PPARγ:RXRα異源二聚體激動(dòng)劑在緩解拉坦前列腺素在臨床上的副作用中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了PPARγ:RXRα異源二聚體激動(dòng)劑在制備用于預(yù)防或治療拉坦前列腺素的施用所引起副作用的藥物中的用途，即PPARγ:RXRα異源二聚體激動(dòng)劑用于緩解拉坦前列腺素對(duì)脂肪細(xì)胞分化的抑制作用的用途。因此，PPARγ:RXRα異源二聚體激動(dòng)劑（例如，羅格列酮、吡格列酮、曲格列酮等）可以用于緩解拉坦前列腺素在臨床上應(yīng)用的副作用。
【專利說明】PPARy :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑在緩解拉坦前列腺素在 臨床上的副作用中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物治療學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及PPARY :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑在制 備用于預(yù)防或治療拉坦前列腺素的施用所引起副作用的藥物中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 拉坦前列腺素（Latanoprost)是一種新型苯基替代的丙基酯前列腺素 F2 a，屬 于前列腺素的衍生物。拉坦前列腺素作為選擇性前列腺素 F受體（FP)激動(dòng)劑，目前在臨 床上主要用于開角型青光眼和高眼壓癥的治療。然而，拉坦前列腺素長期用藥會(huì)導(dǎo)致一系 列副作用，包括眼周皮膚和虹膜黑變，睫毛生長增加和眼結(jié)膜充血等[Hollo G. The side effects of the prostaglandin analogues. Expert Opin Drug Saf. 2007;6:45 - 52]。除 此之外，長期使用拉坦前列腺素的病人還會(huì)出現(xiàn)上眼瞼加深的副作用（deepening of the upper eyelid sulcus(DUES))，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)這主要是由于眼眶脂肪細(xì)胞萎縮所致， 但具體的機(jī)制并不清楚[Park J，Cho HK, Moon JI. Changes to upper eyelid orbital fat from use of topical bimatoprost, travoprost, and latanoprost. Jpn J Ophthalmol. 20 1ljan;55(1):22-7]。
[0003] 維甲酸X受體（RXR)作為核受體蛋白超家族的一員，可以自身形成同源二聚體， 還能夠與其他核受體形成異源二聚體行使功能，參與細(xì)胞生長分化、代謝調(diào)節(jié)、形態(tài)發(fā)生 和胚胎發(fā)育等許多重要的生理過程。其中RXR和PPARy所形成的異源二聚體是脂肪細(xì) 胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，在脂肪細(xì)胞分化的過程中起到非常關(guān)鍵的作用。而該二聚體的 拮抗劑可以抑制脂肪細(xì)胞分化，并降低白色脂肪細(xì)胞中甘油三酯的含量[J Clin Invest 108:1001-1013, 2001]〇
[0004] 本發(fā)明人經(jīng)隨機(jī)篩選發(fā)現(xiàn)拉坦前列腺素是維甲酸X受體a (retinoid X receptor α，RXR α )的拮抗劑，可以拮抗PPARy : RXR α異源二聚體的轉(zhuǎn)錄活性[拉坦前列腺素在治 療糖尿病和/或高甘油三酯血癥及其并發(fā)癥中的應(yīng)用，申請(qǐng)?zhí)柺?01210075028. 2的中國發(fā) 明專利申請(qǐng)]。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述和其他問題，本發(fā)明人進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，拉坦前列腺素是 PPARY :RXRa異源二聚體的特異性拮抗劑，可以濃度依賴性地抑制脂肪細(xì)胞的分化， 而PPARY:RXRa異源二聚體激動(dòng)劑可以緩解拉坦前列腺素的這種抑制作用。因此， PPARY :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑(例如，羅格列酮、吡格列酮、曲格列酮等)可以用于緩解拉 坦前列腺素在臨床上應(yīng)用的副作用。
[0006] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供PPARY :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑在制備用于預(yù) 防或治療拉坦前列腺素的施用所引起的副作用的藥物中的用途。
[0007] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用包括：施用拉坦前列 腺素時(shí)造成的眼瞼部脂肪細(xì)胞萎縮。更優(yōu)選地，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用 包括：施用拉坦前列腺素治療開角型青光眼或高眼壓癥時(shí)造成的眼瞼部脂肪細(xì)胞萎縮。
[0008] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述PPARY :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑可以是目前文獻(xiàn)中已報(bào) 道的激動(dòng)劑，例如：羅格列酮、吡格列酮和曲格列酮等。
[0009] 本發(fā)明中，更優(yōu)選地，所述PPARy :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑為選自羅格列酮、批 格列酮和曲格列酮等中的一種或多種。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種藥物組合物，其包含：治療有效量的拉坦前列腺 素；和治療有效量的PPARY :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑。
[0011] 本發(fā)明中，PPARy :RXR a異源二聚體激動(dòng)劑能夠預(yù)防或治療拉坦前列腺素的施用 所引起副作用，也就是，PPARY :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑能夠緩解拉坦前列腺素對(duì)脂肪細(xì) 胞分化的抑制作用。
[0012] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述PPARy :RXR a異源二聚體激動(dòng)劑可以是目前文獻(xiàn)中已報(bào) 道的激動(dòng)劑，例如：羅格列酮、吡格列酮和曲格列酮等。
[0013] 本發(fā)明中，更優(yōu)選地，所述PPARY :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑為選自羅格列酮、批 格列酮和曲格列酮等中的一種或多種。
[0014] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述藥物組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。
[0015] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種預(yù)防或治療拉坦前列腺素的施用所引起的副作 用的方法，其包括向需要的對(duì)象施用治療有效量的PPARY :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑。
[0016] 本發(fā)明中，更優(yōu)選地，所述PPARy :RXR a異源二聚體激動(dòng)劑可以是目前文獻(xiàn)中已 報(bào)道的激動(dòng)劑，例如：羅格列酮、吡格列酮和曲格列酮等。
[0017] 本發(fā)明中，優(yōu)選地，所述PPARY :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑為選自羅格列酮、吡格 列酮和曲格列酮等中的一種或多種。
[0018] 本發(fā)明中，術(shù)語"有效量"可指為實(shí)現(xiàn)預(yù)期的效果所需的劑量和時(shí)段的有效的量。 此有效量可能因某些因子而產(chǎn)生不同的變化，如疾病的種類或治療時(shí)疾病的病癥、被施用 的特定標(biāo)的器官的構(gòu)造、病人個(gè)體大小、或疾病或癥狀的嚴(yán)重性。本領(lǐng)域具有通常知識(shí)者不 需要過度實(shí)驗(yàn)即可憑經(jīng)驗(yàn)決定特定化合物的有效量。
[0019] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 PPARY :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑可以緩解拉坦前列腺素對(duì)脂肪 細(xì)胞分化的抑制作用。該發(fā)現(xiàn)對(duì)開發(fā)緩解開角型青光眼和高眼壓癥治療的一線臨床藥物拉 坦前列腺素的副作用藥物有指導(dǎo)意義。本發(fā)明人還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了 PPARY:RXRa異源二聚 體激動(dòng)劑的新應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1示出了拉坦前列腺素對(duì)RXRa :NR的轉(zhuǎn)錄激活作用的影響。###. P〈0. 001， ##.P〈0.01，與第一道陰性對(duì)照（DMS0組）比較。單因素方差分析（One-way AN0VA)。
[0021] 圖2示出了拉坦前列腺素可以顯著地抑制脂肪細(xì)胞的分化。
[0022] 圖3示出了羅格列酮可以逆轉(zhuǎn)拉坦前列腺素的抑制細(xì)胞分化作用。
[0023] 圖4示出了拉坦前列腺素可以顯著性抑制脂肪酸合成酶（FAS)的mRNA水平。***. P〈0. 001，與第一道陰性對(duì)照（DMS0組）比較。單因素方差分析（One-way AN0VA)。
[0024] 圖5示出了羅格列酮可以逆轉(zhuǎn)拉坦前列腺素的抑制脂肪酸合成酶（FAS)mRNA的作 用。P〈0. 001，與第一道溶劑組比較。###. P〈0. 001，與第二道拉坦前列腺素組比較。單 因素方差分析（One-way ANOVA)。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 在下文中，將通過示例性提出的實(shí)施例來更加詳細(xì)地描述本發(fā)明，然而，本發(fā)明的 范圍并不限于實(shí)施例。
[0026] 實(shí)施例1 :拉坦前列腺素是PPARy :RXRa異源二聚體的特異性拮抗劑
[0027] 在先前的研究中，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)拉坦前列腺素是維甲酸X受體a (retinoid X rec印tora，RXRa )的拮抗劑，可以拮抗PPARy :RXRa異源二聚體的轉(zhuǎn)錄活性[申請(qǐng)?zhí)?是201210075028. 2的中國發(fā)明專利申請(qǐng)]。
[0028] 進(jìn)一步地，本發(fā)明在細(xì)胞水平上通過核受體RXRa :NR (其中，NR表示：FXR、 PPAR a、PPAR δ、LXR a、LXR β 或 RXR a )順式反應(yīng)元件（NRE (NRE 表示：FXRE、PPRE、LXRE 或RXRE))調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定的方法測(cè)試了拉坦前列腺素對(duì)除RXRa :PPARy異 源二聚體以外的RXRa其他同源或異源二聚體的反式激活活性的影響。研究結(jié)果表明，拉 坦前列腺素對(duì)除RXRa :PPARY異源二聚體以外的RXRa其他的同源或異源二聚體均沒有 激動(dòng)或拮抗作用，因此，拉坦前列腺素是PPARY :RXRa異源二聚體的特異性拮抗劑。
[0029] 1、實(shí)驗(yàn)原理：
[0030] 在細(xì)胞質(zhì)中，RXRa與其他核受體或自身形成異源或同源二聚體并招募共激 活因子，然后入核，在其他相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)助下作用于靶基因的順式反應(yīng)元件上從而 啟動(dòng)該基因的轉(zhuǎn)錄。將順式反應(yīng)元件（NRE)克隆到pGL3-啟動(dòng)子載體中構(gòu)建重組載體 pGL3-NRE-Luc，在該重組載體中，螢火蟲熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄只受到反應(yīng)元件NRE的控 制。因此，螢火蟲熒光素酶的活性就相當(dāng)于RXRa :NR的反式激活活性。將p⑶NA3. 1-NR， p⑶NA3. 1-RXRa，PGL3-NRE-Luc及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，通過分別測(cè)定螢火 蟲熒光素酶及內(nèi)參熒光素酶活性，二者的比值即表征RXRa :NR的反式激活活性。
[0031] 2、實(shí)驗(yàn)材料與方法
[0032] 1)細(xì)胞培養(yǎng)：HEK-293細(xì)胞(來源：ATCC)在DMEM (Gibco公司）培養(yǎng)基（10%FBS (Gibco公司））中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為37° C，5%C02)。
[0033] 2)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及NR順式反應(yīng)元件調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 參照Invitrogen公司Lipo2000試劑說明書進(jìn)行。HEK-293細(xì)胞接種在24孔板上，當(dāng)細(xì) 胞生長至50?70%密度時(shí)，利用脂質(zhì)體（Invitrogen公司）瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染pGL3-NRE-Luc、 pCDNA3. 1-NR、pCDNA3. Ι-RXRa及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40,轉(zhuǎn)染12小時(shí)后將培養(yǎng)基換成DMEM (10%FBS)，同時(shí)加化合物（陽性激動(dòng)劑(劑量見下面說明)，或拉坦前列腺素（20 μ M)，或陽性 激動(dòng)劑和拉坦前列腺素(劑量同前))或DMS0 (作為陰性對(duì)照)孵育18小時(shí)，吸去培養(yǎng)基，PBS 洗一次，用Luciferase試劑盒（Promega公司)裂解細(xì)胞并測(cè)定螢火蟲熒光素酶和內(nèi)參熒光 素酶的活性（Luciferase測(cè)定方法參照Promega公司Luciferase試劑盒說明書進(jìn)行)。本 實(shí)驗(yàn)以維 A 酸（retinoic acid(RA，200nM)) (RXR 配體)、T0901317 (LXRa/β 配體，5μΜ)、 6評(píng)501516(--八1^配體，1(^]\〇、非諾貝特^611〇打13四七6(--41^配體，1(^]\〇)和0?^ (FXR配體，10 μ Μ)為陽性激動(dòng)劑（陽性對(duì)照)。
[0034] 3)上述所列陽性激動(dòng)劑和拉坦前列腺素全部購自Sigma公司。
[0035] 4) Luciferase信號(hào)檢測(cè)所用儀器是：TECAN公司的GENios酶標(biāo)儀。
[0036] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0037] 結(jié)果如圖1所示，與陰性對(duì)照DMS0 (溶齊[J)組相比，陽性激動(dòng)劑可以激動(dòng)RXR a : NR 的轉(zhuǎn)錄活性，而拉坦前列腺素既不能激動(dòng)RXRa :NR的轉(zhuǎn)錄活性，也不能拮抗陽性激動(dòng)劑對(duì) RXRa :NR的激動(dòng)作用。
[0038] 實(shí)施例2 :羅格列酮可以緩解拉坦前列腺素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的抑制作用
[0039] 本發(fā)明在細(xì)胞水平測(cè)試了拉坦前列腺素對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的影響以及 PPARY:RXRa異源二聚體激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)拉坦前列腺素這種作用的影響。實(shí)驗(yàn)表明，拉 坦前列腺素能濃度依賴性地抑制脂肪細(xì)胞分化，而羅格列酮可以緩解拉坦前列腺素的這種 抑制作用。
[0040] 1、實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0041] 1) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞：購自ATCC。
[0042] 2)羅格列酮及分化誘導(dǎo)試劑（IBMX (3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 (3-Isobutyl-l-methylxanthine) )、Dex (地塞米松（Dexamethasone))、膜島素（insulin)): 購自Sigma公司。
[0043] 3)拉坦前列腺素：購自Sigma公司。
[0044] 4)脂肪細(xì)胞分化測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法：將3T3-L1前脂肪細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)板，置于 37°C、5%C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合2天后，加含0. 5mM IBMX (3-異丁基-1-甲基黃嘌 呤（3-Isobutyl-l-methylxanthine) )、1 μ M Dex(地塞米松（Dexamethasone) )、1 μ g/mL 膜 島素（insulin)的10%FBS的DMEM培養(yǎng)48小時(shí)，換以含1 μ g/mL胰島素的培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 小時(shí)，隨后以加10%FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，2天換培養(yǎng)液一次。在3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分 化的第1天即加入不同濃度的拉坦前列腺素（1、10、20 μ M)及羅格列酮（10 μ M)，直至實(shí)驗(yàn) 結(jié)束。然后用油紅〇染色法檢測(cè)細(xì)胞分化效率：移去誘導(dǎo)分化7天細(xì)胞的培養(yǎng)液，用PBS洗 3次，用10%甲醛固定液固定細(xì)胞10分鐘，PBS洗3次，然后以油紅0染色細(xì)胞，倒置顯微鏡 下觀察結(jié)果，拍攝照片。
[0045] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0046] 結(jié)果如圖2和3所示，拉坦前列腺素可以顯著地抑制脂肪細(xì)胞的分化，而羅格列酮 可以緩解拉坦前列腺素的抑制細(xì)胞分化作用。
[0047] 實(shí)施例3 :羅格列酮可以緩解拉坦前列腺素對(duì)成熟脂肪細(xì)胞中脂肪酸合成酶mRNA 水平的抑制作用
[0048] 本發(fā)明在細(xì)胞水平測(cè)試了拉坦前列腺素對(duì)分化后脂肪細(xì)胞中脂肪酸合成酶（FAS) 的影響以及PPARy :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)拉坦前列腺素這種作用的影響。 實(shí)驗(yàn)表明，拉坦前列腺素能濃度依賴性地抑制分化后脂肪細(xì)胞中脂肪酸合成酶（FAS)的 mRNA水平，而羅格列酮可以緩解拉坦前列腺素的這種抑制作用。
[0049] 1、實(shí)驗(yàn)材料和方法
[0050] 1) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化：同實(shí)施例2。
[0051] 2)羅格列酮：購自Sigma公司。
[0052] 3)拉坦前列腺素：購自Sigma公司。
[0053] 4)脂肪酸合成酶mRNA水平測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法：分化后的3T3-L1脂肪細(xì)胞，孵育化合 物(拉坦前列腺素（1、10、20 μ Μ)及羅格列酮（10 μ Μ)) 24小時(shí)后，抽提細(xì)胞的RNA。方法如 下：處理過的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗三遍，加入lmL TRIZOL (Promega公司）裂解細(xì)胞5分 鐘。加入200yL三氯甲烷并劇烈搖晃15秒后靜置3分鐘，于4° C以13000rpm轉(zhuǎn)速離 心18分鐘，取500 μ L上清。隨后加入500 μ L異丙醇上下顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。其 后4° C以13000rpm轉(zhuǎn)速離心18分鐘，棄上清，沉淀用75%乙醇清洗一次，再4° C低溫以 13000rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘，最后棄上清并待沉淀完全干燥。干燥后的沉淀用DEPC水溶解并 測(cè)定抽提的總mRNA量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μ g總mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA (反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?37° C15分鐘；85° C5秒終止反應(yīng))。樣品cDNA采用SYRB熒光探針試劑盒（TaKaRa公司） 在0pticon2system (MJ公司）上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。引物序列如下：
[0054] GAPDH: 5 ' -ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3 ' (sense)，
[0055] 5, -TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3，(antisense);
[0056] FAS: 5 ' -GGCTCTATGGATTACCCAAGC-3 '（sense)，
[0057] 5' -CCAGTGTTCGTTCCTCGGA-3' （antisense)。
[0058] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0059] 結(jié)果如圖4和5所示，拉坦前列腺素能濃度依賴性地抑制分化后脂肪細(xì)胞中脂肪 酸合成酶（FAS)的mRNA水平，而羅格列酮可以緩解拉坦前列腺素的這種抑制作用。
[0001] <11〇>屮Η科學(xué)院丄海藥物研究所 <120〉PPARr:RXRa異源二聚體激動(dòng)劑在緩解拉圯前列腺?在臨Λ上的副作ffl屮的應(yīng)ffl <130> DI13-038oE-XC37 <160> 4 <170> PatentIn version 3. 3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> GAH)H 引物 <400> 1 acagcaacag ggtggtggac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人丨:序列 <220> <223> GAPDH 引物 <400> 2 tttgagggtg cagcgauctt 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213>人丄序列 <220> <523> FAS 引物 <400> 3 ggctctatgg attacccaag c 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213>人I :序列 <220> <223> FAS 引物 ；400> 4 (OHgtgttcg ttcctcgga 19
【權(quán)利要求】
1. PPARY :RXRa異源二聚體激動(dòng)劑在制備用于預(yù)防或治療拉坦前列腺素的施用所引 起的副作用的藥物中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用包括 施用拉坦前列腺素時(shí)造成的眼瞼部脂肪細(xì)胞萎縮。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述拉坦前列腺素的施用所引起的副作用包括 施用拉坦前列腺素治療開角型青光眼或高眼壓癥時(shí)造成的眼瞼部脂肪細(xì)胞萎縮。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述PPARY:RXRa異源二聚體激動(dòng)劑為選自羅 格列酮、吡格列酮和曲格列酮中的一種或多種。
5. -種藥物組合物，其包含：治療有效量的拉坦前列腺素；和治療有效量的 PPARY:RXRa異源二聚體激動(dòng)劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中，所述PPAR γ : RXR a異源二聚體激動(dòng)劑為 選自羅格列酮、吡格列酮和曲格列酮中的一種或多種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK104096232SQ201310111552
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月1日
【發(fā)明者】沈旭, 陳靜, 陳莉莉 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海藥物研究所