一種蟾皮組合物、其制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蟾皮提取物、其制備方法及其用途。特別是該蟾皮提取物由蟾皮提取，并利用葡聚糖凝膠等高分子填料進(jìn)行分離純化得到多肽類有效部位，其分子量在1000～10000(Da)。利用本方法制備的多肽類純度能夠控制在70％以上。經(jīng)過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本組合物具有抗腫瘤作用和鎮(zhèn)痛效果，可用于抗癌輔助藥物，或者治療或緩解疼痛的醫(yī)藥產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。
【專利說(shuō)明】一種蟾皮組合物、其制備方法及用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬中藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種蟾皮組合物、其制備方法及用途。其中特別涉及一種主要為多肽類成分的蟾皮提取物，其分子量范圍是1000?1000(Da)。

【背景技術(shù)】
[0002]蟾皮為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的干燥皮，具有清熱解毒、利水消脹之功效，臨床用于治療癰疽、腫毒、腫瘤、疳積腹脹、慢性氣管炎等病癥。蟾皮水溶性部位開(kāi)發(fā)的藥品已有多個(gè)上市，尤其華蟾素注射液，是從中華大蟾蜍皮經(jīng)加工制成的水溶性制齊U，治療原發(fā)性肝癌和中晚期肺癌分別獲得44%和56%的綜合有效率，瘤體縮小率分別為10%和16%，且對(duì)化療和放療具有協(xié)同作用。臨床應(yīng)用表明華蟾素注射液具有解毒、消腫、止痛之功效，用于治療中、晚期腫瘤、慢性乙型肝炎等癥，其生理活性物質(zhì)主要是蟾蜍毒素類(bufotoxins)及其水解產(chǎn)物蟾毒配基類(bufageins)、蟾毒色胺類(bufoteinines)等。
[0003]從蟾蜍(主要是蟾皮)中已經(jīng)確定的化合物來(lái)看,其成分主要可以分為:蟾毒配基類、蟾蜍毒素類、蟾毒色胺類三大類以及膽留醇、多肽、氨基酸等其他化合物。但蟾皮的藥用價(jià)值還沒(méi)有得到充分的開(kāi)發(fā)利用。目前為止，國(guó)內(nèi)外關(guān)于蟾蜍以及華蟾素的研究焦點(diǎn)主要集中在其脂溶性蟾毒配基類等成分。該類成分具有明顯的細(xì)胞毒性抗腫瘤活性，同時(shí)也具有較強(qiáng)的毒副作用。可見(jiàn)，華蟾素在腫瘤治療方面的良好表現(xiàn)，不僅來(lái)源于蟾毒內(nèi)酯類成分。根據(jù)我們的研究結(jié)果，多肽類成分在該類產(chǎn)品中占有極大的比例。
[0004]本發(fā)明對(duì)蟾皮進(jìn)行提取后制備得到多肽類組合物，該組合物除有一定的抗癌活性夕卜，還具有良好的鎮(zhèn)痛效果，具有抗腫瘤及鎮(zhèn)痛類藥物開(kāi)發(fā)的良好前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛作用的蟾皮提取物。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種主要為多肽類成分的蟾皮提取物，其分子量范圍是 1000 ?10000 (Da)。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述蟾皮提取物的制備方法。
[0008]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述蟾皮提取物的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0010]一種蟾皮提取物，其特征在于它是以干蟾皮為原料經(jīng)過(guò)水提醇沉的方法制成中間提取物后，進(jìn)行凝膠色譜分離純化得到的。尤其是一種蟾皮提取物，其特征在于它是以干蟾皮為原料經(jīng)過(guò)水提醇沉的方法制成中間提取物后，進(jìn)行凝膠色譜分離純化得到多肽類組合物，其分子量分布范圍是1000?lOOOODa。
[0011]一種由所述蟾皮提取物與醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成的制劑，蟾皮提取物(按照干燥后所得固體物質(zhì)量)與所述的輔料的質(zhì)量比為1: 0-1: 110。
[0012]所述蟾皮提取物的制備方法為:
[0013](I)干蟾皮洗凈,用5?15倍的水提取2次,濃縮至小體積后分別用50?70%、75?90%的乙醇沉淀，濾過(guò)，回收乙醇得到中間提取物；
[0014](2)中間提取物運(yùn)用凝膠色譜進(jìn)行分離，得到多肽類組合物；
[0015](3)所述的多肽類組合物，經(jīng)過(guò)紫外及尺寸排阻色譜分析，與固定分子量對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，確定該多肽組合物分子量分布在1000-10000Da，純度在70%或以上。
[0016]或者
[0017](I)干蟾皮洗凈，用5?15倍的水提取2次，濃縮至相對(duì)密度為1.01?
1.35 (800C )后，分別用40?70%、75?90%的乙醇沉淀，濾過(guò)，將濾液回收乙醇得到中間提取物；
[0018](2)將所述的中間提取物運(yùn)用凝膠色譜進(jìn)行分離，得到多肽類組合物；
[0019](3)所述的多肽類組合物，經(jīng)過(guò)紫外及尺寸排阻色譜分析，與固定分子量對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，確定該多肽組合物分子量分布在1000-10000Da，純度在70%或以上。
[0020]其中本發(fā)明所述蟾皮提取物的制備方法優(yōu)選為:運(yùn)用凝膠色譜進(jìn)行分離時(shí)，所用填料包括 S印hadex G10、G15、G25、G50、G75、LH20 葡聚糖基質(zhì)凝膠；或 HW40、HW50、HW65 聚甲基丙烯酸基質(zhì)凝膠填料。
[0021]更優(yōu)選的是，中間提取物與凝膠色譜填料的重量比為:1: 10?1: 100，洗脫液體積為柱體積的0.1?I倍,流速為0.5?2cm柱體積/min。
[0022]本發(fā)明所得到的多肽類組合物具有抗腫瘤和鎮(zhèn)痛的活性:
[0023]1.體外抗癌試驗(yàn)結(jié)果顯示，蟾皮提取物多肽類組合物對(duì)胃癌細(xì)胞系BGC823，MCG803，結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD-1，HT-29及胰腺癌細(xì)胞系MIAPACA-2等5種細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，并呈現(xiàn)出良好劑量依存性；
[0024]2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，蟾皮多肽類組合物有良好的鎮(zhèn)痛作用。
[0025]本發(fā)明的意義在于:從蟾皮中制備得到較高純度的多肽類組合物成分，證明其分子量主要分布在1000?1000(Da);這類成分具有較好的的抗腫瘤活性以及良好的鎮(zhèn)痛效果?，F(xiàn)有的制備方法能夠適宜工業(yè)化生產(chǎn)，具有重要的意義。本發(fā)明的組合物屬于小分子蛋白，與抗菌肽相似，與其他抗腫瘤藥物相比毒副作用小，具有更高的臨床安全性，必將在腫瘤治療與鎮(zhèn)痛類藥物開(kāi)發(fā)上有所建樹(shù)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1不同分子量對(duì)照品尺寸排阻HPLC色譜圖
[0027]圖2蟾皮多肽類組合物尺寸排阻HPLC色譜圖(a_實(shí)施例1所得組合物；b_實(shí)施例2所得組合物)

【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例
[0029]1.華蟾素多肽類組合物的制備-1:
[0030](I)取干蟾皮水煮醇沉處理后得到中間提取物；
[0031]具體操作方法為:取干蟾皮進(jìn)行修治后，加入8倍水(V/m)，煎煮2次，每次30min，濾過(guò)，合并濾液，濃縮。濃縮至小體積(相對(duì)密度在1.01?1.35，80°C )，冷卻至40°C，加入95%乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為40?60%進(jìn)行一次醇沉，后傾出上清液；將上清液回收乙醇至無(wú)醇味，加入95 %乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為75?90 %進(jìn)行二次醇沉，靜置后常壓濾過(guò)，濾液濃縮至稠膏，冷藏24h，離心，即得中間體。
[0032](2)使用葡聚糖凝膠S印hadex G10、G15、G25、G50、G75或LH20對(duì)中間體進(jìn)行分離純化，裝柱徑高比1: 15，上樣體積比1: 40，恒流速3ml/min去離子水洗脫，按照柱體積1/10進(jìn)行收集，采用雙縮脲反應(yīng)進(jìn)行跟蹤，收集反應(yīng)陽(yáng)性餾分合并后冷凍干燥，得到多肽類組合物；
[0033](3)將上述組合物用高純水溶解，0.22 μ m濾過(guò)，運(yùn)用TSK排阻色譜分析柱進(jìn)行高效液相檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)212nm，與100Da和1000Da分子量的對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)(見(jiàn)圖1、2-a)，證明該組合物分子量分布在1000-10000Da ；
[0034](4)精密稱取200mg該多肽類組合物樣品，采用氨基酸自動(dòng)分析儀結(jié)合紫外分光光度計(jì)，按GB/T5009.124-2003測(cè)定水解氨基酸與游離氨基酸含量，計(jì)算二者差值，結(jié)果見(jiàn)表I。由氨基酸分析結(jié)果可見(jiàn):(水解氨基酸-游離氨基酸)/多肽類組合物*100% =186.87/200*100%= 93.435%。此多肽類組合物多肽含量在90%以上。
[0035]2.華蟾素多肽類組合物的制備-2:
[0036](I)取干蟾皮水煮醇沉處理后得到中間提取物；
[0037]具體操作方法為:取干蟾皮進(jìn)行修治后，加入15倍水(V/m)，煎煮2次，每次120min，濾過(guò)，合并濾液，濃縮。濃縮至小體積(相對(duì)密度在1.01?1.3，80°C )，冷卻至40°C，加入95%乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為40%進(jìn)行一次醇沉，后傾出上清液；將上清液回收乙醇至無(wú)醇味，加入95 %乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為90 %進(jìn)行二次醇沉，靜置后常壓濾過(guò)，濾液濃縮至稠膏，冷藏24h，離心，即得中間體。
[0038](2)使用聚甲基丙烯酸酯凝膠HW40、HW50或HW65對(duì)中間體進(jìn)行分離純化，裝柱徑高比1: 15?20，上樣體積比1: 10?40，恒流速3?10ml/min去離子水洗脫，按照柱體積1/10每份進(jìn)行收集，采用雙縮脲反應(yīng)進(jìn)行跟蹤，收集反應(yīng)陽(yáng)性餾分合并后冷凍干燥，得到多肽類組合物；
[0039](3)將上述組合物用高純水溶解，0.22 μ m濾過(guò)，運(yùn)用TSK排阻色譜分析柱進(jìn)行高效液相檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)212nm，與100Da和1000Da分子量的對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)(見(jiàn)圖1、2-b)，證明該組合物分子量分布在1000-10000Da ；
[0040](4)精密稱取200mg該多肽類組合物樣品，采用氨基酸自動(dòng)分析儀結(jié)合紫外分光光度計(jì)，按GB/T5009.124-2003測(cè)定水解氨基酸與游離氨基酸含量，計(jì)算二者差值，結(jié)果見(jiàn)表I。由氨基酸分析結(jié)果可見(jiàn):(水解氨基酸-游離氨基酸)/多肽類組合物*100% =186.87/200*100%= 93.435%。此多肽類組合物多肽含量在90%以上。
[0041]表I多肽類組合物氨基酸分析結(jié)果

【權(quán)利要求】
1.一種蟾皮提取物，其特征在于該蟾皮提取物由以下步驟制備得到:(1)取干蟾皮，洗凈，加5?15倍蒸餾水提取，第一次30分鐘，第二次30分鐘，合并水提液，濾過(guò)，濾液濃縮至含Ig生藥/ml,以3000r/min轉(zhuǎn)速離心20分鐘,取上清液,超濾，即得。
2.一種蟾皮提取物，是以干蟾皮為原料經(jīng)過(guò)水提醇沉的方法制成中間提取物后，進(jìn)行凝膠色譜分離純化得到的多肽類組合物，其分子量分布范圍是1000?lOOOODa。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的蟾皮提取，其中所述多肽組合物分子量分布在1000-10000Da，純度在 70% 以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述蟾皮提取物的制備方法，其特征在于:(I)干蟾皮洗凈，用5?15倍的水提取2次，濃縮至小體積后分別用50?70%、75?90%的乙醇沉淀，濾過(guò)，回收乙醇得到中間提取物； (2)中間提取物運(yùn)用凝膠色譜進(jìn)行分離，得到多肽類組合物。
5.如權(quán)利要求4所述凝膠色譜分離，所用填料選自S^hadexG10、G15、G25、G50、G75、LH20等葡聚糖基質(zhì)凝膠；或HW40、HW50、HW65等聚甲基丙烯酸基質(zhì)凝膠填料中的一種或多種。
6.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的蟾皮提取物，在制備抗腫瘤、鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K38/02GK104161772SQ201310180722
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2013年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月16日
【發(fā)明者】邊寶林, 司南, 楊健, 王宏潔, 趙海譽(yù) 申請(qǐng)人:中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所