專利名稱：一種調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法和用途。
背景技術(shù)：
葡萄糖是體內(nèi)必需的營(yíng)養(yǎng)物，為細(xì)胞提供主要的能量來(lái)源，因此，血糖水平的穩(wěn)定十分重要，糖代謝失衡會(huì)導(dǎo)致包括糖尿病在內(nèi)的代謝性疾病。體內(nèi)血糖平衡是由多種因素共同調(diào)節(jié)的，其中包括飲食中的糖類的消耗及小腸的吸收速率，外周組織如肌肉、脂肪對(duì)糖的吸收，糖在腎小管的損失以及肝臟中清除和釋放糖的速率。在這一系列的過(guò)程中，肝臟在血糖穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵性的作用，通過(guò)糖原合成儲(chǔ)存糖，糖酵解消耗糖以及糖原降解和糖異生作用釋放糖的一系列活動(dòng)來(lái)平衡血糖水平[Nordlie RC等人，1999, Annu Rev Nutr19:379-406]。在肝臟中發(fā)生的糖酵解及糖異生過(guò)程是受多種酶的調(diào)節(jié)的。其中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)及葡萄糖-6-磷酸酶(G6pase)在糖異生過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，而葡萄糖激酶(Gck)則是糖酵解過(guò)程中的重要激酶。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)是糖異生過(guò)程中的第一個(gè)限速酶，催化草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸。在肝臟中過(guò)表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)，小鼠表現(xiàn)出高血糖，此外還呈現(xiàn)出肝糖原及肌肉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (Glut4) mRNA水平降低等與胰島素耐受相關(guān)的癥狀，表明在肝臟中過(guò)表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)會(huì)導(dǎo)致2型糖尿病[Valera A等人，1994,Proc Natl Acad Sci U S A 91: 9151-9154]。葡萄糖_6_憐酸酶(G6pc)的作用是催化葡萄糖-6-磷酸水解成葡萄糖，這是糖異生和糖原降解過(guò)程中的最后一步，經(jīng)過(guò)葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)催化形成的葡萄糖再在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(Glut2)的作用下離開(kāi)肝臟[van Schaftingen E 等人,2002, Biochem J 362: 513-532]。葡萄糖-6-憐酸酶(G6pc)在維持正常血糖的過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。在糖尿病患者中，由于胰島素耐受或低胰島素血癥，使得葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)基因的表達(dá)量上調(diào)[van de Werve G等人，2000,Eur J Biochem 267: 1533-1549]。葡萄糖通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(Glut2)被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肝臟后進(jìn)行的第一個(gè)代謝活·動(dòng)就是在葡萄糖激酶(Gck)的催化下被磷酸化成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸再通過(guò)一系列活動(dòng)進(jìn)入糖酵解或參與糖原合成[Agius L等人，2008，Biochem J 414:1-18 ；ffang R 等人，2013，Gene 516: 248-254]。葡萄糖激酶(Gck)主要在肝臟中表達(dá)，在其他與血糖調(diào)節(jié)有關(guān)的組織中也有表達(dá)，可以作為葡萄糖的感應(yīng)器來(lái)控制胰島素的分泌[Matschinsky FM等人,2006, Diabetes 55:1-12]。葡萄糖激酶(Gck)在血糖的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，人葡萄糖激酶(Gck)基因的突變與年輕的成年發(fā)病型糖尿病2型(M0DY2)相關(guān)。胰島細(xì)胞和肝細(xì)胞中的葡萄糖激酶(Gck)基因的缺失都會(huì)引起高血糖，導(dǎo)致 M0DY2 [Postic C 等人，1999，J Biol Chem 274:305-315，Zhang YL 等人，2004，Acta Pharmacol Sin 25:1659-1665]。肝糖代謝異常是糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝等代謝綜合癥的主要病理因素。高血糖作為糖尿病的主要臨床癥狀，其產(chǎn)生與肝臟及外周組織對(duì)葡萄糖的利用減少、肝糖生成增多有關(guān)。因此，針對(duì)糖代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，有效促進(jìn)肝臟中糖酵解過(guò)程，提高葡萄糖的消耗，抑制肝臟中過(guò)度的糖異生，減少內(nèi)源性葡萄糖的生成，將是治療糖尿病的重要靶向之一和治療關(guān)鍵及難點(diǎn)。FADD (Fas-associated death domain protein, Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白)是Chinnaiyan、Boldin等研究小組利用酵母雙雜交系統(tǒng)于1995年同時(shí)篩選得到的一個(gè)能夠與死亡受體Fas胞漿區(qū)特異性作用的蛋白，由于其包含一個(gè)與Fas蛋白質(zhì)的死亡結(jié)構(gòu)域高度同源的結(jié)構(gòu)域，因而被命名為Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-associated deathdomain protein, FADD) [Boldin, M.P.等人，1995，J.Biol.Chem.270:7795-7798;Chinnaiyan, A.M.等人，1995，Cell 81:505- 512]。人 FADD 基因編碼 208 個(gè)氨基酸，分子量為23kDa，大概可分為三個(gè)功能區(qū)域，包括與凋亡相關(guān)的N端約76個(gè)氨基酸的DED (deatheffect domain,死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域)和C端70個(gè)氨基酸的DD (death domain,死亡結(jié)構(gòu)域)，以及在非凋亡中發(fā)揮作用的大約20個(gè)氨基酸的C末端片段。FADD的C末端片段的磷酸化含有一個(gè)磷酸化位點(diǎn)(人194位絲氨酸、鼠191位絲氨酸)引起的[Hua ZC等人,2003, Immunity18:513-521]。作為細(xì)胞內(nèi)的接頭蛋白，F(xiàn)ADD能夠介導(dǎo)多種死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，在多種細(xì)胞系中能誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，是一個(gè)經(jīng)典的凋亡信號(hào)分子。在死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中，死亡信號(hào)(如Fas L)與死亡受體(如Fas)結(jié)合、導(dǎo)致死亡受體(如Fas)胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域形成三聚體，從而通過(guò)結(jié)合FADD的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)招募FADD蛋白質(zhì)，并引起FADD構(gòu)象改變， 使其DED多聚化,進(jìn)而招募胱氨酸蛋白酶8 (caspase 8)前體集聚，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(death-1nducing signaling complex, DISC),通過(guò)產(chǎn)生有活性的caspase 8,從而激發(fā)一系列下游caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘發(fā)細(xì)胞凋亡。FADD作為凋亡信號(hào)途徑的連接蛋白，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著舉足輕重的作用[趙丹，2006，國(guó)際免疫學(xué)雜志 29:152-156 ；Tourneur, L.等人，2003，Oncogene22:2795-2804] o FADD表達(dá)的缺失與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[Shin, E.C.等人，1998，CancerLett.134:155-162 ； Sun, B.等人，2000,Zhong Hua Gan Zang Bing Za Zhi 8:37-39]。FADD蛋白表達(dá)強(qiáng)度與HCC細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，F(xiàn)ADD蛋白表達(dá)量越高，其細(xì)胞凋亡程度也相對(duì)較高[陸東東等人，2002，臨床肝膽病雜志，18:375-376]。在許多腎癌患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞中的FADD表達(dá)量明顯降低[Xu, H.等人,2009, Cancer Invest,網(wǎng)絡(luò)版:2009 Jun25:1]。FADD表達(dá)異常在非小細(xì)胞肺癌中也能起到重要作用[Shin，M.S.等人，2002，Oncogene 21:4129-4136]。針對(duì)FADD在細(xì)胞凋亡中的銜接和橋梁作用以及其與多種疾病的關(guān)系，已有學(xué)者開(kāi)始嘗試?yán)肍ADD能夠誘導(dǎo)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物特性來(lái)進(jìn)行疾病的治療。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD過(guò)表達(dá)可促進(jìn)惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染FADD基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，85%的膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡[Kondo, S.等人，1998,Human Gene Therapy 9:1599-1608]。利用含F(xiàn)ADD基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，在體內(nèi)和體外都能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的存活。另有研究表明FADD基因的表達(dá)可以有效地誘導(dǎo)粘液表皮樣癌細(xì)胞的凋亡[劉大慶等人，2002，口腔頜面外科雜志，12:317-320]。除外還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ADD的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物引起的細(xì)胞死亡和細(xì)胞毒作用的敏感性，達(dá)到更好的治療[Mishima，K.等人，2003，Int.J.Cancer 105:593-600 ；Micheau, 0.等人，1999，J.Biol.Chem.274:7987 -7992 ；Yin, A.等人，Med.0ncol.網(wǎng)絡(luò)版:2009 May 5]。FADD除了在腫瘤治療中有重要的應(yīng)用前景外，研究表明Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞退行性變的主要原因之一，其中FADD-caspase-8的信號(hào)傳導(dǎo)途徑在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的滑膜細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[Kobayashi，T.等人，1999，Curr.0pin.Rheumatol.11:188 -193]。利用腺病毒轉(zhuǎn)染將FADD基因轉(zhuǎn)入類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜細(xì)胞后，可引起因過(guò)度增殖導(dǎo)致病變的滑膜細(xì)胞的凋亡。另外，在免疫缺陷的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型小鼠中局部注射腺病毒-FADD (Ad-FADD)后可清除病變的滑膜細(xì)胞，并且此效果局限于滑膜組織，而不引起鄰近的軟骨細(xì)胞凋亡。因而FADD過(guò)表達(dá)可有效地治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[Kobayashi, T 等人，2000, Gene Therapy 7:527-533]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法，其特征在于:表達(dá)模擬Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的基因，或者以Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化程度為指證篩選提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的物質(zhì)，上述方法的共同目的是提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化。進(jìn)一步的，一種調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法，其特征在于:調(diào)節(jié)降低磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶活性，提高葡萄糖激酶活性。進(jìn)一步的，一種調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法在制備治療糖代謝疾病藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步的，上述調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法在制備治療糖代謝疾病藥物中的應(yīng)用，與現(xiàn)有糖代謝疾病治療藥物和技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。進(jìn)一步的，一種藥物組合物，其特征在于:圍繞一種調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法、利用藥學(xué)上常規(guī)的載體或賦形劑或稀釋劑進(jìn)行的組合配方。進(jìn)一步的，一種調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法，其特征在于通過(guò)調(diào)節(jié)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)糖酵解和糖異生的調(diào)節(jié)。所述調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法，不僅能夠降低磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶活性，而且能夠提高葡萄糖激酶活性。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種通過(guò)篩選能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化的物質(zhì)的方法，其特征是以Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化程度的變化為指證篩選能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的物質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)糖酵解和糖異生的調(diào)節(jié)。所述的能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的物質(zhì)，包括了能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化水平的大分子物質(zhì)，例如，蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂肪酸、維生素及其納米分子等；也包括了能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化水平的小分子物質(zhì)，例如，天然產(chǎn)物、化學(xué)合成或者化學(xué)改造的產(chǎn)物、有機(jī)小分子、無(wú)機(jī)分子等。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種通過(guò)引入模擬Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的基因進(jìn)行表達(dá)，從而調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法。所述的模擬Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的基因，其特征是指人Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的第194位絲氨酸突變?yōu)樘於彼峄蛘吖劝彼岬娜薋as相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白突變基因。上述模擬Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的基因可用于基因治療。在本發(fā)明的第四方面，提供了如上述的調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法在制備糖代謝治療藥物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括了通過(guò)篩選獲得的能夠提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化的物質(zhì)或者模擬Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的基因單獨(dú)用于制備糖代謝治療藥物，或與現(xiàn)有的糖代謝治療藥物組成組合物，或與現(xiàn)有化學(xué)藥物治療、中藥治療、生物治療、物理治療等方法在糖代謝治療中聯(lián)合運(yùn)用。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求1所述的調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法。在本發(fā)明的第六方面，提供了如上述的調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法在制備糖尿病治療藥物中的具體應(yīng)用。同現(xiàn)有糖代謝疾病方法相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
(I)實(shí)現(xiàn)了通過(guò)對(duì)肝臟糖酵解和糖異生的同時(shí)調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)控糖代謝:目前常用的調(diào)節(jié)糖代謝的方法一般都是調(diào)節(jié)或者直接增加胰島素的水平，或者調(diào)節(jié)對(duì)胰島素的敏感性，來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的作用。而本專利則是通過(guò)同時(shí)調(diào)節(jié)肝臟糖酵解和糖異生來(lái)有效降低血糖水平。(2)首次實(shí)現(xiàn)了通過(guò)對(duì)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)控糖代謝:本發(fā)明首次通過(guò)實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)經(jīng)典的細(xì)胞凋亡蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)，從而有效降低血糖水平。(3)首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝臟糖酵解和糖異生的同時(shí)調(diào)控:糖酵解和糖異生是兩個(gè)不同的過(guò)程。本發(fā)明通過(guò)對(duì)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)了顯著下調(diào)肝臟中與糖異生密切相關(guān)的葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(P^ck)的表達(dá)量，從而降低葡萄糖的生成；同時(shí)本發(fā)明又通過(guò)對(duì)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)了顯著上調(diào)參與糖酵解的關(guān)鍵酶一葡萄糖激酶(Gck)的表達(dá)量，提高了糖的利用，最終降低了血糖水平。(4)首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)肝臟糖酵解和糖異生的多個(gè)關(guān)鍵酶的協(xié)同調(diào)控:本發(fā)明通過(guò)對(duì)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)了蛋白激酶B (Akt)磷酸化及其下游蛋白轉(zhuǎn)錄因子Foxol磷酸化的調(diào)控，繼而調(diào)節(jié)了轉(zhuǎn)錄因子Foxol下游的葡萄糖_6_磷酸酶(G6pc)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)的表達(dá)。本發(fā)明通過(guò)最終調(diào)節(jié)肝臟中與糖異生密切相關(guān)的葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)，糖酵解關(guān)鍵酶一葡萄糖激酶(Gck)的協(xié)同調(diào)控，從而顯著有效地降低了血糖水平。(5)提供了一種新的篩選調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生藥物或者治療方法的方法:本發(fā)明提供了一種通過(guò)調(diào)控Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法，利用Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化做指標(biāo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用目前常規(guī)的檢測(cè)方法篩選能夠調(diào)節(jié)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化的物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂肪酸、維生素及其納米分子等大分子物質(zhì)，也包括天然產(chǎn)物、化學(xué)合成或者化學(xué)改造的產(chǎn)物、有機(jī)小分子、無(wú)極分子等小分子物質(zhì)。


為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚地理解，下面根據(jù)具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中 圖1.FADD磷酸化對(duì)血糖水平及血清中相關(guān)激素水平的影響。
圖1A.禁食和正常狀態(tài)下小鼠的血糖含量:1.禁食狀態(tài)下的正常對(duì)照小鼠；2.禁食狀態(tài)下的FADD磷酸化小鼠；3.正常狀態(tài)下的對(duì)照小鼠；4.正常狀態(tài)下的FADD磷酸化小鼠。圖1B.禁食狀態(tài)下小鼠血清中的胰島素水平:1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化小鼠；
圖1C.禁食狀態(tài)下小鼠血清中糖依賴性胰島素釋放肽(GIP)水平:1.正常對(duì)照小鼠；
2.FADD磷酸化小鼠；
圖1D.禁食狀態(tài)下小鼠血清中胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)水平:1.正常對(duì)照小鼠；
2.FADD磷酸化小鼠。據(jù)表示成平均值土SEM海組6-13只小鼠)。收集9_11周小鼠的血液進(jìn)行生化分析。通過(guò)t-test進(jìn)行顯著性分析，* P < 0.05。圖2.FADD磷酸化對(duì)小鼠糖耐受能力及胰島素敏感性的影響。圖2A.葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)。小鼠按1.0 g/kg的劑量腹腔注射葡萄糖，隔特定的時(shí)間間隔檢測(cè)葡萄糖水平(每組3只小鼠)，白色菱形表示對(duì)照小鼠，黑色方形表示FADD磷酸化小鼠；
圖2B.葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)中，血糖曲線下面積:1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化小鼠；圖2C.胰島素敏感性實(shí)驗(yàn)。小鼠按0.5 U/kg的劑量腹腔注射胰島素，隔特定的時(shí)間間隔檢測(cè)葡萄糖水平(每組3只小鼠)，白色菱形表示對(duì)照小鼠，黑色方形表示FADD磷酸化小鼠；
圖2D.胰島素敏感性實(shí)驗(yàn)中，胰島 素注射后葡萄糖降低的總量:1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化小鼠；數(shù)據(jù)都表示成平均值土SEM。通過(guò)t-test進(jìn)行顯著性分析，* P < 0.05，**P〈0.01，_P〈0.001。圖3.FADD磷酸化對(duì)糖代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)量的影響。圖3A.小鼠肝臟中糖代謝關(guān)鍵酶的Western blot結(jié)果,包括Pepck、G6pc和Gck,以Tub I in作為內(nèi)標(biāo):1.正常對(duì)照小鼠；2.FADD磷酸化小鼠；
圖3B.小鼠肝臟中糖代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平:1.G6pc ；2.Pepck ；3.Gck ；
4.Foxol ;其中，白色為正常對(duì)照小鼠,黑色為FADD磷酸化小鼠。每組4_6只小鼠,每個(gè)樣三個(gè)重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)標(biāo)；
圖3C.胰島素處理后，取小鼠的肝臟制樣做Western Blot，檢測(cè)pAkt、Akt和GAPDH的蛋白含量，右圖為對(duì)Western Blot結(jié)果中pAkt的定量分析:1.胰島素刺激前的對(duì)照小鼠；
2.胰島素刺激后的對(duì)照小鼠；3.胰島素刺激前的FADD磷酸化小鼠；4.胰島素刺激后的FADD磷酸化小鼠；
圖3D.小鼠肝臟切片F(xiàn)oxol的免疫熒光，Hoechst染核(每組3只小鼠)，標(biāo)尺=20Mm ;數(shù)據(jù)都表示成平均值土SEM。通過(guò)t-test進(jìn)行顯著性分析，* P < 0.05, **P〈0.01，林*P〈0.001。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)磷酸化對(duì)血糖水平及血清中相關(guān)激素水平的影響 所有的實(shí)驗(yàn)小鼠都是在通風(fēng)無(wú)菌，恒溫恒濕的SPF級(jí)別環(huán)境下進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖的。小鼠可以自由獲取水和飼料。FADD磷酸化小鼠的繁殖按照之前文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的方法進(jìn)行[Hua ZC等人，2003，Immunity 18:，513—521]。通過(guò)PCR方法進(jìn)行基因鑒定。小鼠饑餓過(guò)夜。血糖含量通過(guò)血糖儀(Roche, Mannheim, Germany)進(jìn)行檢測(cè)。血清中膜島素含量用 Rat/Mouse Insulin ELISA試劑盒(Millipore, Billerica, MA, USA)進(jìn)行檢測(cè)。血清中的糖依賴性胰島素釋放肽(GIP)、胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)水平通過(guò)懸液芯片進(jìn)行檢測(cè)(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)。由于正常狀態(tài)下，F(xiàn)ADD以非磷酸化為主，磷酸化形式只在特定的生理及病理狀態(tài)下才存在。為了觀察FADD磷酸化對(duì)糖代謝的影響，本專利構(gòu)建了模擬FADD磷酸化的基因改造小鼠(將小鼠FADD基因191位絲氨酸突變?yōu)樘於彼?，以此模擬磷酸化的FADD，該種模型已經(jīng)為國(guó)際公認(rèn))[Hua ZC等人，2003，Immunity 18:513-521]。對(duì)FADD磷酸化小鼠的血糖(glucose)的檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)ADD磷酸化小鼠的血糖水平無(wú)論是在正常情況下還是在禁食條件下都明顯低于其同窩對(duì)照小鼠，其血糖水平約為對(duì)照小鼠的2/3，如圖1 A所示。血糖的平衡在一定程度上是受激素水平的調(diào)節(jié)，胰腺中分泌的胰島素(insulin)在血糖的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，因此，本專利也檢測(cè)了血清中胰島素的含量，圖1 B表明FADD磷酸化小鼠血清中胰島素的含量高于對(duì)照小鼠。此外，本專利還檢測(cè)了血清中其他與糖尿病相關(guān)的激素的水平。糖依賴性胰島素釋放肽(GIP)和胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)在FADD磷酸化小鼠中也上調(diào)(圖1C和1D)，它們可以促進(jìn)胰島素的分泌，與我們觀察到的血清中的高胰島素水平一致。因此，F(xiàn)ADD磷酸化小鼠中胰島素水平升高、促進(jìn)胰島素升高的胰島素釋放肽(GIP)和胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)水平也升高，從而導(dǎo)致血糖降低。實(shí)施例2
FADD磷酸化對(duì)小鼠糖耐受能力及胰島素敏感性的影響
在葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)中，小鼠饑餓過(guò)夜后腹腔注射葡萄糖(1.0 g/kg)，于注射后0、15、30,60及90分鐘后測(cè)血糖含量。在胰島素耐受實(shí)驗(yàn)中，小鼠饑餓6小時(shí)后，腹腔注射胰島素(0.5 U/kg)。注射后0、15、30、60及90分鐘后測(cè)血糖含量。為了進(jìn)一步研究小鼠中FADD磷酸化對(duì)于葡萄糖穩(wěn)態(tài)的影響，本發(fā)明進(jìn)行了腹腔注射的葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)(IPGTT)和胰島素耐受實(shí)驗(yàn)(IPITT)。在葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)(IPGTT)中，F(xiàn)ADD磷酸化小鼠的血糖水平明顯比對(duì)照小鼠降低了很多(圖2A)。葡萄糖刺激后的血糖升高的曲線下面積數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)ADD磷酸化小鼠曲線下面積僅為正常對(duì)照小鼠的2/3 (圖2 B)。這表明FADD磷酸化小鼠在葡萄糖刺激下對(duì)葡萄糖的清除能力增強(qiáng)。本發(fā)明還進(jìn)行了腹腔注射的胰島素耐受實(shí)驗(yàn)(IPITT)，以檢測(cè)胰島素的敏感性在FADD磷酸化小鼠中是否發(fā)生變化。胰島素注射后，雖然FADD磷酸化小鼠的血糖下降到比對(duì)照小鼠低很多(圖2C)，但是它們相對(duì)的血糖下降水平的變化近似(圖2D)，表明FADD磷酸化小鼠的胰島素敏感性變化不顯著。實(shí)施例3
FADD磷酸化對(duì)糖代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)量的影響
免疫熒光:從動(dòng)物體中取出的肝臟固定在10%的磷酸緩沖福爾馬林中，石蠟包埋后，切成5Mm厚度的薄片,用ant1-Foxol的抗體作為一抗定位肝臟中的Foxol,用Alexa Fluor488-conjugated ant1-rabbit IgG抗體作為二抗，Hoechst染核。突光顯微鏡進(jìn)行觀察。Western Blot: 小鼠饑餓過(guò)夜后腹腔注射lU/kg胰島素。15分鐘后處死并取肝臟。組織在細(xì)胞裂解液(50 mM Tris-HCl, pH 7.4，250 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mMEDTA, 5 mM磷酸甘油，I mM Na3V04, 1% NP40)中勻漿后12,000 rpm離心，收集上清，并用Bradford方法檢測(cè)蛋白濃度。等量(約5(^g)蛋白用12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜中。然后分別用 Akt、phospho-Akt (Ser 473)、G6pc、Pepck、Gck 的抗體進(jìn)打檢驗(yàn)。RNA 提取及定量實(shí)時(shí) PCR:用 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)處理組織后根據(jù)附帶的說(shuō)明書(shū)提取RNA,然后用PrimeScript RT reagent Kit (Takara,Otsu, Shiga, Japan)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。定量實(shí)時(shí)PCR (qRT-PCR)在ABI機(jī)器(Applied Biosystems, Foster City.CA, USA)上進(jìn)行。引物如下:mG6pc:正向引物:5’ -TCGGAGACTGGTTCAACCTC-3’ ；反向引物:5’ -ACAGGTGACAGGGAACTGCT-3’ ；mGck:正向引物:5’ -GAGGTCGGCATGATTGTGGGCA-3’ ；反向引物:5’-ACACACATGCGCCCCTCATCGCC-3，；mPepckl:正向引物:5’ -CTAACTTGGCCATGATGAACC-3’ ;反向引物:5，-CTTCACTGAGGTGCCAGGAG-3，；mFoxol:正向引物:5，-TGTCAGGCT AAGAGTTAGTGAGCA-3，；反向引物:5’ -GGGTGAAGGGCATCTTTG-3’ ；mGAPDH:正向引物:5’ -ACTGAGGACCAGGTTGTC-3’ ；反向引物:5’-TGCTGTAGCCGTATT CATTG-3’ ；。所有的結(jié)果都是3次實(shí)驗(yàn)的平均值，以GAPDH作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)分析:所有的數(shù)據(jù)結(jié)果都表示成平均值土 SEM。用Prism software(GraphPad, San Diego, CA)中的 two-tailed Student’s t-test 進(jìn)行兩種基因型之間的差異性分析。當(dāng)P值小于0.05時(shí)被認(rèn)為數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肝臟是糖代謝的主要場(chǎng)所，對(duì)血糖的平衡起著關(guān)鍵作用。因此，本發(fā)明檢測(cè)了肝臟中參與糖異生和糖酵解過(guò)程的關(guān)鍵蛋白，觀察這些蛋白的表達(dá)是否受FADD磷酸化的影響。結(jié)果顯示，葡萄糖 -6-磷酸酶(G6pc)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)及葡萄糖激酶(Gck)這三個(gè)參與糖代謝的酶的蛋白和mRNA水平在FADD磷酸化小鼠中均發(fā)生了顯著的變化(圖3A、3B)。糖異生過(guò)程中的限速蛋白葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)均下調(diào)，降低了內(nèi)源性葡萄糖的生成；而葡萄糖激酶(Gck)表達(dá)的增加，則力口速了糖酵解的過(guò)程，促進(jìn)了體內(nèi)葡萄糖的利用。為了深入探討FADD磷酸化的降血糖作用，本發(fā)明觀察了在血糖平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用的胰島素信號(hào)通路。在靜息狀態(tài)下，F(xiàn)ADD磷酸化小鼠肝臟中的蛋白激酶B (Akt)磷酸化程度上升(圖3C)。胰島素刺激后，蛋白激酶B (Akt)的磷酸化程度在FADD磷酸化小鼠中依然上調(diào)。但是通過(guò)對(duì)Western bolt結(jié)果的定量分析，我們發(fā)現(xiàn)，雖然胰島素刺激后，F(xiàn)ADD磷酸化小鼠蛋白激酶B (Akt)的磷酸化程度仍高于正常對(duì)照小鼠(圖3C)，但是相對(duì)于基底水平的上調(diào)幅度，F(xiàn)ADD磷酸化與對(duì)照小鼠沒(méi)有顯著差異，相反FADD磷酸化小鼠的上調(diào)幅度略低于對(duì)照小鼠。這表明FADD磷酸化小鼠對(duì)胰島素的敏感性沒(méi)有變化，這與之前的胰島素耐受實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的(圖2)。本發(fā)明還檢測(cè)了蛋白激酶B(Akt)的下游蛋白轉(zhuǎn)錄因子Foxol。非磷酸化形式的轉(zhuǎn)錄因子Foxol —般在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá),被蛋白激酶B (Akt)激活后的磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子Foxol出核。過(guò)表達(dá)磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子Foxol可以顯著降低血糖水平。肝臟組織切片的轉(zhuǎn)錄因子Foxol的免疫熒光染色結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)錄因子Foxol基本上均出核；而在正常對(duì)照小鼠中，轉(zhuǎn)錄因子Foxol大部分都在核內(nèi)分布(圖3D)。這表明FADD的磷酸化可以提高蛋白激酶B(Akt)活性，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子Foxol的磷酸化水平也升高。而Foxol作為轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)基因的表達(dá)。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)錄因子Foxol磷酸化后出核，抑制了葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)的表達(dá)，這個(gè)結(jié)果與本發(fā)明圖3A和3B中觀察到的這兩個(gè)基因的蛋白和mRNA水平降低完全一致。FADD的磷酸化可以影響參與糖代謝過(guò)程中葡萄糖_6_磷酸酶(G6pc)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepckl)、葡萄糖激酶(Gck)這些關(guān)鍵酶的表達(dá)，從而促進(jìn)糖酵解對(duì)糖的利用，抑制糖異生引起的葡萄糖的生成，最終提高機(jī)體對(duì)葡萄糖的清除能力，降低血糖水平。FADD磷酸化對(duì)血糖平衡的影響在一定程度上與蛋白激酶B (Akt)磷酸化水平的上調(diào)有關(guān)。因此，本發(fā)明FADD磷酸化為治療包括糖尿病在內(nèi)的糖代謝疾病提供了一個(gè)新的藥物靶點(diǎn)。利用FADD磷酸化水平作為篩選標(biāo)志就可以獲得可以調(diào)控FADD磷酸化的物質(zhì)，從而發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)糖代謝的藥物。本發(fā)明通過(guò)轉(zhuǎn)入一個(gè)模擬FADD磷酸化的FADD突變基因，直接實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepckl)、葡萄糖激酶(Gck)這些關(guān)鍵酶的表達(dá)的調(diào)控，從而有效地調(diào)節(jié)了包括血糖水平在內(nèi)的糖代謝。因此，模擬FADD磷酸化的FADD突變基因的基因治療必然成為調(diào)節(jié)糖代謝疾病的一種有效手段。因此，通過(guò)FADD磷酸化調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法能夠直接應(yīng)用于糖代謝疾病治療藥物的發(fā)現(xiàn)、制備，和治療。該方法并且能夠與現(xiàn)有化學(xué)藥物治療、中藥治療、生物治療、物理治療等糖代謝治療方法聯(lián)合運(yùn)用，產(chǎn)生更好的治療效果。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考一樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上訴講授內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種修 改或改動(dòng)，這些等價(jià)形式均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法，其特征在于:表達(dá)模擬Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的基因，或者以Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化程度為指證篩選提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白磷酸化的物質(zhì)，上述方法的共同目的是提高Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法，其特征在于:調(diào)節(jié)降低磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶活性，提高葡萄糖激酶活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法在制備治療糖代謝疾病藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法在制備治療糖代謝疾病藥物中的應(yīng)用，其特征是與現(xiàn)有糖代謝疾病治療藥物和技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用。
5.一種藥物組合物，其特征在于:圍繞權(quán)利要求1所述的調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法、利用藥學(xué)上常規(guī)的載體或賦形劑或稀釋劑進(jìn)行的組合配方。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法在制備治療糖尿病藥物中的 應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生的方法和用途。該方法通過(guò)調(diào)節(jié)Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的磷酸化調(diào)控糖代謝關(guān)鍵酶，有效促進(jìn)肝臟糖酵解、抑制肝臟糖異生，從而降低血糖，能夠用于糖代謝治療藥物的篩選及制備糖代謝治療藥物。
文檔編號(hào)A61P3/10GK103239736SQ20131018297
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月16日
發(fā)明者華子春, 姚淳 申請(qǐng)人:南京大學(xué)