專利名稱：團(tuán)頭魴β防御素基因及其編碼的蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新天然抗菌肽，具體是指一種團(tuán)頭魴β防御素基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)菌對傳統(tǒng)抗生素的耐藥性已成為全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題。WHO將抗生素耐受描述為“影響所有國家的全球公共健康緊急事件”，而且這一問題導(dǎo)致全球健康問題的比例在逐漸增加，因此，發(fā)展克服耐藥性問題的新型抗生素顯得越來越重要。近年來出現(xiàn)的抗菌肽就是一類發(fā)展?jié)摿薮蟮男滦涂咕愃幬?，它不僅對細(xì)菌和真菌有廣譜殺滅作用，而且還具有很好的抗病毒和抗腫瘤作用，另外，與傳統(tǒng)抗生素相比，其作用機(jī)制獨特，不易引起微生物的耐藥性，絕大多數(shù)不損害或破壞高等動物的正常細(xì)胞，因此它極有可能成為在臨床上替代抗生素來治療細(xì)菌感染的新型藥物。相比陸生動物和高等哺乳動物，魚類的抗菌肽種類更豐富，也更具有獨特性，是抗菌肽生物資源中還沒有得到有效開發(fā)的巨大寶庫。已有報道證實，魚類某些抗菌肽比高等脊椎動物具有更強(qiáng)的殺菌活性，因此，對魚類抗菌肽的開發(fā)利用研究具有重要的科學(xué)意義和實際應(yīng)用價值。防御素是一組小的陽離子抗菌肽，根據(jù)半胱氨酸殘基位置及二硫鍵連接方式的不同，可ct，β，Θ三種防御素，其中β防御素(β-defensin)因廣泛表達(dá)于機(jī)體各組織和粘膜上皮，是宿主抵抗外界病原微生物入侵的第一道防線，被認(rèn)為是最重要的防御素。但是天然防御素來源有限，化學(xué)合成也存在成本高、批量生產(chǎn)困難；防御素抗菌活性與肽分子的空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，體外合成的防御素與天然防御素雖然一級結(jié)構(gòu)一致，但空間結(jié)構(gòu)卻不盡相同，因而造成活性較差。因此，采用基因工程方法制備防御素將具有很大優(yōu)勢。巴斯德畢赤酵母(Pichia pasoris)由于兼有原核細(xì)胞良好的可操作性和真核系統(tǒng)的翻譯后加工、修飾的特點，且發(fā)酵條件簡單，表達(dá)水平高，適合高密度培養(yǎng)，為工業(yè)化和純化提供極大的方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是從團(tuán)頭魴中獲得β防御素基因。本發(fā)明的第二個目的是將所述團(tuán)頭魴β防御素基因在酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)獲得重組表達(dá)蛋白。本發(fā)明的第三個目的是提供重組蛋白的應(yīng)用。(I)本發(fā)明所述團(tuán)頭魴β防御素基因的獲得:利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法，以團(tuán)頭魴肝臟總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR得到團(tuán)頭魴β防御素基因，其cDNA序列的開放閱讀框(ORF)如序列表SEQ ID N0:1所示。

(2)編碼了所述團(tuán)頭魴β防御素基因的重組蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO:2所示。(3)所述團(tuán)頭魴β防御素重組蛋白(或多肽)，其制備方法為:將序列表SEQ IDNO:1所述的團(tuán)頭魴β防御素基因開放閱讀框(ORF))與酵母表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZa-BDl,電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母工程菌GSl 15中，抗生素Zeocin篩選高抗性的轉(zhuǎn)化子，并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。收集上述甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的上清液，對其進(jìn)行分離純化的蛋白或多肽即為團(tuán)頭魴β -防御素I重組蛋白(或多肽)。(4)本發(fā)明獲得的團(tuán)頭魴β防御素重組蛋白具有生物活性，具有抗菌作用。采用牛津杯法對重組酵母菌表達(dá)上清液進(jìn)行抑菌活性測定實驗證明:團(tuán)頭魴β防御素重組蛋白對部分革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和部分革蘭氏陰性菌如大腸桿菌和嗜水氣單胞菌等均具有良好的抑菌活性，而且團(tuán)頭魴β防御素重組蛋白對氨芐耐藥型的嗜水氣單胞菌和大腸桿菌抑菌作用明顯。因此，本發(fā)明的團(tuán)頭魴β防御素可應(yīng)用于制備抗病菌類產(chǎn)品，抗病菌類產(chǎn)品包括醫(yī)藥產(chǎn)品如抗菌藥物、飼料添加劑、獸藥、防腐劑等。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明涉及的團(tuán)頭魴β防御素重組蛋白對金黃色葡萄球菌、鏈球菌及氨芐耐藥型大腸桿菌和嗜水氣單胞菌等均具有良好的抑菌活性，為抗感染藥物及耐藥型細(xì)菌提供了一類療效好的新藥品。本發(fā)明所提供的團(tuán)頭魴β防御素重組蛋白的制備方法不僅易于獲得純度高的產(chǎn)品，而且相對于現(xiàn)有的化學(xué)合成方法活性較好、降低成本，縮短制備時間，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為團(tuán)頭鮮肝臟總RNA電泳結(jié)果。圖2本發(fā)明所述團(tuán)頭·魴β防御素基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。1:目的基因；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(購自大連寶生物)。圖3為本發(fā)明所述利用表達(dá)引物擴(kuò)增團(tuán)頭魴β防御素基因的產(chǎn)物。1:目的基因；M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(購自大連寶生物)。圖4為是本發(fā)明中團(tuán)頭魴β防御素重組蛋白對金黃色葡萄球菌抑菌活性測定。I:氨芐青霉素10 μ g ;2:pPICZ a A酵母轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物；3:pPICZ a A- β -防御素轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物I ;4:pPICZ a A- β -防御素轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物II。圖5為是本發(fā)明中重組β防御素對嗜水氣單胞菌抑菌活性測定。1:氨芐青霉素10μ g ;2:pPICZaA酵母轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物；3:pPICZa A-BDl轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物I ;4:pPICZ a A-BDl轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物II。圖6為本發(fā)明中重組蛋白對無乳鏈球菌抑菌活性測定。1:氨芐青霉素10μ g ;2:pPICZ a A酵母轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物；3:pPICZ a A-BDl轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物I ;4:pPICZ a A-BDl轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物II。圖7為本發(fā)明中重組蛋白大腸桿囷抑囷活性測定。1:氣節(jié)青霉素10yg;2:pPICZ a A酵母轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物；3:pPICZ a A-BDl轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物I ;4:pPICZ a A-BDl轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)產(chǎn)物II。圖8為本發(fā)明的核苷酸序列。圖9為本發(fā)明的氨基酸序列。圖10為NCBI已公布的來源于不同物種的β防御素的氨基酸序列比對圖。黑色方框為保守序列。
圖11為本發(fā)明中插入表達(dá)載體的核苷酸序列。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實施例1:團(tuán)頭魴總RNA的提取及cDNA的合成I)團(tuán)頭魴總RNA的提取:實驗用的玻璃器皿經(jīng)0.1%的DEPC水處理，150°C烘烤4h。塑料器皿經(jīng)0.1% DEPC水浸泡過夜，121 °C 20min高溫高壓滅菌。金屬用具經(jīng)lmol/L的NaOH浸泡2h，經(jīng)0.01%的DEPC水徹底沖洗后，37 °C烘干。各試劑用無核糖核酸酶(Ribonuc I ease，RNase)的0.01% DEPC水配置。用麻醉劑MS222將團(tuán)頭魴麻醉，解剖，取出肝臟，剪取0.1g肝臟提取RNA?？俁NA抽提按Trizol試劑的說明書進(jìn)行。提取的RNA進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像儀觀察鑒定，可見清晰的三條帶(圖1)。總RNA樣品凍存于-80°C，備用。2) cDNA (反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)第一條鏈的合成:以提取的團(tuán)頭魴肝臟總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為40 μ L,即:無RNase 水 8 μ L，總RNAl5 μ L,Oligo dT (18) -Adaptor 引物 2uL,70°C下10分鐘，立即冰浴冷卻，之后分別加入:5 X RT 緩沖液 8 μ L，dNTP 混合液 4 μ L，RNase 抑制劑 1.5 μ L，反轉(zhuǎn)錄酶1.5 μ L，總計40 μ L,混勻，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:42°C下20分鐘，70°C下15分鐘，最后4°C結(jié)束反應(yīng)，4°C保存，備用。實施例2:團(tuán)頭魴β防御素基因的克隆及序列分析I)引物設(shè)計根據(jù)NCBI/GenBank上已登錄魚類β防御素序列信息，根據(jù)序列的保守性，用Primer 5.0軟件在cDNA序列開放閱讀框(ORF)的上下游區(qū)域，設(shè)計一對引物(Fl，Rl); Fl:5’ - GCCATCATCCGAAGAAAC -3’ ；R1:5’ - TTCCAAATCAAAGGCATG -3’。2) PCR擴(kuò)增:以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μ L，即:Premix Taq 2.025 μ L ;上游引物 Fl (100mM)0.5 μ L ;下游引物 Rl (100mM)0.5 μ L ;反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)2y L ;滅菌無離子水22 μ L，總體積為50 μ L，混勻。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C下預(yù)變性3min ;然后進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為94°C下變性30s，48°C下退火30s，72°C下延 伸Imin ;循環(huán)結(jié)束后在72°C下再延伸lOmin。3)PCR產(chǎn)物鑒定:擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物5 μ L用6X核酸上樣緩沖液點樣，1.0%瓊脂糖凝膠，I XTAE緩沖液，120V，電泳20分鐘觀察結(jié)果，得到約334bp左右的PCR產(chǎn)物(見圖2)。4)目的基因的克隆、篩選與測序
取pMD19_T載體I μ L (50ng/uL)與膠回收的目的片段3 μ L混合后，加入6 μ L溶液I，混勻后置16°C連接過夜。取10 μ L連接產(chǎn)物，無菌條件下加入大腸桿菌Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞中，用移液器溫和反復(fù)吹打混勻，冰浴放置30min。42°C水浴，熱激90s，之后立即冰浴3min使之冷卻，注意不要晃動。轉(zhuǎn)移菌液至裝有500 μ L預(yù)熱至37°C的LB培養(yǎng)液中，150rpm37°C溫和振蕩45min，使細(xì)菌恢復(fù)抗藥性。向含氨芐青霉素(AMP) (lOOPg/mL)的LB瓊脂平板上加入 40 μ L X-gal (20mg/mL)、4yL IPTG (200mg/mL)，均勻涂布，37°C放置半小時后，取150 μ L菌液涂布于平板上。倒置平皿于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 16h，置于4°C使藍(lán)色充分顯現(xiàn)，挑白色菌落接種于含150 μ g/mL AMP的LB培養(yǎng)液中，劇烈振搖(230rpm) 12^16h后鑒定。將PCR擴(kuò)增為陽性的克隆，取菌液送華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)公司，進(jìn)行測序分析，得到334bp (見圖8)的cDNA序列，該基因有完整的開放閱讀框(0RF)，其開放閱讀框的序列如序列表SEQ ID NO: I所不的序列。序列號:SEQID NO:1序列長度:204bp序列類型:cDNA來源:團(tuán)頭魴序列特征:有正確的開放閱讀框(ORF):204bp ;決定位置:起始、終止密碼子存在位置:ATG, I 位；TGA, 204 位5)上述步驟4所得序列ORF全長204bp，編碼蛋白質(zhì)具有如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。該蛋白質(zhì) 含有67個氨基酸，分子量為7.17KD，含有4個強(qiáng)堿性氨基酸殘基(K，R)，3個強(qiáng)酸性氨基酸殘基(D，E)，29個疏水性氨基酸殘基(A，I, L, F，W，V), 18個極性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)。利用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，National Center forBiotechnology Information, http:// www.ncb1.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的 BLAST (BasicLocal Alignment Search Tool)軟件對所測氨基酸序列進(jìn)行分析。用DNAstar軟件包里的Megalign軟件,通過ClustalW方法比較的不同物種之間核苷酸序列相似度(見圖10)。結(jié)果表明獲得了團(tuán)頭魴β防御素基因的全長ORF編碼區(qū)序列。實施例3:重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)I)設(shè)計團(tuán)頭魴β防御素的表達(dá)引物:根據(jù)團(tuán)頭魴β防御素ORF序列設(shè)計表達(dá)引物(F2，R2)，上游引物F2去除5’信號肽序列，并加入EcoR I酶切位點，下游引物加入終止密碼子(TGA，注:互補(bǔ)密碼子TCA)和Xba I酶切位點，具體如下:F2:5’ CG GAATTC ATACTTGTCTTGCTTGTCC 3’EcoR IR2: 5’ GC TCTAGATCA ATGTGATACACAGCATAAG 3’Xba I2)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用表達(dá)引物(F2，R2)對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見圖3)，目的片段與表達(dá)載體pPICZ a A都用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I進(jìn)行分步雙酶切，Τ4連接酶16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a A- β -防御素，經(jīng)華大基因公司測序鑒定，確定該基因已正確插入到表達(dá)載體pPICZa A中(見圖11)。
3)重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ a A- β -防御素和pPICZ a A空載體分別用限制性內(nèi)切酶BstX I酶切，體系如下:去離子水10 μ L，質(zhì)粒30 μ L，IOXH 緩沖液 5 μ L，BstX 15 μ L,總計50 μ L,45°C反應(yīng)5h，酶切產(chǎn)物用DNA清潔試劑盒進(jìn)行純化，20yL去離子水進(jìn)行洗脫，-20°C保存。4)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母感受態(tài)細(xì)胞及陽性酵母菌落的篩選將畢赤酵母(？丨(*丨& &8如1^8)65115感受態(tài)細(xì)胞8(^1^與經(jīng)88七乂 I線性化后的pPICZ a A-β-防御素質(zhì)粒(20 μ L)混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯(Bio-Red)中，置于冰上5!!^11，21^，25 4 ，40(^，電 擊8毫秒后，立即加入ImL預(yù)冷的lmol/L山梨醇，取200 μ L分別涂布于含伯萊霉素(Zeocin ) (100 μ g/mL, 500 μ g/mL, 1000 μ g/mL)的 YPDS 平板上，28°C培養(yǎng)72h，培養(yǎng)至單個菌落出現(xiàn)。同時電轉(zhuǎn)化未加入任何外源基因的pPICZ a A空載體。挑取陽性菌落用YPD+ZeocinTM 250rpm振蕩培養(yǎng)后，采用煮凍法提取重組酵母基因組DNA。將ImL菌液2500g離心5min，棄上清，沉淀中加入500 μ L TE緩沖液懸浮沉淀；2500g離心3min，棄上清；重復(fù)上步驟一次；最后沉淀溶于100 μ L TE，沸水浴10min，-80°C冷凍30min,再次沸水浴IOmin ；1500g離心5min ;取上清2 μ I為模板做PCR。以重組酵母基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μ L，即:Premix Taq 2.010 μ L,上游引物5’AOX (100 mM) 0.5 μ L,下游引物3’AOX (100 mM) 0.5 μ L,模板I μ L，滅菌無離子水8 μ L，總計20 μ L，混勻。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C下預(yù)變性3分鐘；然后進(jìn)行30個循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為94°C下變性30秒，48°C下退火30秒，72°C下延伸45分鐘；循環(huán)結(jié)束后在72°C下再延伸10分鐘。擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物5μ L用6X核酸上樣緩沖液點樣，1.5%瓊脂糖凝膠，I XTAE緩沖液，120V,電泳20分鐘觀察結(jié)果。5)高拷貝陽性菌株的誘導(dǎo)表達(dá)選擇PCR鑒定為陽性的重組酵母菌落接種于含20mL BMGY培養(yǎng)基的250毫升錐形瓶中，28°C，250轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)12 16小時，使0D600=2 6，離心收集菌體棄去BMGY培養(yǎng)基。把適量菌體轉(zhuǎn)移到含IOOmL BMMY培養(yǎng)基的1000毫升錐形瓶中，4層紗布包扎瓶口，使起始0D600為I左右。在28°C，250轉(zhuǎn)條件下開始甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。每隔24小時，向錐形瓶中加入終濃度為0.8%的甲醇，并補(bǔ)充適量的無菌水，同時誘導(dǎo)pPICZ a A空載體酵母菌。實施例4:團(tuán)頭魴β防御素重組蛋白(或多肽)的抑菌活性鑒定
甲醇誘導(dǎo)72小時后，10000轉(zhuǎn)離心收集表達(dá)上清，0.45 μ m濾膜過濾表達(dá)上清，在冰上攪拌加入固體硫酸銨，使飽和度為85%，硫酸銨完全溶解后，4°C靜置過夜，14000轉(zhuǎn)超速冷凍離心30分鐘，棄上清，用5mL PBS溶液溶解沉淀，4°C保存。同樣的方法濃縮pPICZ a A空載體酵母菌表達(dá)上清。采用牛津杯法對重組酵母菌表達(dá)上清液進(jìn)行抑菌活性測定:在LB培養(yǎng)基上劃線金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，在BHI培養(yǎng)基上劃線無乳鏈球菌和嗜水氣單胞菌，培養(yǎng)至單克隆長出。用0.65%無菌生理鹽水稀釋待測菌株至0D600為0.5 1，吸取50 μ L待測菌液加至已冷卻到50°C以下的液態(tài)LB和BHI固體培養(yǎng)基和中，混勻后倒平板。在凝固的平板上放置已滅菌的牛津杯，向牛津杯中加入100 μ L濃縮20倍的誘導(dǎo)表達(dá)上清(如無特殊說明，所用樣品均是濃縮20倍的上清，下略)，以加入相同體積AMP (0.lmg/mL)，濃縮pPICZ a A空載體酵母菌表達(dá)上清為陰性對照。培養(yǎng)至菌體長出，觀察抑菌圈大小。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養(yǎng)溫度為37°C，無乳鏈球菌、嗜水氣單胞菌培養(yǎng)溫度為28°C?？咕Ч姼綀DΓ7。結(jié)果表明團(tuán)頭魴β防御素重組蛋白對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(見圖4)和無乳鏈球菌(見圖6)以及革蘭氏陰性菌嗜水氣單胞菌(見圖5)、大腸桿菌(見圖7)具有良好的抑菌活性，其中氨芐青霉素對嗜水氣單胞菌和大腸桿菌無抑菌作用(氨芐耐藥型)，而團(tuán)頭魴β-防御素 I重組蛋白對氨芐耐藥型的嗜水氣單胞菌和大腸桿菌抑菌作用明顯。
權(quán)利要求
1.團(tuán)頭鮮β防御素基因，該基因具有如SEQ ID NO:1所不的核昔酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述團(tuán)頭魴β防御素基因的重組蛋白，該重組蛋白具有如序列表SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2所述重組蛋白的制備方法，其特征在于: 將序列表SEQ ID Ν0:1所述的團(tuán)頭魴β防御素基因重組至酵母表達(dá)載體中，誘導(dǎo)表達(dá)后獲得重組蛋白。
4.權(quán)利要求2所述重組蛋白在制備抗病菌類藥物、飼料添加劑、獸藥、防腐劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述重組蛋白在制備抗金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌的藥物、飼料 添加劑、獸藥、防腐劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種團(tuán)頭魴β防御素基因，該基因具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了編碼所述團(tuán)頭魴β防御素基因的重組蛋白及其制備方法，該重組蛋白具有如序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的團(tuán)頭魴β防御素重組蛋白對金黃色葡萄球菌、鏈球菌及氨芐耐藥型大腸桿菌和嗜水氣單胞菌等均具有良好的抑菌活性，為抗感染藥物及耐藥型細(xì)菌提供了一類療效好的新藥品。本發(fā)明所提供的團(tuán)頭魴β防御素重組蛋白的制備方法不僅易于獲得純度高的產(chǎn)品，而且相對于現(xiàn)有的化學(xué)合成方法活性較好、降低成本，縮短制備時間，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號A61P31/04GK103224940SQ20131012610
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月12日
發(fā)明者袁改玲, 陳思思, 張涓, 黃金海, 熊文靜, 劉小玲, 王衛(wèi)民 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)