專利名稱：使用her二聚化抑制劑在癌癥患者中延長病情進展前時間或存活的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)注在其癌癥表現(xiàn)出HER活化的癌癥患者中通過用HER 二聚化抑制劑諸如pertuzumab治療該患者來延長病情進展前時間或存活。
背景技術(shù)：
HER受體及針對它的抗體HER受體酪氨酸激酶家族是細胞生長、分化或存活的重要介質(zhì)。該受體家族包括四個截然不同的成員，包括表皮生長因子受體(EGFR、ErbBl或HER1)、HER2 (ErbB2或pl85neu)、HER3(ErbB3)和 HER4(ErbB4 或 tyro2)。人們認為由erbBl基因編碼的EGFR與人惡性腫瘤具有因果關(guān)系。具體而言，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、頭癌、頸癌和胃癌以及成膠質(zhì)細胞瘤中觀察到EGFR表達升高。EGFR受體表達升高常常與同一腫瘤細胞的EGFR配體即轉(zhuǎn)化生長因子α (TGF-α)的產(chǎn)量升高有關(guān)，通過自分泌刺激途徑導(dǎo)致受體活化。參見Baselga andMendelsohn, Pharmac.Ther.64:127-154 (1994)。針對 EGFR 或其配體 TGF-α 和 EGF 的單克隆抗體已經(jīng)在此類惡性腫瘤的治療中作為治療劑進行了評`估。參見例如Baselga andMendelsohn, supra;Masui et al., Cancer Research44:1002-1007(1984);ffu et al., J.Clin.1nvest.95:1897-1905(1995)。HER家族的第二個成員pl85neu最初鑒定為來自化學(xué)處理大鼠的成神經(jīng)細胞瘤的轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物?；罨问降膎eu原癌基因源自所編碼蛋白質(zhì)跨膜區(qū)中的點突變(纈氨酸變成谷氨酸)。在乳腺癌和卵巢癌中觀察到neu的人同系物的擴增，而且這與不良預(yù)后有關(guān)(Slamon et al.，Science235:177-182(1987);Slamon etal., Science244:707-712 (1989);美國專利第4，968，603號)。迄今為止，對于人腫瘤尚無與neu原癌基因中類似的點突變的報道。在其它癌中也已觀察到HER2的過表達(頻繁但不均一，原因在于基因擴增)，包括胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰和膀胱的癌。參見 King et al., Science229:974 (1985) ; Yokota et al.，Lancetl: 765-767 (1986);Fukushige et al., Mol.Cell Biol.6:955-958 (1986);Guerin et al., OncogeneRes.3:21-31 (1988);Cohen et al., 0ncogene4:81-88(1989);Yonemura et al., CancerRes.51:1034(1991);Borst et al., Gynecol.0ncol.38:364(1990) ;ffeiner et al., CancerRes.50:421-425 (1990);Kern et al., Cancer Res.50:5184(1990);Park et al., CancerRes.49:6605 (1989);Zhau et al.,Mol.Carcinog.3:254-257(1990);Aasland et al., Br.J.Cancer57:358-363(1988);Williams et al., Pathobiology59:46-52(1991);McCannet al.，Cancer65:88-92 (1990)等等。HER2 可在前列腺癌中過表達(Gu et al., CancerLett.99:185-9(1996);Ross et al., Hum.Pathol.28:827-33(1997);Ross et al., Cancer79:2162-70(1997);Sadasivan et al.，J.Urol.150:126-31 (1993))。針對大鼠pl85neu和人HER2蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體已有記載。Drebin及其同事制備了針對大鼠neu基因產(chǎn)物pl85neu的抗體。參見例如Drebinet al., Cell41:695-706(1985);Myers et al.,Meth.Enzym.198:277-290(1991);W094/22478。Drebin et al.，0ncogene2:273-277 (1988)報道了與 pl85neu 的兩個不同區(qū)域有反應(yīng)性的抗體混合物對植入裸鼠的neu轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細胞產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效果。還可參見1998年10月20日公告的美國專利第5，824，311號。Hudziak et al.，Mol.Cell.Biol.9 (3): 1165-1172 (1989)記載了一組 HER2 抗體的生成，并使用人乳瘤細胞系SK-BR-3進行了表征。將SK-BR-3細胞暴露于抗體后72小時通過細胞單層的結(jié)晶紫染色測定了相對細胞增殖。使用這種測定法，用稱作4D5的抗體獲得了最大抑制，它抑制細胞增殖達56%。該組其它抗體在這種測定法中以較低程度降低細胞增殖。還發(fā)現(xiàn)抗體4D5使過表達HER2的乳瘤細胞系對TNF-α的細胞毒性作用敏感。還可參見1997年10月14日公告的美國專利第5，677，171號。Hudziak等人的文章中所討論的HER2抗體在以下文獻中進行了進一步表征:Fendly et al., Cancer Research50:1550-1558(1990);Kotts et al., In Vitro26(3):59A(1990);Sarup et al., GrowthRegulationl:72-82(1991);Shepard et al., J.Clin.1mmunol.11 (3): 117-127 (1991) ; Kumar et al., Mol.Cell.Biol.11(2):979-986(1991);Lewis et al., Cancer Tmmunol.Tmmunother.37:255-2 63 (1993);Pietras et al., 0ncogene9:1829-1838(1994);Vitetta et al., Cancer Research54:5301-5309(1994);Sliwkowski et al., J.Biol.Chem.269(20):14661-14665(1994);Scott et al.，J.Biol.Chem.266:14300-5 (1991);D’souza etal., Proc.Natl.Acad.Sc1.91:7202-7206(1994);Lewis et al., Cancer Research56:1457-1465(1996);Schaefer et al., Oncogene15:1385-1394(1997) 鼠 HER2 抗體 4D5 的重組人源化型式(huMAb4D5_8、rhuMAb HER2、Trastuzumab
或H ERCEPTI N 美國專利第5，821，337號)在臨床上對患有HER2過表達的轉(zhuǎn)
移性乳腺癌并已接受廣泛現(xiàn)有抗癌療法的患者起作用(Baselga et al., J.Clin.0ncol.14:737-744(1996))。Trastuzumab在1998年9月25日得到了美國食品和藥品管理局的銷售許可，可用于治療其腫瘤過表達HER2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。以下文獻中記載了具有各種特性的其它HER2抗體:Tagliabue et al., Int.J.Cancer47:933-937 (1991) ;McKenzie et al., 0ncogene4:543-548 (1989) ;Maier et al., Cancer Res.51:5361-5369(1991) ;Bacus et al., Molecular Carcinogenesis3:350-362(1990);Stancovski et al., PNAS(USA)88:8691-8695 (1991) ;Bacus et al., Cancer Research52:2580-2589(1992);Xu et al., Int.J.Cancer53:4
01-408(1993) ;W094/00136;Kasprzyk et al., Cancer Research52:2771-2776 (1992) ;Hancock et al., Cancer Res.51:4575-4580 (1991) ;Shawver et al., CancerRes.54:1367-1373(1994);Arteaga et al., Cancer Res.54:3758-3765(1994);Harwerthet al.，J.Biol.Chem.267:15160-15167 (1992);美國專利第 5，783，186 號；Klapper et al ,0ncogenel4:2099-2109(1997)。同源性篩選使得HER受體家族的兩個其它成員得以鑒定:HER3(美國專利第 5,183,884 和 5,480,968 號;Kraus et al.，PNAS(USA)86:9193-9197(1989))和 HER4 (歐洲專利申請第 599,274 號;Plowman et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:1746-1750 (1993) ; Plowman et al.，Nature366:473-475 (1993))。這兩種受體都在至少有些乳腺癌細胞系中表現(xiàn)出表達升高。HER受體在細胞中通常以多種組合出現(xiàn)，而且認為異二聚化增加了對各種 HER 配體的細胞應(yīng)答的多樣性(Earp et al., Breast Cancer Research andTreatment35:115-132 (1995))。EGFR受到6種不同配體的結(jié)合:表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α (TGF-α)、雙調(diào)蛋白(amphiregulin)、肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)、β 細胞調(diào)節(jié)素(betacellulin)和上皮調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin) (Groenen etal., Growth Factorsll: 235-257 (1994))。由單一基因的可變剪接產(chǎn)生的一個調(diào)蛋白(heregulin)蛋白質(zhì)家族是HER3和HER4的配體。調(diào)蛋白家族包括α、β和γ調(diào)蛋白(Holmes et al.，Science256:1205-1210 (1992);美國專利第 5，641，869 號;Schaeferet al.，0ncogenel5:1385-1394(1997)) ；neu 分化因子(NDF);神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGF);乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA);及感覺和運動神經(jīng)元衍生因子(SMDF)。有關(guān)綜述參見 Groenen et al., Growth Factorsll:235-257(1994);Lemke, G., Molec.&Cell.Neurosc1.7:247-262(1996) ; Lee et al.，Pharm.Rev.47:51-85 (1995)。最近鑒定了另外三種HER配體:神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin) -2 (NRG-2)，據(jù)報道它結(jié)合HER3或HER4 (Changet al., Nature387:509-512 (1997) ; Carraway et al., Nature387:512-516 (1997));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3，它結(jié)合HER4 (Zhang et al.，PNAS (USA) 94 (18): 9562-7 (1997));和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4，它結(jié)合 HER4(Harari et al.，0ncogenel8:2681-89 (1999))。HB-EGF, β 細胞調(diào)節(jié)素和上皮調(diào)節(jié)蛋白也結(jié)合HER4。

雖然EGF和TGFa不結(jié)合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成異二聚體，它在異二聚體中活化EGFR并導(dǎo)致HER2的轉(zhuǎn)磷酸。二聚化作用和/或轉(zhuǎn)磷酸作用似乎活化HER2酪氨酸激酶。參見Earp et al.，supra。同樣，當(dāng)HER3與HER2共表達時，形成有活性的信號復(fù)合物，針對HER2的抗體能夠破壞此復(fù)合物(Sliwkowski et al., J.Biol.Chem.269(20): 14661-14665 (1994))。另外，在與 HER2 共表達時，HER3 對調(diào)蛋白(HRG)的親和力升高到更高的親和力狀態(tài)。關(guān)于HER2-HER3蛋白質(zhì)復(fù)合物還可參見Levi etal., Journal of Neurosciencel5:1329-1340(1995);Morrissey et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92:1431-1435 (1995);Lewis et al., Cancer Res.56:1457-1465(1996)。與HER3 —樣，HER4 與 HER2 形成有活性的信號復(fù)合物(Carraway and Cantley, Cell78:5-8 (1994))。涉及HER 抗體的專利出版物包括:US5, 677，171;US5, 720，937;US5, 720，954;US5，725，856;US5,770，195;US5, 772，997;US6, 165，464;US 6，387，371;US6,399，063;US2002/0192211A1;US6, 015，567;US6, 333，169;US4, 968，603;US5, 821，337;US6, 054，297;US6, 407，213;US6, 719，971;US6, 800，738;US2004/0236078A1;US5, 648，237;US6, 267，958;US6,685，940;US6, 821，515;W098/17797;US6, 127，526;US6, 333，398;US6, 797，814;US6, 339，I42;US6, 417，335;US6, 489，447;W099/31140;US2003/0147884A1;US2003/0170234A1;US2005/0002928A1;US6, 573，043;US2003/0152987A1;W099/48527;US2002/0141993A1;W001/00245;US2003/0086924;US2004/0013667A1;W000/69460;W001/00238;W001/15730;US6, 627，196B1;US6, 632，979B1;WOO 1/00244;US2002/0090662A1;W001/89566;US2002/0064785;US2003/0134344;W004/24866;US2004/0082047;US2003/0175845A1;W003/087131;US2003/0228663;W02004/008099A2;US2004/0106161;W02004/048525;US2004/0258685A1;US5,985，553;US5,747，261;US4,935，341;US5, 401，638;US5, 604，107;W087/07646;W089/10412;W091/05264;EP412, 116B1;EP494, 135B1;US5, 824，311;EP444, 181B1;EPl, 006, 194A2;US2002/0155527Al;W091/02062;US5, 571，894;US5, 939，531;EP502, 812B1;W093/03741;EP554，441B1;EP656,367A1;US5, 288，477;US5, 514，554;US5, 587，458;W093/12220;W093/16185;US5, 877，305;W093/21319;W093/21232;US5, 856，089;W094/22478;US5, 910，486;US6,028，059;W096/07321;US5, 804, 396;US5, 846，749;EP711，565;W096/16673;US5, 783, 404;US5, 977，322;US6, 512，097;W097/00271;US6, 270，765;US6, 395，272;US5, 837，243;W096/40789;US5, 783，186;US6, 458，356;W097/20858;W097/38731;US6, 214，388;US5, 925，519;WO98/02463;US5, 922，845;W098/18489;W098/33914;US5, 994，071;W098/45479;US6, 358，682Bl;US2003/0059790;W099/55367;ff001/20033;US2002/0076695Al;ff000/78347;ff001/09187;W001/21192;ff001/32155;ff001/53354;ff001/56604;ff001/76630;ff002/05791;ff002/11677;US6, 582，919;US2002/0192652A1;US2003/0211530A1;W002/44413;US2002/0142328;US6，602，670B2;W002/45653;W002/055106;US2003/0152572;US2003/0165840;ff002/087619;W003/006509;W003/012072;W003/028638;US2003/0068318;W003/041736;EPl, 357, 132;US2003/0202973;US2004/0138160;US 5，705，157;US6, 123，939;EP616, 812B1;US2003/0103973;US2003/0108545;US6, 403，630B1;W000/61145;W000/61185;US6, 333，348B1;W001/05425;W001/64246;US2003/0022918;US2002/0051785A1;US6, 767, 541;WOO 1/76586;US2003/0144252;W001/87336;US2002/0031515A1;WOO 1/87334;W002/05791;W002/09754;US2003/0157097;US2002/0076408;W002/055106;W002/070008;W002/089842;W003/86467。診斷劑用HER2抗體trastuzumab治療的患者是基于HER2過表達/擴增而選擇接受治療的。參見例如 W099/31140(Paton et al.)、US2003/0170234A1 (Hellmann, S.)和 US2003/0147884(Paton et al.)；以及 W001/89566、US2002/0064785 和US2003/0134344 (Mass et al.)。關(guān)于檢測HER2過表達和擴增的免疫組織化學(xué)(IHC)和熒光原位雜交(FISH)還可參見 US2003/0152987(Cohen et al.)。W02004/053497 和 US 2 O O 4 / O 2 4 8 I 5 A I (B ac u s et al.),以及US2003/0190689 (Crosby and Smith)涉及測定或預(yù)測對 trastuzumab 療法的響應(yīng)。US2004/013297A1 (Bacus et al.)涉及測定或預(yù)測對ABX0303EGFR抗體療法的響應(yīng)。W02004/000094 (Bacus et al.)涉及測定對 GW572016，一種小分子 EGFR-HER2 酪氨酸激酶抑制劑的響應(yīng)。W02004/063709 (Amler et al.)涉及用于測定對EGFR抑制劑，鹽酸erlotinib的敏感性的生物標(biāo)志和方法。US2004/0209290 (Cobleigh et al.)涉及用于乳癌預(yù)后的基因表達標(biāo)志?？苫贖ER活化或二聚化選擇用pertuzumab治療的患者來接受治療。涉及pertuzumab及用其治療的患者的選擇的專利出版物包括:W001/00245 (Adamset al.);US2003/0086924 (Sliwkowski,Μ.);US2004/0013667A1 (Sliwkowski,Μ.);及W02004/008099A2 和 US2004/0106161(Bossenmaier et al.)。
Cronin et al.，Am.J.Path.164 (I): 35-42 (2004)記載了檔案石蠟包埋組織中基因表達的測量法。Ma et al., Cancer Cell5:607_616 (2004)記載了使用取自檔案原代活檢的腫瘤組織切片的分離RNA通過基因寡核苷酸微陣列的基因概況分析。pertuzumab (又稱為重組人單克隆抗體 2C4 ;0MNITARG , Genetech, Inc, SouthSan Francisco)是一類稱為HER 二聚化抑制劑(HDI)的新作用劑中第一個問世的，它的功能是抑制HER2與其它HER受體(諸如EGFR/HER1、HER3和HER4)形成活性異二聚體的能力，而且不論HER2表達水平如何它都有活性。參見例如Harari and Yarden, 0ncogenel9:61
02-14(2000);Yarden and Sliwkowski, Nat Rev Mol Cell Biol2:127-37(2001);Sliwkowski, Nat Struct BiollO:158-9(2003);Cho et al., Nature421:756-60(2003) ;Malik etal., Pro Am Soc Cancer Res44:176-7(2003)。已經(jīng)證明,pertuzumab對腫瘤細胞中HER2-HER3異二聚體形成的阻斷抑制關(guān)鍵性的細胞信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致腫瘤擴增和存活降低(Agus et al., Cancer Cell2:127-37 (2002))。pertuzumab已在臨床上作為單一藥劑進行了檢驗,其中在患有晚期癌癥的患者中進行Ia期試驗，在患有卵巢癌和乳腺癌以及肺癌和前列腺癌的患者中進行II期試驗。在I期研究中，對具有標(biāo)準(zhǔn)治療期間或之后發(fā)展的，不可治愈的、局部發(fā)展為晚期的、復(fù)發(fā)性的或轉(zhuǎn)移性的實體瘤的患者每三周靜脈內(nèi)給予pertuzumab進行治療。對pertuzumab的耐受普遍較好。在響應(yīng)可評估的20名患者中有3名實現(xiàn)了腫瘤消退。兩名患者證實有部分響應(yīng)。在21名患者中有6名觀察到持續(xù)超過2.5個月的病情穩(wěn)定(Agus et al., Pro Am SocClin 0ncol22:192(2003))。在 2.0_15mg/kg 的劑量,pertuzumab 的藥動學(xué)是線性的，平均清除的范圍是2.69-3.74mL/天/kg，平均終末消除半衰期的范圍是15.3-27.6天。沒有檢測到針對 pertuzumab 的抗體(Allison et al., Pro Am Soc Clin 0ncol22:197 (2003))。發(fā)明概述本發(fā)明提供了來自用HER 二聚化抑制劑pertuzumab治療的人類癌癥患者的臨床數(shù)據(jù)。通過使用磷酸-ELISA生物測定法的測定，評估了患者的HER活化。在表現(xiàn)出HER活化的患者中觀察到通過病情進展前時間(TTP)或存活測量的臨床效益。相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一種在癌癥患者中延長病情進展前時間(TTP)或存活的方法，包括對患者施用HER 二聚化抑制劑,其量在該患者中延長TTP或存活,其中所述患者的癌癥表現(xiàn)出HER活化。本發(fā)明還涉及一種在患有卵巢癌、腹膜癌或輸卵管癌的患者中延長病情進展前時間(TTP)或存活的方法,包括對患者施用pertuzumab,其量在該患者中延長TTP或存活，其中所述患者的癌癥表現(xiàn)出HER2活化。本發(fā)明涉及下述各項。1.一種在癌癥患者中延長病情進展前時間(TTP)或存活的方法，包括對患者施用在該患者中延長TTP或存活的量的HER 二聚化抑制劑，其中所述患者的癌癥表現(xiàn)出HER活化。2.項I的方法，其中所述HER 二聚化抑制劑是HER2 二聚化抑制劑。3.項I或2的方法，其中所述HER 二聚化抑制劑抑制HER異二聚化。4.任一前述項的方法，其中所 述患者的癌癥表現(xiàn)出HER2活化。5.任一前述項的方法，其中所述患者的癌癥表現(xiàn)出HER2磷酸化。
6.項5的方法，其中所述患者的癌癥表現(xiàn)出如磷酸-ELISA測定法中評估的HER2
磷酸化。7.任一前述項的方法，其中所述患者的癌癥表現(xiàn)出如基因表達概況分析所評估的HER2活化。8.任一前述項的方法，其中所述HER 二聚化抑制劑是抗體。9.項8的方法，其中所述抗體結(jié)合選自EGFR、HER2和HER3的HER受體。10.項9的方法，其中所述抗體結(jié)合HER2。11.項10的方法，其中所述HER2抗體結(jié)合HER2胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域II。12.項11的方法，其中所述抗體結(jié)合HER2胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域1、結(jié)構(gòu)域II和結(jié)構(gòu)域III之間的連接處。13.項12的方法，其中所述HER抗體包括分別示于SEQ ID NO: 3和4中的輕鏈可
變區(qū)和重鏈可變區(qū)氨基酸序列。14.項13的方法,其中所述HER 二聚化抑制劑是pertuzumab。15.項8 — 14任一項的方法，其中所述HER抗體是裸抗體。16.項8 — 15任一項的方法，其中所述HER抗體是完整抗體。17.項8 — 15任一項的方法，其中所述HER抗體是包含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。18.任一前述項的方法，其中所述癌癥選自卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)、非小細胞性肺癌(NSCLC)、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌。19.項18的方法，其中所述癌癥是卵巢癌、腹膜癌或輸卵管癌。20.項18的方法，其中所述癌癥是晚期的、頑固性的或復(fù)發(fā)性的卵巢癌。21.任一前述項的方法，其中所述HER 二聚化抑制劑作為單一抗腫瘤劑施用。22.項I至20任一項的方法，包括對患者施用第二治療劑。23.項22的方法，其中所述第二治療劑選自化療劑、HER抗體、針對腫瘤相關(guān)抗原的抗體、抗激素化合物、保心藥、細胞因子、EGFR靶向藥物、抗血管發(fā)生劑、酪氨酸激酶抑制齊U、COX抑制劑、非類固醇抗炎藥、法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、結(jié)合癌胚蛋白CA125的抗體、HER2疫苗、HER靶向療法、Raf或ras抑制劑、多柔比星脂質(zhì)體、托泊替康、紫杉烷、雙重酪氨酸激酶抑制劑、TLK286、EMD-7200、治療惡心的藥物、預(yù)防或治療皮疹的藥物或標(biāo)準(zhǔn)痤瘡療法、治療或預(yù)防腹瀉的藥物、降低體溫的藥物和造血生長因子。24.項23的方法，其中所述第二治療劑是化療劑。25.項24的方法，其中所述化療劑是抗代謝物類化療劑。26.項25的方法，其中所述抗代謝物類化療劑是吉西他濱。27.項22的方法，其中所述第二治療劑是trastuzumab、erlotinib或bevacizumab。28.任一前述項的方法，其中TTP得到延長。29.任一前述項的方法，其中存活得到延長。30.任一前述項的方法，其中對癌癥患者施用HER二聚化抑制劑使TTP或存活比施用批準(zhǔn)的抗腫瘤劑所達到的TTP或存活多延長至少約20%。31.一種在卵巢癌、腹膜癌或輸卵管癌患者中延長病情進展前時間(TTP)或存活的方法，包括對患者施用在該患者中 延長TTP或存活的量的pertuzumab,其中所述患者的癌癥表現(xiàn)出HER2活化。32.項31的方法，其中所述患者患有卵巢癌。33.項31或32的方法，其中所述患者患有晚期的、頑固性的或復(fù)發(fā)性的癌癥。34.項31至33任一項的方法,其中對患者施用peruzumab使TTP或存活比對患者施用托泊替康或多柔比星脂質(zhì)體所達到的TTP或存活多延長至少約20%。35.項31至34任一項的方法，還包括對患者施用化療劑。36.項35的方法，其中所述化療劑是抗代謝物類化療劑。37.項36的方法，其中所述抗代謝物類化療劑是吉西他濱。附圖簡述

圖1提供了 HER2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的示意圖，及其胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域I_IV的氨基酸序列(分別為 SEQ ID N0.19-22)。圖2A和2B描繪了鼠單克隆抗體2C4的輕鏈可變(V)域(圖2A)和重鏈可變(Vh)域(圖2B)的氨基酸序列(分別為SED ID N0.1和2)、變體574/pertuzumab的\和Vh域的氨基酸序列(分別為SED ID N0.3和4)、及人Vl和Vh共有框架(humK 1，輕鏈K亞類I ；hum III，重鏈亞類III)的氨基酸序列(分別為SED IDN0.5和6)的比對。星號標(biāo)明了pertuzumab與鼠單克隆抗體2C4的可變域之間或者pertuzumab與人框架的可變域之間的不同之處?；パa決定區(qū)(OTR)括在括號中。圖3A 和 3B 顯示了 pertuzumab 輕鏈(圖 3A ；SEQ ID N0.13)和重鏈(圖 3B ；SEQID N0.14)的氨基酸序列。⑶R以粗體顯示。輕鏈和重鏈的計算分子量為23,526.22Da和49, 216.56Da (半胱氨酸為還原形式)。碳水化合物模塊附著于重鏈的Asn299。圖4示意性的描繪了 2C4在HER2的異二聚體結(jié)合位點處結(jié)合，從而阻止與活化的EGFR或HER3 二聚化的情形。圖5描述了 HER2/HER3與MAPK和Akt途徑的偶聯(lián)。圖6 比較了 trastuzumab 與 pertuzumab 的多種活性。圖7A 和 7B 分別顯示了 trastuzumab 輕鏈(圖 7A ；SEQ ID N0.15)和重鏈(圖 7B ；SEQ ID N0.16)的氨基酸序列。圖8A和8B分別描繪了一種變體pertuzumab輕鏈序列(圖8A ；SEQ IDN0.17)和一種變體 pertuzumab 重鏈序列(圖 8B ；SEQ ID N0.18)。圖9提供了實施例1中接受治療的患者的基線人口統(tǒng)計狀況。圖10顯示了所有的第3-4級不良事件(不考慮與治療的相關(guān)性)。圖11顯示了嚴(yán)重的不良事件(不考慮與治療的相關(guān)性)。圖12總結(jié)了調(diào)查人員判斷為與研究藥物有關(guān)的嚴(yán)重的不良事件。圖13提供了所選擇不良事件的信息。圖14描繪了心臟嚴(yán)重不良事件和需要速報的不良事件。圖15總結(jié)了實施例1中pertuzumab的II期研究的功效結(jié)果。圖16顯示了對于用低劑量(420mg)或高劑量(1050mg) pertuzumab治療的可評估卵巢癌受試者的 病情進展前時間(TTP)功效。圖17顯示了對于用低劑量(420mg)或高劑量(1050mg) pertuzumab治療的可評估卵巢癌受試者的總體存活功效。用托泊替康治療的卵巢癌受試者的歷史存活中值(historical median survival)為43周，用多柔比星脂質(zhì)體治療的為36周。圖18提供了用420mg或1050mg pertuzumab治療的卵巢癌受試者的CA-125響應(yīng)。圖19提供了用420mg pertuzumab治療的卵巢癌受試者的磷酸-HER2 (pHER2)狀態(tài)，通過ELISA測定。圖20提供了用420mg pertuzumab治療的卵巢癌受試者基于pHER2狀態(tài)的臨床功效結(jié)果；pHER2狀態(tài)通過ELISA測定。圖21提供了用420mg pertuzumab治療、表現(xiàn)出活性跡象(部分響應(yīng)(PR)或病情穩(wěn)定(SD)超過18周)的卵巢癌受試者的pHER2狀態(tài)，通過ELISA測定。BSLD指基線最長直徑總和(baseline sum of longest diameter)。圖22顯示了基于pHER2狀態(tài)的TTP功效。卵巢癌受試者用420mgpertuzumab進行治療?？傮wTTP為6.6周；pHER陽性受試者中的TTP為20.9周；pHER陰性受試者中的TTP為6.0周；而pHER2狀態(tài)未知受試者中的TTP為9.1周。圖23描繪了基于pHER2狀態(tài)的總體存活。卵巢癌受試者用420mgpertuzumab進行治療。用托泊替康治療的卵巢癌受試者的歷史存活中值為43周，而用多柔比星脂質(zhì)體治療的為36周。 發(fā)明詳述和優(yōu)選實施方案1.定義 在本文中“病情進展前時間”(time to disease progression)或“TTP”指自初始治療(例如使用HER 二聚化抑制劑,諸如pertuzumab)時起,到癌癥進展(progress)或惡化(worsen)止的時間，一般以周或月計。這樣的進展可以由熟練臨床醫(yī)師來評估。例如，在卵巢癌的情況中，可以通過RECIST來評估(參見例如Therasse et al., J.Nat.CancerInst.92(3):205-216(2000))?！把娱LTTP”意味著使接受治療的患者的病情進展前時間相對于未接受治療的患者(即相對于未用HER 二聚化抑制劑諸如pertuzumab治療的患者)或者相對于不表現(xiàn)出HER活化的患者，和/或相對于用已獲批準(zhǔn)的抗腫瘤劑(諸如托泊替康或多柔比星脂質(zhì)體，在癌癥是卵巢癌時)治療的患者有延長。“存活”(survival)指患者保持存活,包括總體存活(overall survival)和無進展存活(progress free survival)?！翱傮w存活”指保持一定時期諸如I年、5年等存活的患者，自診斷或治療時起?！盁o進展存活”指保持存活且癌癥沒有進展或惡化的患者?！把娱L存活”意味著使接受治療的患者的總體存活或無進展存活相對于未接受治療的患者(即相對于未用HER二聚化抑制劑諸如pertuzumab治療的患者)或者不表現(xiàn)出HER活化的患者，和/或相對于用已獲批準(zhǔn)的抗腫瘤劑(諸如托泊替康或多柔比星脂質(zhì)體，在癌癥是卵巢癌時)治療的患者有延長。“客觀響應(yīng)”(objective response)指可測量的響應(yīng),包括完全響應(yīng)(CR)或部分響應(yīng)(PR)。“完全響應(yīng)"(complete response)或“CR”指癌癥的所有體征響應(yīng)治療而消失。這并不總是意味著癌癥已經(jīng)治愈。
“部分響應(yīng)”(partial response)或“PR”指一處或多處腫瘤或損害的大小或體內(nèi)癌癥的程度響應(yīng)治療而減小。“HER受體”是屬于HER受體家族的受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，包括EGFR、HER2、HER3和HER4受體。HER受體通常將包含胞外結(jié)構(gòu)域，它可結(jié)合HER配體和/或與另一 HER受體分子二聚化；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和含有數(shù)個可磷酸化的酪氨酸殘基的羧基末端信號結(jié)構(gòu)域。HER受體可以是“天然序列”HER受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選的是，HER受體是天然序列人HER受體。術(shù)語11^1”、“!^1”、“表皮生長因子受體”和16 1 ”在本文中可互換使用，指例如 Carpenter et al.，Ann.Rev.Biochem.56:881-914 (1987)中所披露的 EGFR,包括其天然存在的突變體形式(例如Humphrey et al., PNAS(USA)87:4207-4211 (1990)中的刪除突變體EGFR)。erbBl指編碼EGFR蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互換使用，指例如Semba etal.,PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)和 Yamamoto et al., Nature319:230-234 (1986)中記載的人HER2蛋白(Genebank編號X03363)。術(shù)語“erbB2”指編碼人ErbB2的基因，而“neu”指編碼大鼠Pl85neu的基因。優(yōu)選的HER2是天然序列人HER2。在本文中，“HER2胞外結(jié)構(gòu)域”或“HER2E⑶”指HER2在細胞外的結(jié)構(gòu)域，或是錨定于細胞膜或是在循環(huán)中，包括其片段。在一個實施方案中，HER2的胞外結(jié)構(gòu)域可包含4個結(jié)構(gòu)域:“結(jié)構(gòu)域I”(大約第1-195位氨基酸殘基；SEQ ID NO: 19)、“結(jié)構(gòu)域II”(大約第196-319位氨基酸殘基；SEQ ID N0:20)、“結(jié)構(gòu)域III”(大約第320-488位氨基酸殘基；SEQID N0:21)和“結(jié)構(gòu)域IV” (大約第489-630位氨基酸殘基；SEQ ID NO: 22)(殘基編號不包括信號肽)。參見 Garrett et al.，Mol.Cell.11:495-505 (2003) ; Cho et al., Nature421:756-760(2003);Franklin et al., Cancer Cell5:317-328(2004);Plowman et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.90:1746-1750 (1993)，以及本文中的圖1。“ErbB3”和 “HER3”指例如美國專利第 5，183，884 號和第 5，480, 968 號及 Kraus etal.,PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)中所披露的受體多肽。術(shù)語“ErbB4”和“HER4”指例如歐洲專利申請第599,274號;Plowmanet al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA90:1746-1750(1993);Plowman etal.，Nature366:473-475 (1993)中所披露的受體多肽，包括其同種型，例如1999年4月22日公布的W099/19488中所披露的?！癏ER配體”指結(jié)合和/或活化HER受體的多肽。本文中特別感興趣的HER配體是天然序列人HER配體，諸如表皮生長因子(EGF) (Savage et al.，J.Biol.Chem.247:7612-7621 (1972))；轉(zhuǎn)化生長因子 a (TGF-a )(Marquardt etal., Science223:1079-1082 (1984));雙調(diào)蛋白(amphiregulin)，也稱為施旺細胞瘤或角質(zhì)形成細胞自分泌生長因子(Shoyab et al., Science243:1074-1076 (1989) ; Kimura etal., Nature348:257-260(1990);Cook et al.，Mol.Cell.Biol.11:2547-2557 (1991))；β 細胞調(diào)節(jié)素(betacellulin)(Shing et al.，Science259:1604-1607(1993);Sasada et al., Biochem.Biophys.Res.Commun.190:1173(1993));肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)(Higashiyama et al.，Science251:936-939(1991));上皮調(diào)節(jié)蛋白(epiregulin) (Toyoda et al., J.Biol.Chem.270:7495-7500(1995);Komurasaki etal., Oncogenel5:2841-2848 (1997)) ； α 調(diào)蛋白(heregulin)(見下文)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin) -2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature387:512-516 (1997));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3 (NRG-3) (Zhang et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.94:9562-9567 (1997));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4(NRG-4)(Harari et al., 0ncogenel8:2681-89 (1999));和 cripto(CR-1)(Kannan etal.，J.Biol.Chem.272 (6): 3330-3335 (1997))。結(jié)合 EGFR 的 HER 配體包括 EGF,TGF- α、雙調(diào)蛋白、β細胞調(diào)節(jié)素、HB-EGF和上皮調(diào)節(jié)蛋白。結(jié)合HER3的HER配體包括調(diào)蛋白。能夠結(jié)合HER4的HER配體包括β細胞調(diào)節(jié)素、上皮調(diào)節(jié)蛋白、HB-EGF, NRG-2、NRG-3、NRG-4和調(diào)蛋白?！罢{(diào)蛋白”(HRG)在用于本文時指由調(diào)蛋白基因編碼的多肽，如美國專利第 5,641,869 號或 Marchionni et al.，Nature362:312-318 (1993)中所披露的。調(diào)蛋白的例子包括調(diào)蛋白、調(diào)蛋白-β 1、調(diào)蛋白-β 2和調(diào)蛋白-β 3(HolmeSet al., Scienc e256:1205-1210(1992);美國專利第 5,641,869 號);neu 分化因子(NDF) (Peles et al.，Cell69:205-216 (1992))；乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA)(Falls et al.，Cell72:801-815 (1993));神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGF) (Marchionni etal.，Nature362:312-318 (1993));感覺和運動神經(jīng)元衍生因子(SMDF) (Ho et al.，J.Biol.Chem.270:14523-14532 (1995)) ;γ-調(diào)蛋白(Schaefer et al.，0ncogenel5:1385-1394 (I997))?！癏ER 二聚體”在本文中指包含至少兩個HER受體的非共價結(jié)合二聚體。在表達兩種或多種HER受體的細胞暴露于HER配體時可形成這樣的復(fù)合物，可通過免疫沉淀來分離并通過SDS-PAGE來分析，如例如Sliwkowski et al., J.Biol.Chem.269(20):14661-14665(1994)中所記載的。其它蛋白質(zhì)，諸如細胞因子受體亞基(例如gpl30)可與二聚體結(jié)合。優(yōu)選的是，HER 二聚體包含HER2。“HER異二聚體”在本文中指包含至少兩個不同HER受體的非共價結(jié)合異二聚體，諸如 EGFR-HER2、HER2-HER3 或 HER2-HER4 異二聚體?！癏ER抑制劑”指干擾HER活化或功能的藥劑。HER抑制劑的例子包括HER抗體(例如EGFR、HER2、HER3或HER4抗體)；EGFR靶向藥物；小分子HER拮抗劑；HER酪氨酸激酶抑制劑；HER2和EGFR雙重酪氨酸激酶抑制劑，諸如lapatinib/GW572016 ;反義分子(參見例如TO2004/87207);和/或結(jié)合下游信號分子諸如MAPK或Akt (見圖5)或干擾其功能的藥齊U。優(yōu)選的是，HER抑制劑是結(jié)合HER受體的抗體或小分子?！癏ER 二聚化抑制劑”指抑制HER 二聚體或HER異二聚體形成的藥劑。優(yōu)選的是，HER二聚化抑制劑是抗體，例如在HER2的異二聚體結(jié)合位點結(jié)合HER2的抗體。本文中最優(yōu)選的HER 二聚化抑制劑是pertuzumab或MAb 2C4。2C4對HER2的異二聚體結(jié)合位點的結(jié)合示于圖4。HER 二聚化抑制劑的其它例子包括結(jié)合EGFR并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗體(例如EGFR單克隆抗體806，MAb806，它結(jié)合活化的或“未系留的”EGFR ；參見 Johns et al.，J.Biol.Chem.279 (29): 30375-30384 (2004));結(jié)合 HER3 并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗體；結(jié)合HER4并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗體；肽二聚化抑制劑(美國專利第6，417，168號);反義二聚化抑制劑；等等。“HER2 二聚化抑制劑”指抑制包含HER2的二聚體或異二聚體形成的藥劑。“HER抗體”指結(jié)合HER受體的抗體。任選的是，HER抗體還干擾HER活化或功能。優(yōu)選的是，HER抗體結(jié)合HER2受體。本文中特別感興趣的HER2抗體是pertuzumab。HER2抗體的另一個例子是trastuzumab。EGFR抗體的例子包括cetuximab和ABX0303?！癏ER活化”指任何一種或多種HER受體的活化或磷酸化。通常，HER活化導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如由HER受體胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，該激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化HER受體或底物多肽中的酪氨酸殘基)。HER活化可由結(jié)合包含目的HER受體的HER 二聚體的HER配體介導(dǎo)。結(jié)合HER 二聚體的HER配體可活化二聚體中一種或多種HER受體的激酶結(jié)構(gòu)域，由此導(dǎo)致一種或多種HER受體中酪氨酸殘基的磷酸化和/或其它底物多肽諸如Akt或MAPK胞內(nèi)激酶中酪氨酸殘基的磷酸化。參見例如圖5。“磷酸化”指對蛋白質(zhì)諸如HER受體，或其底物添加一個或多個磷酸基團?！耙种艸ER 二聚化”的抗體指抑制或干擾HER 二聚體形成的抗體。優(yōu)選的是，此類抗體在HER2的異二聚體結(jié)合位點處結(jié)合HER2。本文中最優(yōu)選的二聚化抑制性抗體是pertuzumab或MAb2C4。2C4對HER2的異二聚體結(jié)合位點的結(jié)合示于圖4。抑制HER 二聚化的抗體的其它例子包括 結(jié)合EGFR并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗體(例如EGFR單克隆抗體806，MAb806，它結(jié)合活化的或“未系留的”EGFR ;參見Johns et al.，J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004));結(jié)合HER3并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗體；及結(jié)合HER4并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗體?！氨萾rastuzumab更有效的阻斷配體對HER受體之活化”的抗體指比trastuzumab更有效(例如功效提高至少約2倍)的降低或消除HER配體對HER受體之活化的抗體。優(yōu)選的是，此類抗體至少大約像鼠單克隆抗體2C4或其Fab片段或者像pertuzumab或其Fab片段那樣有效的阻斷HER配體對HER受體之活化?？赏ㄟ^直接研究HER二聚體，或者通過評估由HER二聚化引起的HER活化或下游信號傳導(dǎo)，和/或通過評估抗體-HER2結(jié)合位點等來評估抗體阻斷配體對HER受體之活化的能力。用于篩選有能力比trastuzumab更有效的抑制配體對HER受體之活化的抗體的測定法記載于Agus et al., Cancer Cell2:127-137 (2002)和TOO 1/00245 (Adams et al.)。僅作為例示，可測定以下各項:對HER 二聚體形成的抑制(參見例如 Agus et al., Cancer Cell2:127-137 (2002)的附圖 1A-B 和 W001/00245);表達HER 二聚體的細胞中HER配體活化的降低(例如W001/00245和Agus et al., CancerCell2:127-137(2002)的附圖2A-B);對HER配體結(jié)合表達HER 二聚體的細胞的阻斷(例如WOO1/00245 和 Agus et al., Cancer Cell2:127-137 (2002)的附圖 2E);在存在(或缺乏)HER 配體時對表達 HER 二聚體的癌細胞(例如 MCF7、MDA-MD-134、ZR-75-l、MD-MB-175、T-47D細胞)的細胞生長抑制(例如 W001/00245 和 Agus et al., Cancer Cell2:127-137 (2002)的附圖3A-D)；對下游信號傳導(dǎo)的抑制(例如對HRG依賴性AKT磷酸化的抑制或者對HRG或TGF α依賴性MAPK磷酸化的抑制)(例如W001/00245和Agus et al.，CancerCell2:127-137(2002)的附圖2C-D)。還可通過研究抗體-HER2結(jié)合位點來評估抗體是否抑制HER 二聚化，例如通過評估與HER2結(jié)合的抗體的結(jié)構(gòu)或模型，諸如晶體結(jié)構(gòu)(參見例如 Franklin et al., Cancer Cel15:317-328 (2004)) HER2上的“異二聚體結(jié)合位點”指在HER2與EGFR、HER3或HER4形成二聚體時，與EGFR、HER3或HER4胞外結(jié)構(gòu)域中某區(qū)域接觸或形成介面的HER2胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域。已發(fā)現(xiàn)所述區(qū)域在 HER2 的結(jié)構(gòu)域 II 中。Franklin et al., Cancer Cell5:317-328 (2004)。
HER2抗體可以比trastuzumab更有效的(例如功效提高至少2倍)“抑制HRG依賴性AKT磷酸化”和/或抑制“HRG或TGF α依賴性MAPK磷酸化”(參見例如Agus et al., CancerCell2:127-137(2002) WOO1/00245)。HER2抗體可以是像pertuzumab那樣“不抑制HER2胞外域切割”的抗體(Molinaet al., Cancer Res.61:4744-4749 (2001))。另一方面，trastuzumab 可抑制 HER2 胞外域切割。“結(jié)合HER2的異二聚體結(jié)合位點的”HER2抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域II中的殘基(任選還結(jié)合HER2胞外結(jié)構(gòu)域的其它結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)構(gòu)域I和III中的殘基)，且至少在一定程度上可在空間上阻礙HER2-EGFR、HER2-HER3或HER2-HER4異二聚體的形成。Franklin etal., Cancer Cell5:317-328 (2004)表征了存放在 RCSB 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ID Code IS78)的HER2-pertuzumab晶體結(jié)構(gòu)，圖解了結(jié)合HER2的異二聚體結(jié)合位點的例示性抗體?！敖Y(jié)合HER2的結(jié)構(gòu)域II”的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域II中的殘基和任選HER2的其它結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)構(gòu)域I和III中的殘基。優(yōu)選的是，結(jié)合結(jié)構(gòu)域II的抗體結(jié)合HER2的結(jié)構(gòu)域1、II和III之間的連接處。蛋白質(zhì)“表達”指基因中所編碼的信息轉(zhuǎn)換成信使RNA (mRNA)，然后轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)。在本文中，“表達”目的蛋白質(zhì)(諸如HER受體或HER配體)的樣品或細胞指其中測定出存在編碼該蛋白質(zhì)的mRNA或蛋白質(zhì)包括其片段的樣品或細胞。“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“PCR”技術(shù)在用于本文時一般指其中如1987年7月28日公告的美國專利第4，683，195號中所記載的，擴增微量的核酸，RNA和/或DNA特定片段的流程。通常，需要獲知目的區(qū)域末端或以外的序列信息，從而可設(shè)計寡核苷酸引物；這些引物在序列上將與待擴增模板的對立鏈相同或相似。兩條引物的5’末端核苷酸可與所擴增物質(zhì)的末端一致。PCR可用于從總基因組DNA和由總細胞RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等擴增特定RNA序列、特定DNA序列。一般參 見Mullis et al., Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.51:263(1987);Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989。在用于本文時，PCR視為用于擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應(yīng)方法的一個但非唯一的例子，包括使用已知核酸(DNA或RNA)作為引物并利用核酸聚合酶來擴增或生成特定核酸片段，或者擴增或生成與特定核酸互補的特定核酸片段?！岸繉崟r聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“qRT-PCR”指PCR的一種形式，其中在PCR反應(yīng)的每個步驟測量PCR產(chǎn)物的量。這種技術(shù)已經(jīng)記載于多份出版物,包括Cronin et al., Am.J.Pathol.164(I):35-42(2004);Ma et al., Cancer Cell.5:607-616(2004)。術(shù)語“微陣列”指可雜交陣列元素，優(yōu)選多核苷酸探針在基片上的有序排列。術(shù)語“多核苷酸”在以單數(shù)或復(fù)數(shù)使用時一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，可以是未經(jīng)修飾的RNA或DNA或者是經(jīng)過修飾的RNA或DNA。如此，例如，本文中所定義的多核苷酸包括但不限于單鏈和雙鏈DNA、包含單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的DNA、單鏈和雙鏈RNA、及包含單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的RNA，包含DNA和RNA的雜合分子，它可以是單鏈的，或者更典型的是雙鏈的，或者包含單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)。另外，術(shù)語“多核苷酸”在用于本文時指包含RNA或DNA或RNA和DNA 二者的三鏈區(qū)。此 類區(qū)中的鏈可來自相同分子或來自不同分子。所述區(qū)可包含一種或多種分子的整個，但是更典型的是只包含有些分子的一個區(qū)。三股螺旋區(qū)的分子之一常常是寡核苷酸。術(shù)語“多核苷酸”明確包括cDNA。該術(shù)語包括包含一種或多種經(jīng)修飾堿基的DNA (包括cDNA)和RNA。如此，主鏈為穩(wěn)定性或其它原因而修飾的DNA或RNA也是“多核苷酸”該術(shù)語在本文中的意圖所在。此外，包含罕見堿基諸如肌苷或經(jīng)修飾堿基諸如氚化堿基的DNA或RNA也包括在本文中所定義的術(shù)語“多核苷酸”內(nèi)。一般而言，術(shù)語“多核苷酸”涵蓋未修飾多核苷酸的所有化學(xué)、酶學(xué)和/或代謝修飾形式，以及病毒和細胞，包括簡單和復(fù)雜細胞的特征性的DNA和RNA的化學(xué)形式。術(shù)語“寡核苷酸”指相對較短的多核苷酸，包括但不限于單鏈脫氧核糖核苷酸、單鏈或雙鏈核糖核苷酸、RNAiDNA雜合物、及雙鏈DNA。寡核苷酸，諸如單鏈DNA探針寡核苷酸，常常通過化學(xué)方法來合成，例如使用商品化的自動化寡核苷酸合成儀。然而，寡核苷酸可通過多種其它方法來制備,包括體外重組DNA介導(dǎo)的技術(shù)和通過DNA在細胞和生物體中的表達。短語“基因擴增”指通過它在特定細胞或細胞系中形成基因或基因片段的多個拷貝的過程。所復(fù)制區(qū)域(一段擴增的DNA)常常稱為“擴增子”。通常，所生成的信使RNA(mRNA)的量也按所表達特定基因生成的拷貝數(shù)的比例升高。雜交反應(yīng)的“嚴(yán)格性”可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易的確定，而且通常根據(jù)探針長度、洗滌溫度和鹽濃度憑經(jīng)驗計算。一般而言，較長的探針要求較高的溫度以正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當(dāng)互補鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時變性DNA重新退火的能力。探針與可雜交序列之間的期望同源性程度越高，可使用的相對溫度也越高。結(jié)果，可推出較高相對溫度將趨向于使反應(yīng)條件更為嚴(yán)格，而較低溫度也就較不嚴(yán)格。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的其它細節(jié)和解釋，參見Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers，1995?！皣?yán)格條件”或“高嚴(yán)格性條件”，如本文中所定義的，通常:(1)采用低離子強度和高溫進行洗滌，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，于50°C ;(2)在雜交期間采用變性劑，諸如甲酰胺，例如50%(v/v)甲酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.l%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，于42 °C ;或(3)采用50%甲酰胺，5x SSC (0.75M NaCl, 0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1%焦磷酸 鈉，5x Denhardt氏溶液，超聲處理的鮭魚精DNA (50 μ g/ml), 0.1%SDS,和10%硫酸右旋糖苷，于42°C，及于42°C在0.2x SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)和50%甲酰胺中洗滌，接著于55°C在含EDTA的0.1x SSC中進行高嚴(yán)格性洗滌?！爸械葒?yán)格條件”可以如 Sambrook et al., Molecular Cloning:A LaboratoryManual, New York, Cold Spring Harbor Press, 1989中所述來鑒定,包括使用比上文所述較不嚴(yán)格的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度、離子強度和％SDS)。中等嚴(yán)格條件的例子是于37°C 在含 20% 甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl, 15mM 檸檬酸三鈉)，50mM 磷酸鈉(pH7.6)，5xDenhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育過夜，接著于大約37-50°C在Ix SSC中洗滌濾膜。熟練技術(shù)人員將認識到如何在必要時調(diào)整溫度、離子強度等以適應(yīng)諸如探針長度等因素?！疤烊恍蛄小倍嚯闹概c衍生自自然界的多肽(例如HER受體或HER配體)具有相同氨基酸序列的多肽，包括天然存在的或等位變體。此類天然序列多肽可以從自然界分離，或者可通過重組或合成手段生成。如此，天然序列多肽可具有天然存在人多肽、鼠多肽、或來自任何其它哺乳類物種的多肽的氨基酸序列。術(shù)語“抗體”在本文中以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體通常以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中結(jié)合靶物的多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇結(jié)合靶物的單一多肽序列在內(nèi)的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，所選擇的靶物結(jié)合序列可進一步改變，例如為了提高對靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來生成，包括例如雜交瘤法(例如 Kohler et al., Nature256:495 (1975) ; Harlow et al., Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988;Hammerlinget al., in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomasj 563-681, Elsevier, N.Y.，1981)、重組DNA法(參見例如美國專利第4，816，567號)、噬菌體展示技術(shù)(參見例如 Clackson et al.，Nature352:624-628(1991);Marks et al., J.Mol.Biol.222:581-597(1991);Sidhu et al., J.Mol.Biol.338(2):299-310 (2004);Lee etal., J.Mol.Biol.340 (5): 1073-1093 (2004) ; Fellouse, Proc.Nat.Acad.Sc1.USAlOl (34):12467-12472 (2004) ; Lee et al., J.1mmunol.Methods284 (1-2): 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整個人免 疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如 W01998/24893;W01996/34096;W01996/33735;W01991/10741;Jakobovits et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:2551(1993);Jakobovits et al., Nature362:255-258 (1993) ; Bruggemann et al., Year in Tmmun ο.7:33 (1993);美國專利第5，545，806號;第5，569，825號;第5，591，669號(都是GenPharm的);美國專利第5，545，807 號;W01997/17852;美國專利第 5，545，807 號；第 5，545，806 號；第 5，569，825號；第 5，625, 126 號；第 5，633, 425 號；和第 5，661, 016 號;Marks et al., Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg et al., Nature368:856-859(1994);Morrison, Nature368:812-813(1994);Fishwild et al., Nature Biotechnologyl4:845-851 (1996)
;Neuberger, Nature Biotechnology14:826(1996);Lonberg and Huszar, Intern.Rev.Tmmunol.13:65-93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利第4，816，567號Morrison etal.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長類(例如舊大陸猴類(Old World Monkey)、猿等)的可變域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列的“靈長類化”抗體，以及“人源化”抗體。非人(例如嚙齒類)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個這樣的可變區(qū)，其中整個或基本上整個高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且整個或基本上整個FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見Jones et al.，Nature321:522-525(1986);Riechmann et al., Nature332:323-329(1988);Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596(1992)。人源化HER2 抗體包括 huMAb4D5-l、huMAb4D5_2、huMAb4D5_3、huMAb4D5_4、
huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7 和 huMAb4D5_8 或 trastuzumab ( HHRCEiv['I N:S>
)，如美國專利第5，821，337號表3中所記載的，明確收入本文作為參考；人源化520C9 (W093/21319);及人源化2C4抗體，諸如pertuzamab，如本文所述。為了本發(fā)明的目的，“trastuzumab”、“ 丨 ILRCliPTlN ”和“huMAb4D5_8” 指包含分別在SEQ ID N0.15和16中示出的輕鏈和重鏈氨基酸序列的抗體。在本文中，“pertuzumab”和“0MNITARG ”指包含分別在SEQ ID N0.13和14中示出的輕鏈和重鏈氨基酸序列的抗體。trastuzumab與pertuzumab之間的功能差異不于圖6?！巴暾贵w”在本文中指包含兩個抗原結(jié)合區(qū)及Fe區(qū)的抗體。優(yōu)選的是，完整抗體具有功能性Fe區(qū)。“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。“天然抗體”指通常由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重⑶鏈構(gòu)成的約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個可變域(Vh)，接著是多個恒定域。每條輕鏈在一端具有一個可變域(')，而另一端是一個恒定域。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變域之間形成界面。術(shù)語“可變的”指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)的三個區(qū)段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR，它們大多采取β-折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán) 狀連接且在有些情況中形成β-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabat et al., Sequences of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, 1991)。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合,但展現(xiàn)出多種效應(yīng)物功能，諸如抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)中抗體的參與。術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時指抗體中負責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變域中的殘基24-34(Ll)、50-56 (L2)和 89-97 (L3)及重鏈可變域中的殘基 31-35 (Hl)、50-65 (H2)和 95-102 (H3)；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)和 / 或那些來自“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變域中的殘基26-32 (LI)、50-52(L2)和91-96 (L3)及重鏈可變域中的殘基 26-32 (HI)、53-55(H2)和 96_101(H3) ；Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.196:901-917(1987))?！翱蚣軈^(qū)”或“FR”殘基是除此處定義的高變區(qū)殘基外的那些可變域殘基。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有一個抗原結(jié)合位點，和一個剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F (ab’)2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點且仍能夠交聯(lián)抗原。“Fv”是包含完整抗原識別和抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。此區(qū)由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，各可變域的三個高變區(qū)相互作用而在Vh-' 二聚體表面上確定了一個抗原結(jié)合位點。六個高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變域(或只包含對抗原特異的三個高變區(qū)的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點。

Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl) jab’片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab’ -SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基的Fab’的稱謂。？(&13’)2抗體片段最初是作為在Fab’片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab’片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定域氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體的“輕鏈”可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(λ)。術(shù)語“Fe區(qū)”在本文中用于定義免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)，包括天然序列Fe區(qū)和變體Fe區(qū)。雖然免疫球蛋白重鏈Fe區(qū)的邊界可能變化，但是人IgG重鏈Fe區(qū)通常定義為從其Cys226或Pro230位置的氨基酸殘基至C末端的區(qū)段。Fe區(qū)的C末端賴氨酸(殘基447，根據(jù)EU編號系統(tǒng))可以消除，例如在生產(chǎn)或純化抗體的過程中，或者通過對編碼抗體重鏈的核酸進行重組工程。因此，完整抗體組合物可包括消除了所有K447殘基的抗體群體、沒有消除K447殘基的抗體群體、或者混合了有和沒有K447殘基的抗體的抗體群體。除非另有說明，本文中免疫球蛋白重鏈中殘基的編號是如Kabat etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed., Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 中(明確收入本文作為參考)的EU索引的編號?！叭鏚abat中的EU索引”指人IgGlEU抗體的殘基編號?！肮δ苄訤e區(qū)”擁有天然序列Fe區(qū)的“效應(yīng)器功能”。例示性的“效應(yīng)器功能”包括Clq結(jié)合、補體依賴性細胞毒性、Fe受體結(jié)合、抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調(diào)等。此類效應(yīng)器功能通常要求Fe區(qū)與結(jié)合域(例如抗體可變域)聯(lián)合，而且可使用多種測定法來評估，例如本文中所公開的?！疤烊恍蛄蠪e區(qū)”包含與自然界中找到的Fe區(qū)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fe區(qū)包括天然序列人IgGlFc區(qū)(非A和A同種異型)、天然序列人IgG2Fc區(qū)、天然序列人IgG3Fc區(qū)、及天然序列人IgG4Fc區(qū),及其天然存在變體。“變異Fe區(qū)”包含由于至少一處氨基酸修飾，優(yōu)選一處或多處氨基酸替代而與天然序列Fe區(qū)有所不同的氨基酸序列。優(yōu)選的是，變異Fe區(qū)具有與天然序列Fe區(qū)相比或與親本多肽的Fe區(qū)相比至少一處氨基酸替代，例如在天然序列Fe區(qū)中或在親本多肽的Fe區(qū)中具有約I處至約10處氨基酸替代，優(yōu)選約I處至約5處氨基酸替代。變異Fe區(qū)在本文中將優(yōu)選與天然序列Fe區(qū)和/或親本多肽的Fe區(qū)擁有至少約80%的同源性，更優(yōu)選至少約90%的同源性,最優(yōu)選至少約95%的同源性。根據(jù)其重鏈恒定域氨基酸序列，完整抗體可歸入不同的“類”。完整抗體有五大類:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為“亞類”(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的抗體對應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、δ、ε、γ和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。“抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性”和“ADCC”指由細胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達Fe受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結(jié)合的抗體，隨后引起靶細胞溶胞。介導(dǎo)ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達Fe Y RIII,而單核細胞表達 Fe Y R1、Fc Y RII 和 Fe Y RIII。Ravetch and Kinet, Annu.Rev.1mmunol.9:457-92(1991)第464頁表3總結(jié)了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利第5，500, 362或5，821，337號中所記載的?？捎糜诖祟悳y定法的效應(yīng)細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes etal., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)中所披露的?！叭诵?yīng)細胞”指表達一種或多種FcR并執(zhí)行效應(yīng)器功能的白細胞。優(yōu)選的是，該細胞至少表達Fe Y RIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細胞的例子包括外周血單個核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞，優(yōu)選PBMC和NK細胞。效應(yīng)細胞可以從其天然來源分離，例如血液或PBMC，如本文中所描述的。術(shù)語“Fe受體”或“FcR”用于描述結(jié)合抗體Fe區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR0此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR( Y受體)，包括Fe Y R1、Fc Y RII和Fe Y RIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。Fe Y RII受體包括Fe Y RIIA (“活化受體”)和Fe Y RIIB (“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。活化受體 Fe Y RIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體Fe Y RIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(Ι Μ)(參見綜述 Daeron, Annu.Rev.1mmunol.15:203-234 (1997))。FcR 的綜述參見 Ravetch andKinet, Annu.Rev.Tmmunol.9:457-492(1991);Capel et al., Immunomethods4:25-34(1994);de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126:330-41 (1995)。術(shù)語 “FcR” 在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未來將會鑒定的。該術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，它負責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer et al., J.1mmunol.117:587(1976) ; Kim et al., J.1mmunol.24:249 (1994)),并調(diào)控免疫球蛋白的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”指在存在補體時分子溶解靶物的能力。補體激活途徑是由補體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合與相關(guān)抗原復(fù)合的分子(例如抗體)起始的。為了評估補體激活，可進行⑶C測定法，例如如Gazzano-Santoro et al., J.1mmunol.Methods202:163 (1996)中所記載的?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的V1^P \結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，F(xiàn)v多肽在Vh和\結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pliickthun, in:The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore ed., Springer-Verlag, NewYork, pp.269-315 (1994)。HER2 抗體 scFv 片段記載于 W093/16185;美國專利第 5，571，894號；美國專利第5，587，458號。術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(Vh-Vl)中包含相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(')。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，從而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更完整的記載于例如EP404，097;W093/11161;HOllingeret al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)?！奥憧贵w(裸露的抗體)”指未偶聯(lián)異源分子，諸如細胞毒性模塊或放射性標(biāo)記物的抗體?！胺蛛x的”抗體指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白 質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(I)根據(jù)Lowry法的測定，抗體重量超過95%，最優(yōu)選重量超過99%，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染色，達到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備?！坝H和力成熟的”抗體指在其一個或多個高變區(qū)中具有一處或多處改變且導(dǎo)致抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾水平的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知流程來生成。Marks et al.，Bio/TechnologylO: 779-783 (1992)記載了通過 VH 和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和力成熟。以下文獻記載了⑶R和/或框架殘基的隨機誘變:Barbas etal.，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA91:3809-3813(1994);Schier et al.，Genel69:147-155 (1995);Yelton et al., J.1mmunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al.,J.Tmmunol.154 (7):3310-9(1995);Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226:889-896 (1992)。術(shù)語“主要種類抗體”在本文中指組合物中在數(shù)量上占主要的抗體分子/抗體結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中，主要種類抗體是HER2抗體，諸如結(jié)合HER2的結(jié)構(gòu)域II的抗體、比trastuzumab更有效的抑制HER 二聚化的抗體、和/或結(jié)合HER2的異二聚體結(jié)合位點的抗體。本文中主要種類抗體的優(yōu)選實施方案是包含SEQ ID N0.3和4中的輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列的抗體，最優(yōu)選包含SEQ ID N0.13和14中的輕鏈和重鏈氨基酸序列的抗體(pertuzumab)。“氨基酸序列變體”抗體在本文中指具有與主要種類抗體不同的氨基酸序列的抗體。通常，氨基酸序列變體將與主要種類抗體具有至少約70%的同源性，優(yōu)選的是，它們將與主要種類抗體至少約80%，更優(yōu)選至少約90%同源。氨基酸序列變體在主要種類抗體氨基酸序列內(nèi)部或鄰近的某些位置具有替代、刪除和/或添加。本文中氨基酸序列變體的例子包括酸性變體(例如脫酰胺抗體變體)、堿性變體、在其一條或兩條輕鏈上具有氨基末端前導(dǎo)延伸(例如VHS-)的抗體、在其一條或兩條重鏈上具有C-末端賴氨酸殘基的抗體等，包括重鏈和/或輕鏈氨基酸序列變異的組合。本文中特別感興趣的抗體變體是相對于主要種類抗體在其一條或兩條輕鏈上包含氨基末端前導(dǎo)延伸的抗體，任選還包含其它氨基酸序列和/或糖基化差異?！疤腔凅w”抗體在本文中指附著有一種或多種碳水化合物模塊且所述碳水化合物與附著于主要種類抗體的一種或多種碳水化合物模塊不同的抗體。本文中糖基化變體的例子包括其Fe區(qū)附著有Gl或G2寡糖結(jié)構(gòu)代替GO寡糖結(jié)構(gòu)的抗體、其一條或兩條輕鏈附著有一種或兩種碳水化合物模塊的抗體、其一條或兩條重鏈沒有附著碳水化合物的抗體等，及糖基化改變的組合。若抗體具有Fe區(qū)，則抗體的一條或兩條重鏈，例如殘基299處(298，Eu殘基編號)可附著有寡糖結(jié)構(gòu)。對于pertuzumab,GO是主要的寡糖結(jié)構(gòu),而在pertuzumab組合物中找到的其它寡糖結(jié)構(gòu)諸如GO-F、G-1、Man5、Man6、Gl-1、Gl (1-6)、Gl (1-3)和G2的量較少。除非另有說明，“61寡糖結(jié)構(gòu)”在本文中包括6-1、61-1、61(1_6)和Gl(l_3)結(jié)構(gòu)?！鞍被┒饲皩?dǎo)延伸”在本文中指在抗體的任何一條或多條重鏈或輕鏈的氨基末端存在的一個或多個氨基酸殘基的氨基 末端前導(dǎo)序列。例示性的氨基末端前導(dǎo)延伸包含三個氨基酸殘基，VHS或由其組成，它們存在于抗體變體的兩條輕鏈中的一條或兩條上?！懊擋０贰笨贵w指其中一個或多個天冬酰胺殘基衍生成例如天冬氨酸、琥珀酰亞胺或異天冬氨酸的抗體。術(shù)語“癌癥”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調(diào)控的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤(包括髓母細胞瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜細胞肉瘤)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(包括類癌瘤、胃泌素瘤和胰島細胞癌)、間皮瘤、施旺氏細胞瘤(包括聽神經(jīng)瘤)、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌包括小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌和肺的鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)包括胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer or hepatic carcinoma)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌)、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney orrenal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、食道癌、膽管腫瘤、及頭和頸癌?！巴砥凇?advanced)癌癥指通過局部侵入或轉(zhuǎn)移而擴散到最初的部位或器官之外
的癌癥。
“頑固性或不應(yīng)性”(refractory)癌癥指即使對患者施用抗腫瘤劑，諸如化療劑，仍然發(fā)生進展的癌癥。頑固性癌癥的一個例子是鉬不應(yīng)性癌癥?！皬?fù)發(fā)性”(recurrent)癌癥指在對初始治療的響應(yīng)之后，在初始部位或遠端部位再次生長的癌癥。在本文中，“患者”指人患者?；颊呖梢允恰鞍┌Y患者”，即患有或有風(fēng)險患上癌癥的一種或多種癥狀的患者?！澳[瘤樣品”在本文中指衍生自患者腫瘤或包含來自患者腫瘤的腫瘤細胞的樣品。腫瘤樣品的例子在本文中包括但不限于腫瘤活檢、循環(huán)中的腫瘤細胞、循環(huán)中的血漿蛋白質(zhì)、腹水、衍生自腫瘤或展現(xiàn)出腫瘤樣特性的原代細胞培養(yǎng)物或細胞系，以及保存的腫瘤樣品，諸如福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤樣品或冷凍的腫瘤樣品?！肮潭ǖ摹蹦[瘤樣品指已經(jīng)使用固定劑以組織學(xué)方法保存的腫瘤樣品。“福爾馬林固定的”腫瘤樣品指已經(jīng)使用甲醛作為固定劑保存的腫瘤樣品?！鞍竦摹蹦[瘤樣品指用堅固的且通常是硬的介質(zhì)諸如石蠟、蠟、火棉或樹脂包圍的腫瘤樣品。包埋使得有可能切出薄片供顯微鏡檢查或生成組織微陣列(TMA)?！笆灠竦摹蹦[瘤樣品指用衍生自石油的固體碳氫化合物的純化混合物包圍的腫瘤樣品。在本文中，“冷凍的”腫瘤樣品指冷凍的或冷凍過的腫瘤樣品。“展示出HER表達、擴增或活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測試中表達(包括過表達)HER受體，具有擴增的HER基因，和/或以其它方式展現(xiàn)出HER受體活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品?！罢故境鯤ER活化”的癌或生物學(xué)樣品指在診斷測`試中展現(xiàn)出HER受體活化或磷酸化的癌或生物學(xué)樣品。此類活化可直接(例如通過ELISA來測量HER磷酸化)或間接(例如通過基因表達概況分析或通過檢測HER異二聚體，如本文中所述)測定。在本文中，“基因表達概況分析”(gene expression profiling)指評估一種或多種基因的表達，代替直接測定HER磷酸化。“磷酸-ELISA測定法” (phosho-ELISA assay)在本文中指在酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)中評估一種或多種HER受體，尤其是HER2的磷酸化的測定法，其中使用檢測磷酸化的HER受體、底物或下游信號分子的試劑(通常是抗體)。優(yōu)選的是，使用檢測磷酸化HER2的抗體。該測定法可以對細胞溶胞物，優(yōu)選來自新鮮的或冷凍的生物學(xué)樣品的細胞溶胞物進行?！癏ER受體過表達或擴增”的癌細胞指與同一組織類型的非癌細胞相比，具有顯著更高水平的HER受體蛋白質(zhì)或基因的癌細胞。此類過表達可以是由基因擴增或者轉(zhuǎn)錄或翻譯增加引起的?？稍谠\斷或預(yù)后測定法中通過評估細胞表面上存在的HER蛋白質(zhì)水平的升高(例如通過免疫組化測定法；IHC)來測定HER受體的過表達或擴增?；蛘?另外，可測量細胞中編碼HER的核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(FISH;參見1998年10月公布的W098/45479)、Southern印跡或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，諸如定量實時PCR(qRT-PCR)。還可通過測量生物學(xué)流體諸如血清中的脫落抗原(例如HER胞外結(jié)構(gòu)域)來研究HER受體過表達或擴增(參見例如1990年6月12日公告的美國專利第4，933，294號；1991年4月18日公布的W091/05264;1995年3月28日公告的美國專利第5，401，638號;Sias et al.，J.Immunol.Methods 132:73-80 (1990))。在上述測定法之外，熟練從業(yè)人員還可利用多種體內(nèi)測定法。例如，可將患者體內(nèi)細胞暴露于任選用可檢測標(biāo)記物例如放射性同位素標(biāo)記的抗體，并且可評估該抗體與患者體內(nèi)細胞的結(jié)合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴露于所述抗體的患者的活檢。相反，“HER受體不過表達或擴增”的癌癥指與同一組織類型的非癌細胞相比，沒有高于正常水平的HER受體蛋白質(zhì)或基因的癌癥。抑制HER 二聚化的抗體，諸如pertuzumab，可用于治療不過表達或擴增HER2受體的癌癥。在本文中，“抗腫瘤劑”指用于治療癌癥的藥物。本文中的抗腫瘤劑的非限制性例子包括化療劑、HER 二聚化抑制劑、HER抗體、針對腫瘤相關(guān)抗原的抗體、抗激素化合物、細胞因子、EGFR靶向藥物、抗血管發(fā)生劑、酪氨酸激酶抑制劑、生長抑制劑和生長抑制性抗體、細胞毒劑、誘發(fā)凋亡的抗體、COX抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、結(jié)合癌胚蛋白CA125的抗體、HER2疫苗、Raf或ras抑制劑、多柔比星脂質(zhì)體、托泊替康、紫杉烷(taxane)、雙重酪氨酸激酶抑制劑、TLK286、EMD_7200、pertuzumab、trastuzumab、er1tinib^P bevacizumab?！耙雅鷾?zhǔn)的抗腫瘤劑”指已經(jīng)得到管理機構(gòu)諸如食品和藥品管理局(Food and DrugAdministration, FDA)或其相當(dāng)?shù)耐鈬鴻C構(gòu)的上市批準(zhǔn),用于治療癌癥的藥物。若HER 二聚化抑制劑作為“單一抗腫瘤劑”施用，則它是唯一施用來治療癌癥的抗腫瘤劑，即它不與另一抗腫瘤劑諸如化療聯(lián)合施用。“護理標(biāo)準(zhǔn)”(standard of care)在本文中意指常規(guī)用來治療特定形式的癌癥的一種或多種抗腫瘤劑。例如，對于鉬耐受性卵巢癌，護理標(biāo)準(zhǔn)是托泊替康或多柔比星脂質(zhì)體?！吧L抑制劑”在用于本文時指在體外或在體內(nèi)抑制細胞，尤其是表達HER的癌細胞生長的化合物或組合物。如此，生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的表達HER的細胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新喊(vincristine)和長春喊(vinblastine))、紫杉燒類(taxanes)、和拓撲異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進入S期停滯,例如DNA燒化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達卡巴嗪(dacarbazine)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、順鉬(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿卩密唆(5_f Iuorouracil)和ara_C。更多信息可參見TheMolecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel ed.，Chapterl, entitled“Cellcycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs”，Murakami et al., WBSaunders, Philadelphia, 1995,尤其是第 13 頁。 “生長抑制性”抗體的例子是那些結(jié)合HER2并抑制過表達HER2的癌細胞生長的抗體。優(yōu)選的生長抑制性HER2抗體在約0.5-30 μ g/ml的抗體濃度對細胞培養(yǎng)物中SK-BR-3乳瘤細胞的生長抑制超過20%，優(yōu)選超過50% (例如約50%至約100%)，其中生長抑制是在SK-BR-3細胞暴露于抗體后6天測定的(參見1997年10月14日公告的美國專利第5，677，171號)。該專利及下文中更詳細的描述了 SK-BR-3細胞生長抑制測定法。優(yōu)選的生長抑制性抗體是鼠單克隆抗體4D5的人源化變體,例如trastuzumab。
“誘導(dǎo)凋亡”的抗體指根據(jù)膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細胞破裂、和/或膜囊(稱作凋亡小體)形成的測定，誘導(dǎo)程序性細胞死亡的抗體。所述細胞通常是過表達HER2受體的細胞。優(yōu)選的是，所述細胞是腫瘤細胞，例如乳房、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰或膀胱細胞。在體外，所述細胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu3細胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SK0V3細胞。有多種方法可用于評估與凋亡有關(guān)的細胞事件。例如，可通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合來測量磷脂酰絲氨酸(PS)易位；可通過DNA梯化(laddering)來評估DNA斷裂；及可通過亞二倍體細胞的任何增加來評估伴隨著DNA斷裂的核/染色質(zhì)濃縮。優(yōu)選的是，誘導(dǎo)凋亡的抗體是在使用BT474細胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合測定法(見下文)中導(dǎo)致對膜聯(lián)蛋白的結(jié)合相對于未處理細胞誘導(dǎo)約2至50倍，優(yōu)選約5至50倍，最優(yōu)選約10至50倍的抗體。誘導(dǎo)凋亡的HER2抗體的例子有7C2和7F3?！氨砦?C4”指HER2的胞外結(jié)構(gòu)域中抗體2C4所結(jié)合的區(qū)域。為了篩選結(jié)合2C4表位的抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷測定法，諸如Antibodies, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988 中所記載的。優(yōu)選的是,抗體將2C4對HER2的結(jié)合阻斷約50%或更多?；蛘撸蛇M行表位作圖以評估抗體是否結(jié)合HER2的2C4表位。表位2C4包含來自HER2胞外結(jié)構(gòu)域中結(jié)構(gòu)域II的殘基。2C4和pertuzumab在結(jié)構(gòu)域1、II和III 的連接處結(jié)合HER2的胞外結(jié)構(gòu)域。Franklin et al., CancerCell5:317-328(2004)。“表位 4D5”指 HER2 的胞外結(jié)構(gòu)域中抗體 4D5 (ATCC CRL10463)和 trastuzumab 所結(jié)合的區(qū)域。此表位接近HER2的跨膜結(jié)構(gòu)域，且在HER2的結(jié)構(gòu)域IV內(nèi)。為了篩選結(jié)合4D5表位的抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷測定法，諸如Antibodies, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988 中所記載的?；蛘?，可進行表位作圖以評估抗體是否結(jié)合HER2的4D5表位(例如HER2ECD的大約第529位殘基至大約第625位殘基區(qū)域(含兩端點)內(nèi)的任何一個或多個殘基,殘基編號包括信號肽)。“表位7C2/7F3”指HER2的胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域I內(nèi)N末端處7C2和/或7F3抗體(各自保藏于ATCC，見下文)所結(jié)合的區(qū)域。為了篩選結(jié)合7C2/7F3表位的抗體，可進行常規(guī)的交叉阻斷測定法，諸如 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988中所記載的?；蛘?，可進行表位作圖以確定抗體是否結(jié)合HER2上的7C2/7F3表位(例如HER2E⑶的大約第22位殘基至大約第53位殘基區(qū)域內(nèi)的任何一個或多個殘基，殘基編號包括信號肽)?！疤幚怼焙汀爸委煛?treatment)指治療性處置和預(yù)防性或防范性措施二者。需要治療的受試者包括那些早就患有癌癥的以及那些要預(yù)防癌癥的。因此，本文中待治療的患者可能已經(jīng)診斷為患有癌癥或者可能有患上癌癥的傾向性或易感性。術(shù)語“有效量”指在患者中有效治療癌癥的藥物量。有效量的藥物可減少癌細胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度的減緩和優(yōu)選阻止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即一定程度的減緩和優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度的抑制腫瘤生長；和/或一定程度的減輕一種或多種與癌癥有關(guān)的癥狀。根據(jù)藥物可阻止現(xiàn)有癌細胞生長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞的程度，它可以是抑制細胞的和/或毒害細胞的(細胞毒性的)。有效量可延長無進展存活(例如根據(jù)實體瘤的響應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)(Response Evaluation Criteria for SolidTumors, RECIST)或CA-125變化的測量)，導(dǎo)致客觀響應(yīng)(包括部分響應(yīng)，PR或完全響應(yīng)，CR)，增加總體存活時間，和/或改善癌癥的一種或多種癥狀(例如根據(jù)FOSI的評估)。術(shù)語“細胞毒劑”在用于本文時指抑制或阻止細胞的功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體?！盎焺敝缚捎糜谥委煱┌Y的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylating agents)，諸如塞替派(thiotepa)和 CYTOXAN 環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);橫酸焼基酯類(alkyl sulfonates)，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙卩定類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylameIamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethyIenethiophosphoramide)和三輕甲蜜胺(trimethylolomelamine) ；TLK286 (TELCYTA );番蒸枝內(nèi)酯類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bulIatacin)和布拉他辛酮(bulIatacinone) ) ； δ -9-四氫大麻酹(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酌.(dronabinol)，MAMNOL⑩);β -拉帕醌(Iapachone);拉帕醇(Iapachol);秋水仙素類(colchicines);白禪脂酸(betulinicacid);喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物托泊替康(topotecan) ( HYCAMTIN
)、CPT-1l (伊立替康(irinotecan)，C.:_7\ M PTUSAR^ )、乙酰喜樹堿、東莨菪亭(scopoletin)和 9_ 氨基喜樹減)；苔蘚抑素(bryostatin) ；callystatin ；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinic acid);替尼泊苷(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素I和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾植塞洛素(eleutherobin) ；pancratistatin ；sarcodictyin ;海綿抑素(spongistatin);氮芥類(nitrogen mustards )，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾酉享(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲憐胺(trofosfamide)、尿啼唳氮芥(uracil mustard)；亞硝脲類(nitrosoureas)，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(1mustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine) ;二膦酸鹽類(bisphosphonates)，諸如氯膦酸鹽(clodronate);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素 YlI 和加利車霉素 ω (參見例如 Agnew，Chem.1ntl.Ed.Engl.33:183-186(1994))和蒽環(huán)類抗生素(anthracyclines)諸如 annamycin、AD32、alcarubicin、柔紅霉素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、DX-52-1、表柔比星(epirubicin)、GPX-100Λ伊達 t匕星(idarubicin)、KRN5500、美諾立爾(menogaril)、dynemicin 包括 dynemicinA、埃斯波霉素(esperamicin)、新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素 D (dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRiAMYCIN.私多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、多柔比星脂質(zhì)體和脫氧多柔比星)、依索比星(esorubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素 C、霉酌.酸(mycophenolic acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、P票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin);葉 酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate) ; 票呤類似物，諸如氟達拉濱(f Iudarabine)、6_巰基票呤(mercaptopurine)、硫咪票呤(thiamiprine)和硫鳥 P票呤(thioguanine)；啼 P定類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6_ 氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)和氟尿苷(f1xuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)和睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(tri1stane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinicacid) (Ieucovorin);醋葡醒內(nèi)酯(aceglatone);抗葉酸抗瘤劑，諸如AL1MTA 、LY231514培美曲塞(pemetrexed)、二氫葉酸還原酶抑制劑諸如甲氨噪呤(methotrexate)、抗代謝物類，諸如5_氟尿啼卩定(fIuorouracil)(5-FU)及其前藥諸如UFT、S-1和卡培他濱(capecitabine)，及胸苷酸合酶抑制劑和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑諸如雷替曲塞(raltitrexed) (TOMUDEX ，TDX)；二氫啼唳脫氫酶抑制劑諸如恩尿啼唳(eniluracil);醒磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid);安口丫唳(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);地憐酸胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地口丫酉昆(diaziquone) ；elfornithine ;依禾1|醋韋安(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；輕脲(hydroxyurea)；香燕多糖(Ientinan);氯尼達明(1nidamine);美登木素生物堿類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidamol) ； 二胺硝口丫 P定(nitracrine)；噴司他丁 (pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet)；卩比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(1soxantrone) ;2_ 乙基酉先餅(ethylhydrazide);丙卡巴餅(procarbazine) ;PSK 多糖復(fù)合物(JHS Natural Products, Eugene, OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran);螺旋錯(spirogermanium);細交鏈抱菌酮酸(tenuazonic acid);三亞胺醌(triaziquone) ;2，2’，2’’ -三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、撫孢菌素(verrucarin)A、桿孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine) ( LiLDiSiN1-K，]-1LDLS! );達卡巴嚷(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine) ;二漠甘露酉享(mitobronitol) ;二漠衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴燒(pipobroman) ；gacytosine ;阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara_C”)；環(huán)憐酸胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);類紫杉醇類(taxoids)和紫杉燒類(taxanes),例如Ji,紫杉醇(paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb
Oncology, Princeton, N.J.) 、ABRAXANE 不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的納米顆粒劑型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)和TAXOTERE 多西他塞(docetaxel) ( Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine) ( GEMZAR ) ;6_ 硫鳥嘌呤(thioguanine);巰基嘌呤(mercaptopurine)；鉬(platinum);鉬類似物或基于鉬的類似物，諸如順鉬(cisplatin)、奧沙利鉬(oxaliplatin)和卡鉬(carboplatin)；長春堿(vinblastine) ( VELBAN⑩);依托泊苷(etoposide) (VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽酉昆(mitoxantrone);長春新堿(vincristine) ( ONCOVIN );長春花生物喊類(vinca alkaloid);長春瑞濱(vinorelbine) ( NAVhLBiNh'!^
);能滅瘤(novantrone);依達曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希羅達(xeloda);伊本膦酸鹽(ibandronate);拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS2000 ;二氟甲基鳥氨酸(DMFO);類視黃酸(retinoid),諸如視黃酸(retinoic acid)；任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP (環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX (奧沙利鉬(EL0XATIN )聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。該定義還包括作用為調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括N O LVA D EX K' 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4_ 輕基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FAR.tS ['ON.&托瑞米芬(toremifene);抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGACE 醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROM AS IN 依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR 伏氯唑(vorozole)、FEMARA⑩來曲唑(Ietrozole)和 ARIMIDEX 阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素類，諸如氟他米特(fIutamide)、尼魯米特(niIutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(Ieuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他濱(troxacitabine) (I, 3_ 二氧戍環(huán)核苷胞喃唳類似物);反義寡核苷酸,特別是那些抑制涉及粘附細胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達的，諸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、LEUVECTIN 疫苗和VAX1D+ 疫苗；PROLEUKIN rlL-2 ; LURTOTECAN 拓撲異構(gòu)酶I抑制齊 ; ABARELIXS' rmRH ;及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。
“抗代謝物類化療劑”指在結(jié)構(gòu)上與代謝物相似但不能被身體以生產(chǎn)性方式利用的藥劑。許多抗代謝物類化療劑干擾核酸，RNA和DNA的生成?？勾x物類化療劑的例子包括吉西他濱(gemcitabine) ( G RMZAR )、5_氟尿喃唳(5-FU)、卡培他濱(capecitabine) (XEL0DA )、6_ 疏基嘌呤、甲氨喋呤(methotrexate)、6_ 硫鳥嘌呤、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、阿糖胞苷(arabinosylcytosine ARA-Ccytarabine) (CYTOSAR-U )、達卡巴嗪(dacarbazine) ( DTIC-DOME )、偶氮胞啼P定(azocytosine)、脫氧胞卩密唳(deoxycytosine)、pyridmidene、氟達拉濱(fIudarabine)
(FLUDARA⑩)、克拉屈濱(Cladrabine)、2_脫氧-D-葡萄糖等。優(yōu)選的抗代謝物類化療劑是吉西他濱?！凹魉麨I”或“2’ -脫氧-2’，2’ - 二氟胞苷單鹽酸(b-異構(gòu)體)”是展現(xiàn)出抗腫瘤活性的核苷類似物。鹽酸吉西他濱的經(jīng)驗式是C9H11F2N304.HC1。鹽酸吉西他濱由EliLilly以商標(biāo)GEMZAR.銷售?！盎阢f的化療劑”包括包含鉬作為分子的主要部分的有機化合物?；阢f的化療劑的例子包括卡鉬(carboplatin)、順鉬(cisplatin)和奧沙利鉬(oxaliplatinum)。“基于鉬的化療法”指使用一種或多種基于鉬的化療劑的療法，任選聯(lián)合一種或多種其它化療劑?！盎煼褪苄浴卑┌Y指癌癥患者在接受化療方案時(癌癥)有進展(即患者是“化療不應(yīng)性”的)，或者患者在完成化療方案后12個月內(nèi)(例如6個月內(nèi))(癌癥)有進展?！般f耐受性”癌癥指癌癥患者在接受基于鉬的化療法時(癌癥)有進展(即患者是“鉬不應(yīng)性”的)，或者患者在完成基于鉬的化療方案后12個月內(nèi)(例如6個月內(nèi))(癌癥)有進展?！翱寡馨l(fā)生劑”指阻斷或一定程度的干擾血管發(fā)育的化合物?？寡馨l(fā)生因子可以是例如結(jié)合涉及促進血管發(fā)生的生長因子或生長因子受體的小分子或抗體。在本文中優(yōu)選的抗血管發(fā)生因子是結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的抗體，諸如bevacizumab(AVAST1N )。術(shù)語“細胞因子”是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質(zhì)作用于另一細胞的蛋白質(zhì)的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子包括生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長因子，諸如NGF-β ;血小板衍生生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β ;胰島素樣生長因子-1和-1I ;紅細胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factor);干擾素,諸如干擾素-α、_β和-Y ;集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞 CSF(GM-CSF)和粒細胞 CSF(G-CSF);白介素(IL)，諸如 IL_1、IL_1 a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 ;腫瘤壞死因子，諸如 TNF-α 或 TNF-β ；及其它多肽因子，包括LIF 和kit配體(KL)。在用于本文時，術(shù)語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)及天然序列細胞因子的生物學(xué)活性等效物。在用于本文時，術(shù)語“ EGFR靶向藥物”指結(jié)合EGFR并任選抑制EGFR活化的治療劑。此類藥劑的例子包括結(jié)合EGFR的抗體和小分子。結(jié)合EGFR的抗體的例子包括 MAb579(ATCC CRL HB8506)、MAb455 (ATCC CRLHB8507)、MAb225 (ATCC CRL8508)、MAb528 (ATCC CRL8509)(參見美國專利第 4，943，533 號，Mendelsohn et al.)及其
變體，諸如嵌合化 225 (C225 或 Cetuximab; ERBUTIX )和重構(gòu)人 225 (H225)(參見 W096/40210, Imclone Systems Inc.) ；IMC-11F8, 一種完全人的 EGFR 靶向抗體(Imclone);結(jié)合II型突變體EGFR的抗體(美國專利第5，212，290號)；結(jié)合EGFR的人源化和嵌合抗體，如美國專利第5，891，996號中所記載的；及結(jié)合EGFR的人抗體，諸如 ABX-EGF (參見 W098/50433, Abgenix) ；EMD55900(Stragliotto et al., Eur.J.Cancer32A: 636-640 (1996)) ；EMD7200 (matuzumab)，一種針對 EGFR 的人源化 EGFR 抗體，其與 EGF 和 TGF-α 二者競爭 EGFR 結(jié)合；&mAb806 或人源化 mAb806 (Johns et al., J.Biol.Chem.279 (29): 30375-30384 (2004))?？笶GFR抗體可偶聯(lián)細胞毒劑，如此產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物(參見例如EP659, 439A2，Merck Patent GmbH)。結(jié)合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或 Gefitinib(IRESSA ;Astra Zeneca) ；CP-358774 或 Erlotinib(TARCEVA ;Genentech/OSI) JPAG1478、AG1571(SU5271; Sugen) ;EMD_7200。“酪氨酸激酶抑制劑”指抑制酪氨酸激酶諸如HER受體的酪氨酸激酶活性的分子。此類抑制劑的例子包括上一段中提到的EGFR靶向藥物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制劑，諸如可從Takeda購買的TAK165 ;CP_724，714，一種口服的ErbB2受體酪氨酸激酶選擇性抑制劑(Pfizer和0SI);優(yōu)先結(jié)合EGFR但抑制HER2和EGFR 二者過表達細胞的雙重HER抑制劑，諸如EKB-569 (可從Wyeth購買)；GW572016 (可從Glaxo購買)，一種口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制劑;PKI_166 (可從Novartis購買);泛(pan)HER抑制劑，諸如 canertinib (C1-1033;Pharmacia) ；Raf-1 抑制劑，諸如可從 ISIS Pharmaceuticals購買、抑制Raf-1信號傳導(dǎo)的反義劑ISIS-5132 ;非HER靶向TK抑制劑，諸如可從Glaxo購買的Imatinib mesylate ·(GLEEVAC ) ；MAPK胞外調(diào)控激酶I抑制劑C1-1040 (可從Pharmacia購買)；喹唑啉類，諸如HH53035，4_(3_氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶類；嘧啶并嘧啶類；吡咯并嘧啶類，諸如CGP59326、CGP60261和CGP62706 ；吡唑并嘧啶類，4-(苯氨基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶；姜黃素(二阿魏酰甲烷，4，5-雙(4-氟苯胺基)-酞亞胺)；含硝基噻吩模塊的tyrphostines ；PD~0183805 (Warner-Lambert);反義分子(例如那些結(jié)合HER編碼核酸的)；喹喔啉類(美國專利第5，804，396號)；tryph0stins (美國專利第 5, 804, 396 號)；ZD6474 (Astra Zeneca) ；PTK-787 (Novartis/Schering AG)；泛 HER 抑制劑，諸如 C1-1033 (Pfizer) ；Affinitac(ISIS3521;Isis/Lilly) ；Imatinibmesylate (Gleevac;Novartis) ；PKI166(Novartis) ；GW2016(Glaxo SmithKline)；C1-1033 (Pfizer) ；EKB-569 (Wyeth) ;Semaxinib(Sugen) ；ZD6474 (AstraZeneca)；PTK-787 (Novartis/Schering AG) ；INC-1C11 (Imclone);或任何以下專利出版物中所記載的:美國專利第 5, 804, 396 號;W099/09016 (American Cyanimid) ;W098/43960 (AmericanCyanamid) ;W097/38983 (Warner Lambert) ;W099/06378 (WarnerLambert);W099/06396(Warner Lambert);W096/30347(Pfizer, Inc.);W096/33978(Zeneca);W096/3397(Zeneca);W096/33980(Zeneca)。
本文中，化療劑的“固定的”(fixed)或“平坦的”(flat)劑量指不考慮患者的體重(WT)和體表面積(BSA)而施用于人類患者的劑量。因此，固定的或平坦的劑量不是作為mg/kg劑量或mg/m2劑量提供的，而是作為治療劑的絕對量提供的?！凹虞d”(1ding)劑量在本文中一般包括施用于患者的治療劑的初始劑量，后續(xù)其一個或多個維持劑量。一般而言，施用單個加載劑量，但本文中也設(shè)想了多個加載劑量。通常，所施用的記載劑量的量超過所施用的維持劑量的量，和/或記載劑量的施用比維持劑量更頻繁，從而比使用維持劑量更早達到化療劑的期望穩(wěn)態(tài)濃度。“維持” (maintenance)劑量在本文中指在治療期間施用于患者的一個或多個劑量的治療劑。通常，維持劑量以一定的治療間隔施用，例如大約每周一次，大約每兩周一次，大約每三周一次，或大約每四周一次。I1.抗體的生產(chǎn)由于在優(yōu)選的實施方案中，HER 二聚化抑制劑是抗體，下文描述了用于生成依照本發(fā)明使用的HER抗體的例示性技術(shù)。用于生成抗體的HER抗原可以是例如可溶形式的HER受體胞外結(jié)構(gòu)域或其包含期望表位的部分?；蛘?，在其細胞表面表達HER的細胞(例如經(jīng)轉(zhuǎn)化而過表達HER2的NIH-3T3細胞；或癌細胞系，諸如SK-BR-3細胞，參見Stancovski etal.，PNAS(USA)88:8691-8695(1991))可用于生成抗體?？捎糜谏煽贵w的其它形式HER受體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。(i)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過在動物中多次皮下(SC)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來生成。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲?；腔牾啺孵?通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基·琥·珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N=C=NR(其中R和Rl是不同的烴基)，將相關(guān)抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的，例如匙孔蟲戚血藍蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過將例如100 μ g或5 μ g蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內(nèi)注射于多個部位，將動物針對抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進行免疫。一個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量1/5-1/10的肽或偶聯(lián)物對動物進行加強免疫。7-14天后，采集動物的血液，并測定血清的抗體滴度。對動物進行加強免疫，直到滴度達到平臺(plateau)。優(yōu)選的是，將動物用相同抗原但與不同蛋白質(zhì)和/或通過不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進行加強免疫。偶聯(lián)物還可在重組細胞培養(yǎng)中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來增強免疫應(yīng)答。(ii)單克隆抗體本領(lǐng)域有多種方法可用于制備本文中的單克隆抗體。例如，單克隆抗體可使用最初由Kohler et al.，Nature256:495 (1975)記載的雜交瘤方法、通過重組DNA方法(美國專利第4，816，567號)來制備。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，諸如倉鼠，以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding, Monoclonal Antibodies !Principles andPractice, pp.59-103，Academic Press,1986)。
將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細胞生長。優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細胞穩(wěn)定的高水平生成抗體、并對諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的。在這些細胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細胞分配中心(Salk Institute Cell DistributionCenter, San Diego, California, USA)獲得的 M0PC-21 和 MPC-1l 小鼠腫瘤及可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細胞衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系用于生成人單克隆抗體也已有記載(Kozbor, J.1mmunol.133:3001(1984) ; Brodeur etal., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51—63，MarcelDekkerj Inc.，New York, 1987)。可對雜交瘤細胞正在其中生長的培養(yǎng)基測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如Munson et al., Anal.Biochem.107:220 (1980)的 Scatchard 分析來測定。在鑒定得到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，所述克隆可通過有限稀釋流程進行亞克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法進行培養(yǎng)(Goding，MonoclonalAntibodies !Princi ples and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPM1-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水瘤進行體內(nèi)培養(yǎng)?？赏ㄟ^常規(guī)抗體純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分開。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)流程分離和測序(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤細胞作為此類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉(zhuǎn)染到不另外生成抗體蛋白質(zhì)的宿主細胞中，諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述性論文包括 Skerra et al., Curr.0pinion in Immunol.5:256-262 (1993)及Pliickthun, Tmmunol.Revs.130:151-188 (1992)。在另一個實施方案中，可從使用McCafferty et al.，Nature348:552-554 (1990)所記載的技術(shù)構(gòu)建的曬菌體抗體庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson etal., Nature352:624-628 (1991)及 Marks et al.，J.Mol.Biol.222:581-597 (1991)分別記載了使用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物記載了通過鏈改組(Marks et al., Bio/TechnologylO: 779-783 (1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse et al., Nuc.Acids Res.21:2265-2266 (1993)),生成高親和力(nM 范圍)的人抗體。如此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。還可以修飾DNA，例如通過替代即用人重鏈和輕鏈恒定域的編碼序列代替同源鼠序列(美國專利第 4，816, 567 號;Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:6851 (1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價接合。典型的是，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定域，或者用它們替代抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變域，以產(chǎn)生嵌合二價抗體，它包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結(jié)合位點和對不同抗原具有特異性的另一個抗原結(jié)合位點。(iii)人源化抗體本領(lǐng)域已經(jīng)記載了用于將非人抗體人源化的方法。優(yōu)選的是，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們典型的取自“輸入”可變域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法進行(Jones etal., Nature321:522-525(1986);Riechmann et al., Nature332:323-327(1988);Verhoeyen et al.，Science 239:1534-1536 (1988)),通過用高變區(qū)序列替代相應(yīng)的人抗體序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利第4，816，567號)，其中本質(zhì)上少于整個人可變域用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實踐中，人源化抗體典型的是其中一些高變區(qū)殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。用于構(gòu)建人源化抗體的人可變域的選擇，包括輕鏈和重鏈二者，對于降低抗原性非常重要。依照所謂的“最適”(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變域序列對已知的人可變域序列的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR) (Sims et al., J.1mmunol.151:2296 (1993) ; Chothia et al., J.Mol.Biol.196:901 (1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:4285 (1992);Presta et al. , J.Tmmunol.151:2623(1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學(xué)特性。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是公眾可獲得的，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得期望抗體特征，諸如對靶抗原的親和力提高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實質(zhì)的涉及對抗原結(jié)合的影響。W001/00245記載了結(jié)合HER2并阻斷配體對HER受體之活化的例示性人源化HER2抗體的生成。本文中特別感興趣的人源化抗體基本上像鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效的阻斷EGF、TGF- α和/或HRG介導(dǎo)的MAPK激活，和/或基本上像鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效的結(jié)合HER2。本文中的人源化抗體可例如包含摻入人重鏈可變域的非人高變區(qū)殘基，而且還可在選自69Η、71Η和73Η的位置包含框架區(qū)(FR)替代，采用的是 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 中列出的可變域編號系統(tǒng)。在一個實施方案中，人源化抗體在69H、71H和73H的兩個或所有位置包含F(xiàn)R替代。本文中感興趣的例示性人源化抗體包含重鏈可變域互補決定殘基GFTFTDYTMX，其中 X 優(yōu)選是 D 或 S (SEQ ID N0:7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO:8);和 / 或 NLGPSFYFDY(SEQ ID NO:9)，任選包含那些⑶R殘基的氨基酸修飾，例如其中修飾基本上保持或改善抗體的親和力。例如，目的抗體變體可在上述重鏈可變域CDR序列中具有約I處至約7處或者約5處氨基酸替代。此類抗體變體可通過親和力成熟來制備，例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQ ID NO:4中的重鏈可變域氨基酸序列。例如，在前一段中的那些重鏈可變域⑶R殘基之外，人源化抗體還可包含輕鏈可變域互補決定殘基KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 10) JASYX1X2X3,其中X1優(yōu)選是R或L，X2優(yōu)選是 Y 或 E，而 X3 優(yōu)選是 T 或 S (SEQ ID NO: 11);和 / 或 QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12)。此類人源化抗體任選包含上述CDR殘基的氨基酸修飾，例如其中修飾基本上保持或改善抗體的親和力。例如，目的抗體變體可在上述輕鏈可變域CDR序列中具有約I處至約7處或者約5處氨基酸替代。此類抗體變體可通過親和力成熟來制備，例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQ ID NO:3中的輕鏈可變域氨基酸序列。本申請還設(shè)想了親和力成熟的抗體，它結(jié)合HER2并阻斷配體對HER受體之活化。親本抗體可以是人抗體或人源化抗體，例如所含輕鏈可變域和/或重鏈可變域序列分別為SEQ ID NO:3和4(即包含pertuzumab的VL和/或VH)的抗體。親和力成熟的抗體優(yōu)選以優(yōu)于鼠2C4或pertuzumab的親和力結(jié)合HER2受體(例如根據(jù)使用HER2胞外結(jié)構(gòu)域(E⑶)ELISA的評估，例如親和力提高約2倍或約4倍至約100倍或約1000倍)。例示性的用于替代的重鏈可變域⑶R殘基包括H28、H30、H34、H35、H64、H96、H99，或者兩個或多個的組合(例如這些殘基中的2個、3個 、4個、5個、6個或7個)。用于改變的輕鏈可變域⑶R殘基的例子包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97，或者兩個或多個的組合(例如這些殘基中的2個至3個、4個、5個或直到約10個)。設(shè)想了各種形式的人源化抗體或親和力成熟的抗體。例如，人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是抗體片段，諸如Fab，它任選與一種或多種細胞毒劑偶聯(lián)以產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物?；蛘撸嗽椿贵w或親和力成熟的抗體可以是完整抗體，諸如完整的IgGl抗體。優(yōu)選的完整IgGl抗體包含SEQ ID NO: 13中的輕鏈序列和SEQ ID NO: 14中的重鏈序列。(iv)人抗體作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫時生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊時生成人抗體。參見例如Jakobovits et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:2551 (1993);Jakobovits et al., Nature362:255-258 (1993);Bruggermann etal., Year in Immun0.7:33 (1993);及美國專利第 5，591，669 號、第 5，589，369 號和第5，545，807 號?；蛘?，噬菌體展示技術(shù)(McCaffertyet al.，Nature348:552-553 (1990))可用于在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)域基因全集生成人抗體和抗體片段。依照這種技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因以符合讀碼框的方式克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進行；有關(guān)綜述參見例如Johnson, Kevin S.and Chiswell, David J., CurrentOpinion in Structural Biology3:564-571 (1993)。V基因區(qū)段的數(shù)種來源可用于卩遼菌體展示。Clackson et al., Nature352:624-628 (1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫中分離得到大量不同的抗口惡唑酮抗體?？杀举|(zhì)上遵循Marks et al.，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或 Griffith et al., EMBO J.12:725-734(1993)所記載的技術(shù)，由未免疫人供體構(gòu)建V基因全集和分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利第5，565，332號和第5，573，905號。如上所述，還可通過體外激活B細胞來生成人抗體(參見美國專利第5，567，610號和第5，229，275號)。1998年6月30日公告的美國專利第5，772，997號和1997年I月3日公布的W097/00271中記載了人HER2抗體。(V)抗體片段已經(jīng)開發(fā)了用于生成包含一個或多個抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimoto etal., Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117(1992);Brennan etal.，SCienCe229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體庫中分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab’-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成 F (ab’)2 片段(Carter et al.，Bio/TechnologylO: 163-167 (1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物分離F(ab’)2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見W093/16185;美國專利第5，571，894號;美國專利第5，587，458號?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如如美國專利第5，641，870號中所記載的。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體指具有對至少兩種不同表位的結(jié)合特異性的抗體。例示性的雙特異性抗體可結(jié)合HER2蛋白質(zhì)的兩種不同表位。其它此類抗體可將HER2結(jié)合位點與EGFR、HER3和/或HER4的結(jié)合位點組合在一起。或者，可將HER2臂與結(jié)合白細胞上觸發(fā)分子諸如T細胞受體分子(例如 CD2 或CD3)或 IgG 的 Fe 受體(Fe y R)，諸如 Fe y RI (CD64)、Fe Y RII (CD32)和Fe Y RIII (⑶16)的臂組合在一起，使得細胞防御機制聚焦于表達HER2的細胞。雙特異性抗體還可用于將細胞毒劑定位于表達HER2的細胞。這些抗體擁有HER2結(jié)合臂和結(jié)合細胞毒劑(例如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-α、長春花生物堿類、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨喋呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。W096/16 673記載了一種雙特異性HER2/Fc y RIII抗體，美國專利第5，837，234號披露了一種雙特異性HER2/FC Y RI抗體IDMl (Osidem)。W098/02463顯示了一種雙特異性HER2/Fc α抗體。美國專利第5，821，337號教授了一種雙特異性HER2/CD3抗體。MDX-210是一種雙特異性HER2/FC YRIII抗體。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生成基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein etal.，Nature305:537-539 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物,其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。W093/08829 及 Traunecker et al., EMBO J.10:3655-3659(1991)中披露了類似的流程。依照一種不同的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。融合優(yōu)選使用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域。優(yōu)選的是，在至少一種融合物中，第一重鏈恒定區(qū)(CHl)包含輕鏈結(jié)合所必需的位點。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和(如果需要)免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產(chǎn)量的實施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達導(dǎo)致高產(chǎn)量時或在該比率沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一個表達載體。在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了分離的便利途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于W094/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進一步詳情參見例如Suresh etal., Methods in Enzymologyl21:210(1986)。依照美國專利第5，731，168號中記載的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，以將從重組細胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的 百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分抗體恒定域的Ch3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子的界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生針對大側(cè)鏈的相同或相似大小的補償性“空腔”。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機制。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或“異源偶聯(lián)的”抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體建議用于將免疫系統(tǒng)細胞靶向不想要的細胞(美國專利第4，676，980號)，及用于治療HIV感染(W091/00360、W092/200373和EP03089)?？墒褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法來制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，并且連同許多交聯(lián)技術(shù)一起披露于美國專利第4，676，980號。文獻中還記載了自抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brennan et al.，Science229:81 (1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab’ )2片段的流程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形 成。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TNB)衍生物。然后將Fab’-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab’ -硫醇，并與等摩爾量的另一 種Fab’ -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進展便于從大腸桿菌中直接回收Fab’ -SH片段，這些片段可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby et al., J.Exp.Med.175:217-225(1992)記載了生成完全人源化的雙特異性抗體F(ab’)2分子。每個Fab’片段由大腸桿菌分開分泌，并在體外進行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達HER2受體的細胞和正常人T細胞，以及觸發(fā)人細胞毒性淋巴細胞針對人乳瘤靶物的溶胞活性。還記載了從重組細胞培養(yǎng)物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈來生成雙特異性抗體。Kostelny et al.，J.1mmunol.148 (5): 1547-1553 (1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab’部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原而形成單體，然后重新氧化而形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:6444-6448 (1993)記載的“雙抗體”技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(')，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的Vh和\結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的互補'和Vh結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。還報道了通過使用單鏈Fv (sFv) 二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber et al.，J.1mmunol.152:5368(1994)。設(shè)想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt et al.，J.1mmunol.147:60(1991)。(vii)其它氨基酸序列修飾設(shè)想了本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。通過將適宜的核苷酸變化引入抗體核酸或者通過肽合成來制備抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代。只要最終的構(gòu)建物具有期望的特性，可進行刪除、插入和替代的任意組合以獲得最終的構(gòu)建物。氨基酸變化還可改變抗體的翻 譯后加工，諸如改變糖基化位點的數(shù)目或位置?？捎糜阼b定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的一種方法稱作“丙氨酸掃描誘變”，如 Cunningham and Wells, Science244:1081-1085 (1989)所記載的。這里，鑒定了一個殘基或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)，并用中性或帶負電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c引入更多或其它變體，推敲那些對替代展現(xiàn)出功能敏感性的氨基酸位置。如此，雖然引入氨基酸序列變異的位點是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。例如，為了分析在給定位點處的突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進行丙氨酸掃描誘變或隨機誘變，并對所表達的抗體變體篩選期望活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長度范圍從一個殘基至包含上百個或更多殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括在抗體的N-或C-末端融合酶(例如用于ADEPT)或提高抗體血清半衰期的多肽。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個氨基酸殘基用不同殘基替換。最感興趣進行替代誘變的位點包括高變區(qū)，但也設(shè)想了 FR改變。保守替代在表I中顯示在標(biāo)題“優(yōu)選替代”下。如果此類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性的改變，那么可以引入表I中稱為“例示替代”的更實質(zhì)性改變，或如下文中關(guān)于氨基酸種類的進一步描述，并篩選產(chǎn)物。表I
權(quán)利要求
1.一種在癌癥患者中延長病情進展前時間(TTP)或存活的方法，包括對患者施用在該患者中延長TTP或存活的量的HER 二聚化抑制劑，其中所述患者的癌癥表現(xiàn)出HER活化。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述HER二聚化抑制劑是抗體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述抗體結(jié)合選自EGFR、HER2和HER3的HER受體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗體結(jié)合HER2。
5.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述癌癥選自卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)、非小細胞性肺癌(NSCLC)、前列腺癌和結(jié)腸直腸癌。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述癌癥是卵巢癌、腹膜癌或輸卵管癌。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述癌癥是晚期的、頑固性的或復(fù)發(fā)性的卵巢癌。
8.一種在卵巢癌、腹膜癌或輸卵管癌患者中延長病情進展前時間(TTP)或存活的方法，包括對患者施用在該患者中延長TTP或存活的量的pertuzumab,其中所述患者的癌癥表現(xiàn)出HER2活化。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述患者患有卵巢癌。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中所述患者患有晚期的、頑固性的或復(fù)發(fā)性的癌癥。
全文摘要
本申請涉及使用HER二聚化抑制劑在癌癥患者中延長病情進展前時間或存活。本申請描述了通過用HER二聚化抑制劑諸如pertuzumab治療患者，在癌癥患者中延長病情進展前時間或存活，其中所述患者的癌癥表現(xiàn)出HER活化。
文檔編號A61P35/00GK103251946SQ20131012502
公開日2013年8月21日 申請日期2006年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日
發(fā)明者米卡.K.德里克, 斯蒂芬.M.凱爾西 申請人:健泰科生物技術(shù)公司