專利名稱：降解河豚毒素的提取液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及藥用微生物開發(fā)和利用領(lǐng)域，更具體地涉及一種從細菌發(fā)酵液中制備可降解河豚毒素提取液的方法，以及由其提取得到的河豚毒素降解物質(zhì)提取液。
背景技術(shù)：
河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX),是一種氨基全輕基喹唑啉的生物堿,為一種毒性極強的神經(jīng)毒素，通過特異性阻斷細胞膜上的電壓門控鈉離子通道，造成全身麻痹、最終死于呼吸和回流衰竭。TTX中毒潛伏期很短，短至10-30min，長至3_6h發(fā)病，發(fā)病急，如果搶救不及時，中毒后最快的IOmin內(nèi)死亡，最遲4-6h死亡。臨床治療只能依賴于催吐、洗胃、導(dǎo)瀉等減少毒物的吸收的方法，以及使用腎上腺皮質(zhì)激素，提高組織對毒素的耐受性。目前尚無有效的解毒劑。目前已有通過制備河豚毒素抗體來阻斷河豚毒素與其受體鈉離子通道的研究報道，但還沒有發(fā)現(xiàn)存在直接降解河豚毒素的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，I株產(chǎn)TTX的細菌不但能合成河豚毒素，而且其發(fā)酵液中同時存在降解河豚毒素的物質(zhì)。本發(fā)明的主要內(nèi)容是:通過人工丟失產(chǎn)TTX細菌的質(zhì)粒，使其失去產(chǎn)TTX的能力但卻可以保留生產(chǎn)降解TTX的物質(zhì)，通過抽提失去質(zhì)粒的細菌發(fā)酵液，可獲取降解河豚毒素的物質(zhì)。本發(fā)明提供了人工造成質(zhì)粒丟失的方法、質(zhì)粒丟失的檢測方法、以及降解河豚毒素物質(zhì)的制備方法。降解河豚毒素物質(zhì)可用作河豚毒素中毒的解毒藥的開發(fā)和相關(guān)的科學(xué)研究。本發(fā)明的一個目的在于提供一種提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，包括如下步驟:(I)將質(zhì)粒丟失的產(chǎn)河豚毒素的細菌發(fā)酵培養(yǎng)至少48小時(優(yōu)選48-66小時，更優(yōu)選67-96小時)，離心收集細胞，優(yōu)選在4°C下4000 Xg離心30min后收集細胞；(2)用0.1%-1%乙酸(優(yōu)選用1%的乙酸)溶解細胞，超聲波破碎細胞；(3)95-105°C (優(yōu)選100°C )煮20_25min，冷卻后離心去除細胞碎片；(4)過濾上清；(5)對過濾液過活性碳柱，洗脫液的配方為:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ； (6)洗脫液在40-50°C (優(yōu)選45°C )減壓濃縮，冷凍干燥；(7)溶于無菌去離子水中；(8)過 Bio-Gel P2 柱子；(9)用0.02-0.05M (優(yōu)選0.03M)乙酸洗脫，收集洗脫液；(10)洗脫液再用 C18Sep_Pak cartridges 過柱；(11)用5-20 ml0.3%的乙酸洗脫，優(yōu)選用IOml0.3%的乙酸洗脫，收集洗脫液；
(12)將洗脫液過濾；(13)過濾液冷凍干燥后，溶解在無菌去離子水中，得到降解河豚毒素的物質(zhì)的提取液。在一實施方式中，本發(fā)明所述的方法進一步包括以下檢測步驟:將濾液作為待測樣本,調(diào)整pH值為6.5-7.4，用ELISA法檢測樣本中的河豚毒素。在一實施方式中，本發(fā)明的提供一種提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，包括如下步驟:(I)將質(zhì)粒丟失的產(chǎn)河豚毒素的細菌發(fā)酵培養(yǎng)至少48小時，4°C下4000Xg離心30min收集細胞；(2)用0.1%乙酸溶解細胞，超聲波破碎細胞；(3) 100°C煮20_25min，冷卻后離心去除細胞碎片；(4)過濾上清；(5)對過濾液過活性碳柱，洗脫液的配方為:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ；(6)洗脫液在45 °C減壓濃縮，冷凍干燥；

(7)溶于2ml無菌去離子水中；(8)過 Bio-Gel P2 柱子；(9)用0.03M乙酸洗脫，從洗脫液流出開始收集,收集2ml ；(10)洗脫液再用 C18Sep_Pak cartridges 過柱；(11)用IOml0.3%的乙酸洗脫，從第二個柱體積洗脫液流出開始收集，收集兩個柱體積的洗脫液；(12)將洗脫液過濾；(13)過濾液冷凍干燥后，溶解在Iml無菌去離子水中；(14)將濾液作為待測樣本，調(diào)整pH值為6.5-7.4，用ELISA法檢測樣本中的河豚毒素。在本發(fā)明的一實施方式中，所述氣單胞菌可以是軟體動物氣單胞菌(Aeromonas molluscorum),也可以是其它產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌，例如來自假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌(Shewanella)、交替單胞菌(Alteromonas)、芽抱桿菌(Bacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、產(chǎn)喊菌屬(Alcaligenes)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、微球菌屬(Micrococcus)、莫拉菌屬(Moraxella)、弧菌屬(Vibrio)、放線菌(Actinomycetes)、柄桿菌屬(Caulobacter)等類群的產(chǎn)TTX細菌。在本發(fā)明的一實施方式中，造成所述的產(chǎn)河豚毒素的細菌丟失質(zhì)粒的人工發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括如下步驟:( I)將所述的產(chǎn)河豚毒素細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養(yǎng)基中；(2)20-280C (優(yōu)選23°C )下，200-450轉(zhuǎn)/分鐘(優(yōu)選225轉(zhuǎn)/分鐘)，至少培養(yǎng)48小時。在本發(fā)明的一實施方式中，所述ORI液體培養(yǎng)基的組成為:0.05%精氨酸，0.2%胰蛋白胨，0.2 %大豆蛋白胨，0.1 %酵母抽提物，0.088 %檸檬酸鐵，3 % NaCl，余量為蒸餾水，PH7-8.5 (優(yōu)選 pH8.0)。
在本發(fā)明的一實施方式中，所述ORI液體培養(yǎng)基的制備方法(IOOOml):在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨(0X0ID公司)，2g大豆蛋白胨(0X0ID公司)，Ig酵母抽提物(OXOID公司)，30g氯化鈉(宜興市第二化學(xué)試劑廠)和0.5g L-精氨酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，攪拌溶解后，再加入0.88g檸檬酸鐵(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，繼續(xù)攪拌，直到完全溶解后，加入去離子水定容至1000ml，并調(diào)節(jié)PH至7-8.5 (優(yōu)選PH8.0)后封口滅菌。在本發(fā)明的一實施方式中，所述的檢測步驟中的ELISA法檢測包括如下步驟:(I)在固定有抗原的酶標(biāo)板上分別加入TTX標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣本和添加了 TTX標(biāo)準(zhǔn)品的待測樣本；(2)在酶標(biāo)板上加入TTX的特異性抗體溶液；(3) 20-400C (優(yōu)選室溫或37°C )孵育至反應(yīng)完全，加入洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次；(4)加入酶標(biāo)二抗，20-40°C (優(yōu)選室溫或37°C )孵育至反應(yīng)完全，加入洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次；(5)加入顯色液，37°C孵育10_15min后，每孔加入終止液以終止反應(yīng)；(6)結(jié)果檢測:將酶標(biāo)板插入酶標(biāo)儀中,檢測450nm處的吸光值。在本發(fā)明的一實施方式中，所述ELISA法的步驟(I)中，添加了 TTX標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品號:T8024_1MG)的待測樣本，其TTX標(biāo)準(zhǔn)品添加終濃度為25_200ng/mL。

在本發(fā)明的一實施方式中，所述ELISA法的步驟(2)中的特異性抗體為TTX的特異性單抗(北京中衛(wèi)食品衛(wèi)生科技公司，產(chǎn)品號:5561)。在本發(fā)明的一實施方式中，所述ELISA法的步驟(3)中，孵育至反應(yīng)完全所需時間為1.5h ;所述ELISA法的步驟(4)中孵育至反應(yīng)完全為lh。本發(fā)明的另一目的在于提供一種造成產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌丟失質(zhì)粒的人工發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括如下步驟:(I)將產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養(yǎng)基中；(2) 23°C下，225轉(zhuǎn)/分鐘，至少培養(yǎng)48小時。在本發(fā)明的一實施方式中，上述方法采用的所述ORI液體培養(yǎng)基的組成為:0.05%精氨酸，0.2%胰蛋白胨，0.2%大豆蛋白胨，0.1 %酵母抽提物，0.088%檸檬酸鐵，3% NaCl,余量為蒸餾水，PH7-8.5 (優(yōu)選ρΗ8.0)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種實時定量PCR檢測方法，其用于檢測上述任一方法采用的細菌或氣單胞菌的質(zhì)粒丟失，包括如下步驟:(I)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:將提取的Ne-1質(zhì)粒用無菌水進行10倍系列稀釋，分別稀釋成6個梯度，作為模板，進行熒光定量PCR來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，按以下公式計算質(zhì)?？截悢?shù):質(zhì)?？截悢?shù)(copies.μ L-1) =6.02 X IO23 (copies.moF1) X 質(zhì)粒濃度(g.μ L-1)/質(zhì)粒分子量(g.moF1)；(2)實時定量PCR體系:將待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別做3個重復(fù)置于同一次實驗中進行反應(yīng)，按下列組分配制PCR反應(yīng)液:iQ SYBR Green Supermixl2.5 μ 1，PCR正向引物(2ymol/L) I μ 1，PCR反向引物(2ymol/L) 1μ 1，質(zhì)粒模板2 μ 1，加入ddH20補足至25 μ 1，PCR正向引物序列5’ -GACAAGGCTCGGAGACACGCA-3’，PCR反向引物序列5’ -TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC-3’，所述待測樣品為所述丟失質(zhì)粒的氣單胞菌或所述丟失質(zhì)粒的細菌；(3)實時定量PCR反應(yīng)程序:95°C 5min預(yù)變性質(zhì)粒DNA模板，然后以95°C 30s、59°C 30s,72°C 30s進行30個溫度變化循環(huán)，80°C ls、82°C Is進行I個循環(huán)，最后59°C至95°C延伸20s，最后，利用隨機軟件進行熔解曲線分析和CT值分析，確定質(zhì)?？截悢?shù)；(4)利用含精氨酸的ORI培養(yǎng)基培養(yǎng)至少48小時后，質(zhì)粒完全丟失。本發(fā)明的另一目的在于提供一種根據(jù)上述方法所提取制備得到的河豚毒素降解物質(zhì)的提取液。本發(fā)明的另一目的在于提供上述的河豚毒素降解物質(zhì)的提取液在制備用于治療河豚毒素中毒的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明第一公開了通過改變培養(yǎng)基成分的方法，人工造成氣單胞菌Aeromonasmolluscorum質(zhì)粒丟失,使其失去原具備的合成TTX的能力,其特征在于,包括如下步驟:(I)將細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養(yǎng)基(0.05%精氨酸，0.2%胰蛋白胨，
0.2%大豆蛋白胨，0.1%酵母抽提物，0.088%檸檬酸鐵，3% NaCl，余量為蒸餾水，ρΗ8.0)中；23°C下，225轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)·48小時。(2)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:將提取的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒用無菌水進行10倍系列稀釋，分別稀釋成6個梯度，作為模板(稀釋的時候用移液槍吹打20次，振蕩5s后離心，使溶液充分混勻)，進行熒光定量PCR來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。按以下公式計算質(zhì)?？截悢?shù):質(zhì)粒拷貝數(shù)(copies.μ L-1) =6.02 X IO23 (copies.moF1) X 質(zhì)粒濃度(g.μ L-1) / 質(zhì)粒分子量(g.moF1)。(3)實時定量PCR體系:將待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別做3個重復(fù)置于同一次實驗中進行反應(yīng)，按下列組分配制PCR反應(yīng)液:iQ SYBR Green Supermixl2.5 μ 1，PCR正向引物(2ymol/L) I μ 1，PCR反向引物(2ymol/L) 1μ 1，質(zhì)粒模板2 μ 1，加入ddH20補足至25 μ I。PCR正向引物序列5’ -GACAAGGCTCGGAGACACGCA-3’ ；PCR反向引物序列5’ -TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC-3’。(4)實時定量PCR反應(yīng)程序:95°C 5min 預(yù)變性，然后以 95°C 30s、59°C 30s,72°C 30s進行30個循環(huán)，80°C ls、82°C Isl個循環(huán)，最后59°C至95°C延伸20s。最后，利用隨機軟件進行熔解曲線分析和CT值分析，確定質(zhì)?？截悢?shù)。(5)利用含精氨酸的ORI培養(yǎng)基培養(yǎng)至少48小時，氣單胞菌Aeromonasmolluscorum48小時后質(zhì)粒完全丟失。本發(fā)明第二公開了所述產(chǎn)河豚毒素細菌發(fā)酵過程中降解河豚毒素的物質(zhì)的提取方法，其特征在于，包括如下步驟:(I)發(fā)酵培養(yǎng)66小時后，4°C下4000Xg離心30min收集細胞；(2)用0.1%乙酸溶解細胞，超聲波破碎細胞；(3) 100°C煮20_25min，冷卻后離心去除細胞碎片；(4)上清用直徑0.25 μ m濾紙過濾；(5)過濾液過活性碳柱，用洗脫液洗脫活性碳，洗脫液的配方為:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ；(6)洗脫液45°C減壓至0.001-0.003M Pa濃縮，冷凍干燥；
(7)溶于2ml無菌去離子水中；(8)過 I X 80cm 的 Bio-Gel P2 柱子；(9)用0.03M乙酸洗脫，從洗脫液流出開始收集，收集2ml ；(10)洗脫液再用 C18Sep_Pak cartridges 過柱；(11)用IOml0.3%的乙酸洗脫，從第二個柱體積洗脫液流出開始收集，收集兩個柱體積的洗脫液；(12)將洗脫液過濾；(13)過濾液冷凍干燥后，溶解在Iml無菌去離子水中。本發(fā)明第三公開了所述的提取樣本中河豚毒素的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟:(I)在固定有抗原的酶標(biāo)板上分別加入TTX標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣本和添加了 TTX標(biāo)準(zhǔn)品的待測樣本；(2)在酶標(biāo)板上加入TTX的特異性抗體溶液；(3)室溫或37°C孵育至反應(yīng)完全，加入洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次；(4)加入酶標(biāo)二抗，室溫或37°C孵育至反應(yīng)完全，加入洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次；
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(5)加入顯色液，37°C孵育10_15min后，每孔加入終止液以終止反應(yīng)；(6)結(jié)果檢測:將酶標(biāo)板插入酶標(biāo)儀中,檢測450nm處的吸光值。所述步驟(I)中，添加了 TTX標(biāo)準(zhǔn)品的待測樣本，其TTX標(biāo)準(zhǔn)品添加終濃度為25_200ng/mL。所述步驟(2)中的特異性抗體為TTX的特異性單抗。所述步驟(3)中，孵育至反應(yīng)完全所需時間為1.5h ;所述步驟(4)中孵育至反應(yīng)完全為lh。本發(fā)明所述的“0RI液體培養(yǎng)基”的制備方法(1000ml):在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨(OXOID公司)，2g大豆蛋白胨(英國OXOID公司)，Ig酵母提取物(英國OXOID公司)，30g氯化鈉(宜興市第二化學(xué)試劑廠)和0.5g L-精氨酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，攪拌溶解后，再加入0.88g檸檬酸鐵(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，繼續(xù)攪拌，直到完全溶解后，加入去離子水定容至1000ml，并調(diào)節(jié)PH至8.0后封口滅菌。本申請采用在已于2011年3月30日公開的中國專利申請?zhí)?01010179363.8中記載的產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌(Aeromonas molluscorum),該菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。保藏日期:2010年04月23日，保藏編號:CGMCC N0.3760。造成產(chǎn)河豚毒素細菌的質(zhì)粒丟失的培養(yǎng)方法是可以重復(fù)再現(xiàn)的。將產(chǎn)河豚毒素的細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養(yǎng)基中(0RI液體培養(yǎng)基的組成為:0.05%精氨酸，
0.2%胰蛋白胨，0.2%大豆蛋白胨，0.1%酵母抽提物，0.088%檸檬酸鐵，3% NaCl，余量為蒸餾水，pH8.0),在23°C下，225轉(zhuǎn)/分鐘，至少培養(yǎng)48小時后，可造成產(chǎn)河豚毒素細菌的質(zhì)粒丟失。本發(fā)明所采用的試劑、樣品均為可通過商業(yè)途徑獲得的市售產(chǎn)品，大部分購自英國OXOID公司和國藥集團化學(xué)試劑有限公司。本發(fā)明的有益效果:
I)本發(fā)明是通過從細菌發(fā)酵液中制備對河豚毒素具有降解效果的提取液，該提取液可作為今后臨床治療河豚毒素中毒的藥物。2 )本發(fā)明的河豚降解物質(zhì)的提取方法可用作降解河豚毒素物質(zhì)的規(guī)?；a(chǎn)，可為科學(xué)研究、醫(yī)藥行業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域提供原料。
以下結(jié)合附圖和具體實施方式
來進一步說明本發(fā)明。

圖1為氣單胞菌Aeromonas molluscorum細菌質(zhì)粒丟失時間序列。圖2為ELISA檢測TTX的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示，進一步闡述本發(fā)明。
實施例11、利用改進培養(yǎng)基造成氣單胞菌Aeromonas molluscorum質(zhì)粒丟失的方法,可按照以下步驟操作:(I)將細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養(yǎng)基中，ORI液體培養(yǎng)基制備方法(1000ml)為:在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨(0X0ID公司)，2g大豆蛋白胨(0X0ID公司)，Ig酵母提取物(0X0ID公司)，30g氯化鈉(宜興市第二化學(xué)試劑廠)和0.5g L-精氨酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，攪拌溶解后，再加入0.88g檸檬酸鐵(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，繼續(xù)攪拌，直到完全溶解后，加入去離子水定容至1000ml，并調(diào)節(jié)PH至8.0后封口滅菌。(2) 23°C下，225轉(zhuǎn)/分鐘，至少培養(yǎng)48小時。2、利用實時定量PCR檢測細菌Aeromonas molluscorum質(zhì)粒丟失的方法,可按照以下步驟操作:(I)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:將提取的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒用無菌水進行10倍系列稀釋，分別稀釋成6個梯度，作為模板(稀釋的時候用移液槍吹打20次，振蕩5s后離心，使溶液充分混勻)，進行熒光定量PCR來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。按以下公式計算質(zhì)?？截悢?shù):質(zhì)?？截悢?shù)(copies.μ L-1) =6.02 X 1023 (copies.moΓ1) X 質(zhì)粒濃度(g.μ L-1)/質(zhì)粒分子量(g * moF1)。(2)將細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)至18、24、48、72、96小時后，收集細菌，以堿法同時抽提各期細菌的質(zhì)粒。(3)實時定量PCR體系:將待測質(zhì)粒樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別做3個重復(fù)置于同一次實驗中進行反應(yīng)，按下列組分配制PCR反應(yīng)液:iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad公司)12.5μ 1，PCR 正向引物(2μπιο1/υ μ 1，PCR 反向引物(2μπιο1/υ μ 1，質(zhì)粒模板 2μ 1，加入 ddH20 補足至 25 μ I。PCR 正向引物序列 5’ -GACAAGGCTCGGAGACACGCA-3’ ；PCR 反向引物序列 5’ -TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC-3’。(4)實時定量PCR反應(yīng)程序:95°C 5min 預(yù)變性，然后以 95°C 30s,59°C 30s,72°C 30s進行30個循環(huán)，80°C ls、82°C Isl個循環(huán)，最后59°C至95°C延伸20s。最后，利用隨機軟件進行熔解曲線分析和CT值分析，確定質(zhì)?？截悢?shù)。3、降解河豚毒素的物質(zhì)的提取方法，包括如下步驟:(1)將丟失質(zhì)粒的氣單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)48小時后，4°C下4000 Xg離心30min收集細胞；(2)用0.1%乙酸溶解細胞，超聲波破碎細胞；(3)100°C煮20_25min，冷卻后離心去除細胞碎片；(4)上清用直徑0.25 μ m濾紙過濾；(5)過濾液過活性碳柱，用洗脫液洗脫活性碳，洗脫液的配方為:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ；(6)洗脫液45°C減壓至0.001-0.003M Pa濃縮，冷凍干燥；(7)溶于2ml無菌去離子水中；(8)過 I X 80cm 的 Bio-Gel P2 柱子(Bio-Rad Lab, Richmond, VA, USA)；(9)用0.03M乙酸洗脫，從洗脫液流出開始收集,收集2ml ；(10)洗脫液再用 C18Sep_Pak cartridges 過柱(Waters, Milford, MA)；(11)用IOml0.3%的乙酸洗脫，從第二個柱體積洗脫液流出開始收集，收集兩個柱體積的洗脫液；(12)將洗脫液過濾；(13)過濾液冷凍干燥后，溶解在Iml無菌去離子水中。(14)將濾液作為待測樣本，調(diào)整pH值為6.5-7.4，用ELISA法檢測樣本中的河豚毒素。4、發(fā)酵提取樣本中河豚毒素的檢測，包括如下步驟:(1)采用市售的河豚毒素ELISA檢測試劑盒(北京中衛(wèi)食品衛(wèi)生科技公司，產(chǎn)品號:5561)，在固定有抗原的酶標(biāo)板上分別加入50μ L TTX標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品號:T8024-lMG)(0、10、20、50、200ng/ml)，待測樣本和添加了 TTX標(biāo)準(zhǔn)品(終濃度為50ng/mL, 100ng/mL)的待測樣本以及對照樣本(培養(yǎng)基)；(2)在酶標(biāo)板上加入TTX的特異性抗體溶液(50 μ L/孔)；(3) 37°C孵育1.5h，加入洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次；(4)每孔加入100 μ L酶標(biāo)二抗，37°C孵育lh，加入洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次；(5)每孔加入100 μ L顯色液，37°C孵育12min,每孔加入終止液50 μ L ;(6)結(jié)果檢測:將酶標(biāo)板插入酶標(biāo)儀中，檢測450nm處的吸光值。(7)以Ai/Ao的比值為縱坐標(biāo)，TTX標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣本中河豚毒素的濃度。其中Ai為樣本的吸光值，Ao為標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0ng/mL時的吸光值。結(jié)果如圖2所示，吸光度比值(Ai/Ao)與河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值成正比關(guān)系，其擬合直線的方程式為y=_0.393X+1.2543，其中“y”為Ai/Ao值，“X”為河豚毒素濃度。根據(jù)此公式，可以依據(jù)檢測樣本所得吸光值計算出樣本中的河豚毒素濃度。實施例2本實施例的操作方法以及步驟同實施例1，不同之處在于將丟失質(zhì)粒的氣單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)時間為66小時。實施例3
本實施例的操作方法以及步驟同實施例1，不同之處在于將丟失質(zhì)粒的氣單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)時間為96小時。實施例4本實施例的操作方法以及步驟如同實施例1，不同之處在于將添加精氨酸的ORI液體培養(yǎng)基改為添加河豚肝臟粗提液。ORI液體培養(yǎng)基制備方法(IOOOml)為:在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨(0X0ID公司)，2g大豆蛋白胨(0X0ID公司)，lg酵母提取物(0X0ID公司)，30g氯化鈉(宜興市第二化學(xué)試劑廠)，攪拌溶解后，再加入0.88g檸檬酸鐵(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，繼續(xù)攪拌，直到完全溶解后，加入IOml河豚肝臟粗提液，再加入去離子水定容至1000ml，并調(diào)節(jié)PH至8.0后封口滅菌。實施例5本實施例的操作方法以及步驟如同實施例4，不同之處在于將丟失質(zhì)粒的氣單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)時間為66小時。實施例6本實施例的操作方法以及步驟如同實施例4，不同之處在于將丟失質(zhì)粒的氣單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)時間為96小時。實施例7本實施例的操作方法以及步驟如同實施例1，不同之處在于將添加精氨酸的ORI液體培養(yǎng)基改為添加河豚卵巢粗提液。ORI液體培養(yǎng)基制備方法(IOOOml)為:在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨(0X0ID公司)，2g大豆蛋白胨(0X0ID公司)，lg酵母提取物(0X0ID公司)，30g氯化鈉(宜興市第二化學(xué)試劑廠)，攪拌溶解后，再加入0.88g檸檬酸鐵(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，繼續(xù)攪拌，直到`完全溶解后，加入IOml河豚卵巢粗提液，再加入去離子水定容至1000ml，并調(diào)節(jié)PH至8.0后封口滅菌。實施例8本實施例的操作方法以及步驟如同實施例7，不同之處在于將丟失質(zhì)粒的氣單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)時間為66小時。實施例9本實施例的操作方法以及步驟如同實施例7，不同之處在于將丟失質(zhì)粒的氣單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)時間為96小時。通過對比對照和各檢測樣本中的TTX的量的變化，可以得出提取液對TTX的降解效果。表I為對不同發(fā)酵時間提取液的TTX降解效果比較。表I不同發(fā)酵時間提取液的TTX降解效果比較
權(quán)利要求
1.一種提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將質(zhì)粒丟失的產(chǎn)河豚毒素的細菌發(fā)酵培養(yǎng)至少48小時，離心收集細胞； (2)用0.1%-1%乙酸溶解細胞，超聲波破碎細胞； (3)95-105°C煮20-25min，冷卻后離心去除細胞碎片； (4)過濾上清； (5)對過濾液過活性碳柱，洗脫液的配方為:甲醇:1%的乙酸溶液=20:80 ； (6)洗脫液在40-50°C減壓濃縮，冷凍干燥； (7)溶于無菌去離子水中； (8)過Bio-Gel P2 柱子； (9)用0.02-0.05M乙酸洗脫，收集洗脫液； (10)洗脫液再用C18Sep-Pak cartridges 過柱； (11)用5-20ml0.3%的乙酸洗脫，收集洗脫液； (12)將洗脫液過濾； (13)過濾液冷凍干燥后，溶解在無菌去離子水中，得到降解河豚毒素的物質(zhì)的提取液。
2.如權(quán)利要求1所述的提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的質(zhì)粒丟失的產(chǎn)河豚毒素細菌是軟體動物氣單胞菌，或是其它產(chǎn)河豚毒素的細菌。
3.如權(quán)利要求1或2所述的提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，其特征在于，所述方法進一步包括以下檢測步驟: 將濾液作為待測樣本，調(diào)整PH值為6.5-7.4，用ELISA法檢測樣本中的河豚毒素。
4.如權(quán)利要求1或2所述的提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，其特征在于，造成所述的產(chǎn)河豚毒素細菌丟失質(zhì)粒的人工發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括如下步驟: (1)將所述的產(chǎn)河豚毒素細菌接種在添加精氨酸的ORI液體培養(yǎng)基中； (2)20-28°C下，200-450轉(zhuǎn)/分鐘，至少培養(yǎng)48小時。
5.如權(quán)利要求4所述的提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，其特征在于，所述ORI液體培養(yǎng)基的組成為:0.05%精氨酸，0.2 %胰蛋白胨，0.2 %大豆蛋白胨，0.1 %酵母抽提物，0.088%檸檬酸鐵，3% NaCl，余量為蒸餾水，pH7-8.5。
6.如權(quán)利要4所述的提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，其特征在于，所述ORI液體培養(yǎng)基制備方法:在800ml去離子水中加入2g胰蛋白胨,2g大豆蛋白胨,Ig酵母抽提物，30g氯化鈉和0.5g L-精氨酸，攪拌溶解后，再加入0.88g檸檬酸鐵，繼續(xù)攪拌，直到完全溶解后，加入去離子水定容至1000ml，并調(diào)節(jié)PH至7-8.5后封口滅菌。
7.如權(quán)利要求3所述的提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的檢測步驟中的ELISA法檢測包括如下步驟: (1)在固定有抗原的酶標(biāo)板上分別加入河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣本和添加了河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品的待測樣本； (2)在酶標(biāo)板上加入河豚毒素的特異性抗體溶液； (3)20-40°C孵育至反應(yīng)完全，加入洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次； (4)加入酶標(biāo)二抗，20-40°C孵育至反應(yīng)完全，加入洗滌液洗滌酶標(biāo)板3次； (5)加入顯色液，37°C孵育10-15min后，每孔加入終止液以終止反應(yīng)； (6)結(jié)果檢測:將酶標(biāo)板插入酶標(biāo)儀中,檢測450nm處的吸光值。
8.如權(quán)利要求7所述的提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，其特征在于，所述ELISA法的步驟(I)中，添加了河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品的待測樣本，其河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品添加終濃度為25_200ng/mL。
9.如權(quán)利要求7所述的提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，其特征在于，所述ELISA法的步驟(2)中的特異性抗體為河豚毒素的特異性單抗。
10.如權(quán)利要求7所述的提取降解河豚毒素的物質(zhì)的方法，其特征在于，所述ELISA法的步驟(3)中，孵育至反應(yīng)完全所需時間為1.5h ;所述ELISA法的步驟(4)中孵育至反應(yīng)完全為lh。
11.一種使產(chǎn)河豚毒素的細菌丟失質(zhì)粒的人工發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將所述產(chǎn)河豚毒素的細菌接種在 添加精氨酸的ORI液體培養(yǎng)基中； (2)23°C下，225轉(zhuǎn)/分鐘，至少培養(yǎng)48小時。
12.如權(quán)利要求11所述造成產(chǎn)河豚毒素的細菌丟失質(zhì)粒的人工發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，所述產(chǎn)河豚毒素的細菌為產(chǎn)河豚毒素的氣單胞菌。
13.如權(quán)利要求11或12所述造成產(chǎn)河豚毒素的細菌丟失質(zhì)粒的人工發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，所述ORI液體培養(yǎng)基的組成為:0.05%精氨酸，0.2%胰蛋白胨，0.2%大豆蛋白胨，0.1 %酵母抽提物，0.088%檸檬酸鐵，3% NaCl，余量為蒸餾水，pH7-8.5。
14.一種實時定量PCR檢測方法，其用于檢測如權(quán)利要求1-13任一項所述方法采用的細菌的質(zhì)粒丟失，其特征在于，包括如下步驟: (1)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:將提取的Ne-1質(zhì)粒用無菌水進行10倍系列稀釋，分別稀釋成6個梯度，作為模板，進行熒光定量PCR來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，按以下公式計算質(zhì)?？截悢?shù):質(zhì)?？截悢?shù)(copies.μ 廠1) =6.02 X IO23 (copies.moΓ1) X 質(zhì)粒濃度(g.μ L-1)/質(zhì)粒分子量(g.moF1)； (2)實時定量PCR體系:將待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別做3個重復(fù)置于同一次實驗中進行反應(yīng)，按下列組分配制PCR反應(yīng)液:iQ SYBR Green Supermixl2.5 μ 1，PCR正向引物1μ I, PCR反向引物I μ 1，質(zhì)粒模板2 μ 1，加入ddH20補足至25 μ 1，PCR正向引物序列5’ -GACAAGGCTCGGAGACACGCA-3’，PCR 反向引物序列 5’ -TCTCTTTCATGCTGCGGTTCAGC-3 ’，所述待測樣品為所述丟失質(zhì)粒的細菌； (3)實時定量PCR反應(yīng)程序:95°C5min預(yù)變性質(zhì)粒DNA模板，然后以95°C 30s、59°C 30s,72°C 30s進行30個溫度變化循環(huán)，80°C ls、82°C Is進行I個循環(huán)，最后59°C至95°C延伸20s，最后，利用隨機軟件進行熔解曲線分析和CT值分析，確定質(zhì)?？截悢?shù)； (4)利用含精氨酸的ORI培養(yǎng)基培養(yǎng)至少48小時，質(zhì)粒完全丟失。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法所提取制備得到的河豚毒素降解物質(zhì)的提取液。
16.如權(quán)利要求15所述的河豚毒素降解物質(zhì)的提取液在制備用于治療河豚毒素中毒的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從產(chǎn)河豚毒素的細菌發(fā)酵液中制備降解河豚毒素的物質(zhì)的方法和提取液的制備檢測方法，包括人工造成質(zhì)粒丟失的方法、河豚毒素降解物質(zhì)的提取方法、降解河豚毒素的檢驗方法。在本發(fā)明中，首次發(fā)現(xiàn)氣單胞菌Aeromonas molluscorum中存在降解河豚毒素的物質(zhì)，并建立了提取該物質(zhì)的抽提方法，該方法有望用于降解河豚毒素物質(zhì)的規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明涉及的細菌發(fā)酵液的抽提物具有降解河豚毒素的作用，可應(yīng)用于制備用于治療河豚毒素中毒的藥物，可為科學(xué)研究、醫(yī)藥行業(yè)等相關(guān)領(lǐng)域提供原料。
文檔編號A61K35/74GK103233043SQ201310135898
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
發(fā)明者鮑寶龍, 盧瑛, 馬廷龍, 趙靜, 劉靜, 張莉君 申請人:上海海洋大學(xué)