的存活率，抑制率接近50%。
[0035]將K562細胞按3 X 105/mL的密度接種于48孔板，培養(yǎng)24小時后單獨加入10μ mol/L冬凌草甲素或40 μ mol/L依托泊苷處理細胞，或者加入10 μ mol/L冬凌草甲素和40 μ mol/L依托泊苷聯(lián)合處理細胞(均以DMSO作為對照)。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后收集細胞通過AnnexinV-FITC/PI染色檢測細胞凋亡。如圖3B所示，扣除DMSO的影響，10 μ mol/L冬凌草甲素單獨使用可以誘導(dǎo)約12%的細胞發(fā)生凋亡，40 μ mol/L依托泊苷單獨使用可以誘導(dǎo)約7%的細胞發(fā)生凋亡。而當(dāng)10 μ mol/L冬凌草甲素與40 μ mol/L依托泊苷聯(lián)合使用時，細胞的凋亡率上升至約30%，明顯高于兩個藥物單獨使用時凋亡率的加和。這些結(jié)果不僅說明冬凌草甲素可以逆轉(zhuǎn)K562細胞對依托泊苷的耐藥性，也說明冬凌草甲素與依托泊苷呈現(xiàn)協(xié)同增效的抗腫瘤作用。
[0036]實施例4冬凌草甲素與依托泊苷的體內(nèi)協(xié)同增效作用
將K562細胞經(jīng)皮下注射入BALB/C nude小鼠(7周齡，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心)構(gòu)建K562移植瘤小鼠模型，在平均瘤大小達到10(Tl50 mm3時，將小鼠分成四組(DMS0對照組、依托泊苷組、冬凌草甲素組、依托泊苷與冬凌草甲素聯(lián)用組)，每組3只。每三天通過腹腔注射給藥一次，對照組注射安慰劑(2% DMSO, 98%生理鹽水)，依托泊苷組注射10mg/kg的依托泊苷，冬凌草甲素組注射10mg/kg的冬凌草甲素，聯(lián)用組注射10mg/kg的依托泊苷以及10mg/kg的冬凌草甲素。每天用游標(biāo)卡尺測量瘤的長徑和短徑，按公式:體積=長徑X短徑2X0.5計算瘤體積。結(jié)果表明冬凌草甲素與依托泊苷聯(lián)用可顯著逆轉(zhuǎn)移植瘤對依托泊苷的耐藥性， 兩種藥物呈現(xiàn)明顯的協(xié)同作用，大大減慢移植瘤的生長速度(圖4)。
【權(quán)利要求】
1.冬凌草甲素或其衍生物或鹽類在制備原癌基因miR-17-5p和miR-20a表達抑制劑上的應(yīng)用。
2.冬凌草甲素或其衍生物或鹽類在制備促凋亡蛋白Bim-S表達促進劑上的應(yīng)用。
3.冬凌草甲素或其衍生物或鹽類在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物上的應(yīng)用。
4.冬凌草甲素或其衍生物或鹽類在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對于依托泊苷耐藥性藥物上的應(yīng)用。
5.冬凌草甲素和依托泊苷聯(lián)用在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的冬凌草甲素和依托泊苷的摩爾質(zhì)量比為 1:1~1:8。
7.如權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為miR-17和/或miR-20a高表達的腫瘤。
8.如權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為白血病、淋巴瘤、肺癌、肝癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
9.一種治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物組合物，其特征在于以冬凌草甲素和依托泊苷為主要成分。
10.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于還包括可接受的藥用載體制成各種藥學(xué)上可接受的制劑。
【文檔編號】A61P35/02GK103463117SQ201310273969
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月2日
【發(fā)明者】翁桁游, 黃慧琳, 周惠, 屈良鵠 申請人:中山大學(xué)