專利名稱：一種修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
在牙本質(zhì)粘接過程中，牙本質(zhì)酸蝕脫礦致膠原纖維暴露，暴露膠原遭內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶降解是限制樹脂ー牙本質(zhì)粘接復(fù)合體壽命的關(guān)鍵因素。中度及深度齲齒病變也表現(xiàn)為牙本質(zhì)層的脫礦和齲壞。解決這些問題都涉及到對(duì)脫礦的牙本質(zhì)進(jìn)行再礦化。隨著人們對(duì)牙本質(zhì)精細(xì)結(jié)構(gòu)、膠原纖維與礦物的有機(jī)結(jié)合情況知識(shí)的豐富，對(duì)非膠原蛋白在牙本質(zhì)礦化中作用的認(rèn)識(shí)以及生物礦化具體過程逐漸被人理解并在體外模擬，脫礦牙本質(zhì)修復(fù)領(lǐng)域進(jìn)入了仿生再礦化的時(shí)代。目前主流的仿生再礦化方式為用兩種牙本質(zhì)非膠原蛋白的仿生類似物，在以Portland Cement作為鈣離子緩釋源的含磷溶液中成功地使酸蝕脫礦的牙本質(zhì)再礦化，并且生成纖維內(nèi)礦物和纖維外礦物。但是，這樣的方法耗時(shí)達(dá)四個(gè)月之久，不具備臨床實(shí)用性。而且，該裝置由鈣離子源，磷離子源，非膠原蛋白類似物等組成，太過復(fù)雜，難以讓臨床醫(yī)生從繁忙的工作中解脫。納米級(jí)無定形磷酸鈣顆粒作為存在于生物礦化過程中的前驅(qū)體，近年來受到越來越多的關(guān)注。有學(xué)者研究表明該顆粒內(nèi)部高達(dá)10-20%的含水量和內(nèi)部原子介于晶體和溶液的無序排列賦予了其類似液體的“流動(dòng)性”，無定形顆粒憑借“流動(dòng)性”預(yù)先復(fù)制模板的形貌和結(jié)構(gòu)，然后逐漸失水、結(jié)晶、固化生成熱力學(xué)更穩(wěn)定的結(jié)晶態(tài)礦物。無定形磷酸鈣的基本構(gòu)成單元是Ca9(PO4)6(Posner Cluster),這種物質(zhì)被稱作“小團(tuán)簇”,尺寸大約為0. 95nm，可以相互團(tuán)聚為尺寸更大的礦物顆粒。本課題組在研究過程中發(fā)現(xiàn)，調(diào)控聚丙烯酸的濃度可以調(diào)控Posner Cluster的團(tuán)聚，間接調(diào)控顆粒的直徑，依次方法可以制備出與牙本質(zhì)天然礦物大小相近的無定形磷酸鈣顆粒。

所以，基于上述兩個(gè)特點(diǎn)，將這ー顆粒應(yīng)用于脫礦牙本質(zhì)的修復(fù)必將在短期內(nèi)恢復(fù)其天然等級(jí)結(jié)構(gòu)和優(yōu)良力學(xué)性能。但是相關(guān)研究在國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的方法。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是
本發(fā)明首先合成無定形磷酸鈣顆粒，然后再礦化脫礦牙本質(zhì)。所述的合成無定形磷酸鈣顆粒具體是
用8 10g/L聚丙烯酸作為調(diào)控劑，在36 38°C下，使用0.1 0. 2M、PH為9. 5±0.1的磷酸氫ニ鈉水溶液和0. 2 0. 3M氯化鈣水溶液作為合成母液；采用滴定管在20 30分鐘內(nèi)將氯化鈣水溶液按體積比1:1加入至磷酸氫ニ鈉水溶液中，過程中采用磁力攪拌器攪拌，并使用0.1M氫氧化鈉溶液調(diào)控pH保持在9.5±0.5區(qū)間；使得鈣離子最終濃度為
9.0 11. OmM，磷離子的最終濃度為5. 0 7. OmM，聚丙烯酸的最終濃度為300 1000吒/mL ;最終合成直徑為15 20nm的無定形磷酸鈣顆粒，該顆粒合成后以溶液形式貯存。所述的再礦化脫礦牙本質(zhì)具體是
步驟1.收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機(jī)垂直于牙長(zhǎng)軸先切除牙釉質(zhì)，再切取厚度為0. 5 Imm的牙本質(zhì)片。步驟2.將上述牙片放入質(zhì)量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2 3微米范圍內(nèi)的脫礦牙本質(zhì)模型。步驟3.取15 20ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養(yǎng)瓶中，將脫礦牙本質(zhì)模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中。步驟4.將上述培養(yǎng)瓶放在35 38°C恒溫箱中，于7天后取出。本發(fā)明的有益效果具有很好的生物相容性；符合脫礦牙本質(zhì)修復(fù)中提出的“最小損壞”原則，能以已有脫礦纖維為模板進(jìn)行再礦化；相比于傳統(tǒng)礦化法，本方法由底部至上進(jìn)行礦物生長(zhǎng)，能夠恢復(fù)脫礦牙本質(zhì)的礦物含量，保護(hù)膠原，防止脫礦進(jìn)ー步發(fā)生；恢復(fù)了牙本質(zhì)特殊的等級(jí)結(jié)構(gòu)；恢復(fù)牙本質(zhì)的超強(qiáng)力學(xué)性能；相比于已有的仿生礦化法，原料易得，體系更簡(jiǎn)單；更重要的是，本方法中礦化完成所需要的時(shí)間大大僅為7天，對(duì)于再礦化脫礦牙本質(zhì)技術(shù)來講是ー種突破。


圖1為實(shí)施例1，2，3中脫礦牙本質(zhì)膠原的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖片。圖2為實(shí)施例1，2，3中不同濃度聚丙烯酸調(diào)控下的不同無定形磷酸鈣修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的掃描電鏡(SEM)圖片。

圖3為實(shí)施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控合成的無定形磷酸鈣顆粒紅外(FTIR)圖片和掃描電鏡(SEM)圖片。圖4為實(shí)施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控合成的無定形磷酸鈣修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的細(xì)節(jié)，掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖片。圖5為實(shí)施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控合成的無定形磷酸鈣修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的納米壓痕圖片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)ー步闡述
實(shí)施例1 :
配備0. 25M氯化鈣(CaCl2)水溶液，0. 15M磷酸氫ニ鈉(Na2HPO4)水溶液，10g/L聚丙烯酸(PAA)水溶液做合成實(shí)驗(yàn)的母液。取2. 4 mL Na2HPO4母液和2. OmL的PAA母液混合，二次蒸餾水稀釋，用IM NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至9. 5 ±0. 1，常溫?cái)嚢?. 5h，總體積為30mL。取2. 4mL CaCl2母液加水稀釋至30mL。用滴定管將30mL鈣液30加入30mL磷溶液，滴加過程中磁力攪拌器攪拌，0.1M NaOH溶液調(diào)控pH保持在9. 5±0. 5區(qū)間。最終，鈣離子濃度為10. OmM，磷離子濃度為6. OmM, PAA濃度為300ug/mL。保證整個(gè)滴加過程持續(xù)25 30分鐘。收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機(jī)垂直于牙長(zhǎng)軸先切除牙釉質(zhì)，再切取厚度為0. 5 Imm的牙本質(zhì)片；然后用500 # -2000 #砂紙逐一打磨，大量二次蒸餾水清洗；將上述牙片放入質(zhì)量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，再次用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2 3微米范圍內(nèi)的脫礦牙本質(zhì)模型；取15ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養(yǎng)瓶中，將脫礦牙本質(zhì)模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中；將上述培養(yǎng)瓶放在37. 5°C恒溫箱中，于7天后取出。將再礦化的牙本質(zhì)樣本一分為ニ，一半用酒精梯度脫水的方式進(jìn)行干燥，做掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)的觀察，另一半不作脫水處理，直接進(jìn)行納米壓痕檢測(cè)。實(shí)施例2:
配備0. 25M氯化鈣(CaCl2)水溶液，0. 15M磷酸氫ニ鈉(Na2HPO4)水溶液，10g/L聚丙烯酸(PAA)水溶液做合成實(shí)驗(yàn)的母液。取2. 4 mL Na2HPO4母液和3. OmL的PAA母液混合，二次蒸餾水稀釋，用IM NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至9. 5±0. 1，常溫?cái)嚢?. 5 h，總體積為30mL。取2. 4mL CaCl2母液加水稀釋至30mL。用滴定管將30 mL鈣液30加入30mL磷溶液，滴加過程中磁力攪拌器攪拌，0.1M NaOH溶液調(diào)控pH保持在9. 5±0. 5區(qū)間。最終，鈣離子濃度為10.0 mM，磷離子濃度為6.0 mM，PAA濃度為500 ug/mL。保證整個(gè)滴加過程持續(xù)25 30分鐘。收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機(jī)垂直于牙長(zhǎng)軸先切除牙釉質(zhì)，再切取厚度為0.5 Imm的牙本質(zhì)片；然后用500 # -2000 #砂紙逐一打磨，大量二次蒸餾水清洗；將上述牙片放入質(zhì)量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，再次用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2 3微米范圍內(nèi)的脫礦牙本質(zhì)模型；取15ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養(yǎng)瓶中，將脫礦牙本質(zhì)模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中；將上述培養(yǎng)瓶放在37. 5°C恒溫箱中，于7天后取出。將再礦化的牙本質(zhì)樣本一分為ニ，一半用酒精梯度脫水的方式進(jìn)行干燥，做掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)的觀察，另一半不作脫水處理，直接進(jìn)行納米壓痕檢測(cè)。實(shí)施例3
配備0. 25M氯化鈣(CaCl2)水溶液，0. 15M磷酸氫ニ鈉(Na2HPO4)水溶液，10g/L聚丙烯酸(PAA)水溶液做合成實(shí)驗(yàn)的母液。取2. 4 mL Na2HPO4母液和6. OmL的PAA母液混合，二次蒸餾水稀釋，用IM NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至9. 5±0. 1，常溫?cái)嚢?. 5 h，總體積為30 mL。取2. 4mL CaCl2母液加水稀釋至30mL。用滴定管將30mL鈣液30加入30 mL磷溶液，滴加過程中磁力攪拌器攪拌，0.1M NaOH溶液調(diào)控pH保持在9. 5±0. 5區(qū)間。鈣離子、磷離子最終濃度分別為10.0 mM和6.0 mM。最終，鈣離子濃度為10. OmM，磷離子濃度為6. 0 mM, PAA濃度為1000 ug/mL。保證整個(gè)滴加過程持續(xù)25 30分鐘。收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機(jī)垂直于牙長(zhǎng)軸先切除牙釉質(zhì)，再切取厚度為0. 5 Imm的牙本質(zhì)片；然后用500#-2000 #砂紙逐一打磨，大量二次蒸餾水清洗；將上述牙片放入質(zhì)量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，再次用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2 3微米范圍內(nèi)的脫礦牙本質(zhì)模型；取15ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養(yǎng)瓶中，將脫礦牙本質(zhì)模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中；將上述培養(yǎng)瓶放在37. 5°C恒溫箱中，于7天后取出。將再礦化的牙本質(zhì)樣本一分為ニ，一半用酒精梯度脫水的方式進(jìn)行干燥，做掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)的觀察，另一半不作脫水處理，直接進(jìn)行納米壓痕檢測(cè)。圖1為實(shí)施例1，2，3中脫礦牙本質(zhì)膠原的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖片。可以看出脫礦之后剩下膠原纖維網(wǎng)架，在透射電鏡成像中襯度低。圖2為實(shí)施例1，2，3中不同濃度聚丙烯酸調(diào)控下的不同無定形磷酸鈣修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的掃描電鏡(SEM)圖片。可以看出牙本質(zhì)膠原基質(zhì)表面形成礦物層，單根膠原纖維得到礦化，膠原纖維仍然裸露。圖3為實(shí)施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控合成的無定形磷酸鈣顆粒紅外(FTIR)圖片和掃描電鏡(SEM)圖片?？梢钥闯龀跏糀CP顆粒尺寸為 15 nm,約14天之后相變成 100 nm針狀顆粒。圖4為實(shí)施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控合成的無定形磷酸鈣修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的細(xì)節(jié)，掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖片。可以看出礦化層礦物密度和礦物有序性與基底天然牙本質(zhì)相當(dāng)。圖5為實(shí)施例2中500ug/mL的聚丙烯酸調(diào)控合成的無定形磷酸鈣修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的納米壓痕圖片?？梢钥闯鲈俚V化牙本質(zhì)力學(xué)性能表現(xiàn)比脫礦牙本質(zhì)大幅加強(qiáng)，接近天 然牙本質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的方法，其特征在于該方法首先合成無定形磷酸鈣顆粒，然后再礦化脫礦牙本質(zhì)；所述的合成無定形磷酸鈣顆粒具體是用8 10g/L聚丙烯酸作為調(diào)控劑，在36 38°C下，使用O.1 O. 2M、PH為9. 5±0.1的磷酸氫二鈉水溶液和O. 2 O. 3M氯化鈣水溶液作為合成母液；采用滴定管在20 30分鐘內(nèi)將氯化鈣水溶液按體積比1:1加入至磷酸氫二鈉水溶液中，過程中采用磁力攪拌器攪拌，并使用O.1M氫氧化鈉溶液調(diào)控pH保持在9.5±0.5區(qū)間；使得鈣離子最終濃度為,9. O 11. OmM，磷離子的最終濃度為5. O 7. OmM，聚丙烯酸的最終濃度為300 1000 μδ/mL ;最終合成直徑為15 20nm的無定形磷酸鈣顆粒，該顆粒合成后以溶液形式貯存；所述的再礦化脫礦牙本質(zhì)具體是步驟1.收集無齲的離體牙，用慢速ISOMET鉆石切片機(jī)垂直于牙長(zhǎng)軸先切除牙釉質(zhì)，再切取厚度為O. 5 Imm的牙本質(zhì)片；步驟2.將上述牙片放入質(zhì)量濃度為35%的磷酸中，10秒后取出，用大量的二次蒸餾水沖洗，得到脫礦層厚度在2 3微米范圍內(nèi)的脫礦牙本質(zhì)模型；步驟3.取15 20ml上述合成的無定形磷酸鈣顆粒溶液置于培養(yǎng)瓶中，將脫礦牙本質(zhì)模型置于無定形磷酸鈣顆粒溶液中；步驟4.將上述培養(yǎng)瓶放在35 38°C恒溫箱中，于7天后取出。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的方法。現(xiàn)有修復(fù)脫礦牙本質(zhì)的方法是采用兩種牙本質(zhì)非膠原蛋白類似物，借助于波特蘭水門汀緩釋體系來實(shí)現(xiàn)的，但是這種方法裝置過于復(fù)雜，達(dá)到全層礦化所需的時(shí)間需4個(gè)月之久。本發(fā)明方法先用簡(jiǎn)便易得的聚丙烯酸作為調(diào)節(jié)劑，以鈣離子和磷離子作為原料，合成15-20nm尺寸具有流動(dòng)性的無定形磷酸鈣顆粒；然后于7天之內(nèi)再礦化脫礦的牙本質(zhì)，恢復(fù)了脫礦牙本質(zhì)天然的等級(jí)結(jié)構(gòu)，而再礦化后的牙本質(zhì)的力學(xué)性能也達(dá)到了與天然牙本質(zhì)相當(dāng)?shù)乃?。本發(fā)明與現(xiàn)有再礦化技術(shù)相比，在達(dá)到同樣恢復(fù)等級(jí)結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的基礎(chǔ)上，裝置簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，更為有效的解決了再礦化脫礦牙本質(zhì)這一問題。
文檔編號(hào)A61K6/033GK103027845SQ20131000517
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2013年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月6日
發(fā)明者顧新華, 唐?？? 陳怡 , 王建明, 孫健 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)