改造的構(gòu)象穩(wěn)定蛋白質(zhì)的制作方法
【專利摘要】本文提供構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白；及用該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白來鑒定結(jié)合穩(wěn)定的遍在蛋白的物質(zhì)，或結(jié)合與穩(wěn)定形式的遍在蛋白相互作用的蛋白質(zhì)的物質(zhì)，或加工穩(wěn)定形式的遍在蛋白的蛋白質(zhì)的物質(zhì)的方法。本文還提供用于篩選構(gòu)象穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的方法，與野生型形式的蛋白質(zhì)和結(jié)合配偶體的結(jié)合親和力相比，該構(gòu)象穩(wěn)定的蛋白質(zhì)具有提高的和結(jié)合配偶體的結(jié)合親和力。
【專利說明】改造的構(gòu)象穩(wěn)定蛋白質(zhì)
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2012年3月16日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/612, 228的優(yōu)先權(quán)， 其公開內(nèi)容在此完整引入作為參考。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本文提供用于篩選和使用構(gòu)象動態(tài)蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定形式，如構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋 白（ubiquitin protein)的方法，以及包含此構(gòu)象動態(tài)蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定形式的組合物。

【背景技術(shù)】
[0004] 蛋白質(zhì)是非常動態(tài)的大分子，構(gòu)象運動在多種過程中發(fā)揮作用，如產(chǎn)生機(jī)械能、進(jìn) 行酶促反應(yīng)和介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于分子的多種狀態(tài)可以執(zhí)行不同的功能，對產(chǎn)生特異性識 別離散構(gòu)象狀態(tài)的試劑的能力存在相當(dāng)大的興趣。U
[0005] 遍在蛋白（ubiquitin)是見于真核生物的幾乎所有組織中（遍在地）的小調(diào)節(jié)蛋 白。蛋白質(zhì)遍在蛋白化介導(dǎo)許多細(xì)胞過程，如細(xì)胞周期控制、凋亡、表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。 4但是，遍在蛋白最廣為人知的可能是它在標(biāo)記將要通過細(xì)胞的蛋白水解機(jī)器破壞和回收 的蛋白質(zhì)中發(fā)揮的作用。在遍在蛋白共價"標(biāo)記"蛋白質(zhì)時，遍在蛋白分子將蛋白質(zhì)定向至 蛋白酶體，蛋白酶體是細(xì)胞中降解和回收標(biāo)記待破壞的蛋白質(zhì)的大的多成分蛋白復(fù)合物。 遍在蛋白本身由76個氨基酸組成，分子量約為8. 5kDa。主要特征包括其C端尾和7個賴氨 酸殘基。6遍在蛋白的氨基酸序列在真核物種間保守，人和酵母遍在蛋白具有約96%序列 同一性。在哺乳動物中，遍在蛋白由4個分開的基因編碼?；?UBA52和RPS27A分別編碼 與核糖體蛋白L40和S27a融合的單拷貝遍在蛋白，而UBB和UBC基因編碼多聚遍在蛋白前 體蛋白。
[0006] 遍在蛋白化是酶促的翻譯后修飾過程，其中來自活化的遍在蛋白形式的遍在蛋白 C端二甘氨酸基序的末端甘氨酸與修飾蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的ε胺形成酰胺鍵。遍在蛋 白由Ε1遍在蛋白活化酶在需要ΑΤΡ作為能量來源的過程中以兩步反應(yīng)活化。這涉及產(chǎn)生 遍在蛋白-腺甘酸中間體，然后將遍在蛋白轉(zhuǎn)移至Ε1活性部位半胱氨酸殘基，在遍在蛋白 C端羧基和Ε1半胱氨酸巰基之間產(chǎn)生硫酯鍵。然后，通過轉(zhuǎn)（硫）酯反應(yīng)將遍在蛋白從Ε1 酶轉(zhuǎn)移至Ε2遍在蛋白綴合酶的活性部位半胱氨酸。遍在蛋白化酶級聯(lián)最后的步驟在靶蛋 白中的賴氨酸和遍在蛋白的C端甘氨酸之間產(chǎn)生異肽鍵。通常，此步驟需要數(shù)百種已知的 Ε3遍在蛋白-蛋白連接酶（常簡稱為"遍在蛋白連接酶"）之一的活性。5Ε3酶作為該系統(tǒng) 的底物識別模塊發(fā)揮作用，且能夠與Ε2和修飾的蛋白底物二者相互作用。
[0007] 單個遍在蛋白加至蛋白質(zhì)（單遍在蛋白化）之后，可以在它的7個賴氨酸殘基中 的一個或多個上將其他遍在蛋白加至該第一遍在蛋白分子，產(chǎn)生多聚遍在蛋白鏈。此外， 一些底物是通過在稱為多遍在蛋白化的過程中將遍在蛋白分子加至多個賴氨酸殘基來修 飾。研究最多的多聚遍在蛋白鏈?zhǔn)怯糜诘鞍酌阁w中的蛋白酶解的賴氨酸48連接的靶蛋白。 為了能被細(xì)胞的蛋白水解機(jī)器識別，將要降解的蛋白質(zhì)必須通過至少四個遍在蛋白分子修 飾。遍在蛋白分子在破壞（destruction)前由隸屬于遍在蛋白C末端水解酶（UCH)家族脫 遍在蛋白酶（deubiquitinase)的酶從蛋白質(zhì)切下并回收用于其他用途。
[0008] 脫遍在蛋白酶（DUB)是一類通過去組裝遍在蛋白鏈或從底物去除單遍在蛋白化 來調(diào)節(jié)遍在蛋白介導(dǎo)的信號發(fā)放的特化蛋白。 7DUB還常稱為脫遍在蛋白肽酶、脫遍在蛋白 異肽酶、脫遍在蛋白酶、遍在蛋白蛋白酶、遍在蛋白水解酶、遍在蛋白異肽酶或Dub。人基因 組在五個基因家族中編碼近100種對遍在蛋白具有特異性的DUB。DUB可以作為遍在蛋白 系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)物和正調(diào)節(jié)物。除遍在蛋白回收外，它們還涉及遍在蛋白如體的最初加工、蛋 白質(zhì)遍在蛋白化的校正及抑制性遍在蛋白鏈的去組裝。此外，諸如遍在蛋白特異性蛋白酶 (USP)家族DUB的DUB逆轉(zhuǎn)靶蛋白的遍在蛋白化或遍在蛋白樣修飾，而諸如UCH家族DUB的 成員的DUB負(fù)責(zé)從未錨定的多聚遍在蛋白（即通過綴合機(jī)從頭合成或通過其他DUB從靶蛋 白釋放的游離多聚遍在蛋白）再生單遍在蛋白。
[0009] 大多數(shù)DUB尚未得到充分表征。一個例外是USP7 (HAUSP)，其在腫瘤發(fā)生中具有 已經(jīng)確定的作用。USP7的關(guān)鍵功能是通過脫遍在蛋白化和穩(wěn)定癌蛋白質(zhì)Mdm2從而下調(diào)p 53 腫瘤抑制物來調(diào)節(jié)細(xì)胞存活。w由于USP7直接去穩(wěn)定化p53并調(diào)節(jié)其他腫瘤抑制物（包括 F0X04和PTEN)，抑制USP7是有吸引力的治療策略。8'9另一實例是USP14,認(rèn)為其在降解涉 及淀粉狀蛋白生成性神經(jīng)變性的蛋白質(zhì)中發(fā)揮作用。 32
[0010] 本文引用的所有專利、專利申請、出版物、文件、核苷酸及蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫檢索 號、其所指的序列和文章在此全都以其整體引入作為參考。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本文提供的發(fā)明尤其公開了包含構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的組合物和用該組合物來 抑制與這些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定形式結(jié)合的一種或多種酶的作用的方法，以及用于鑒定與這些穩(wěn) 定蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)的方法。本文還提供用于篩選蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定形式的方法。
[0013] 在一方面，本申請?zhí)峁┫鄬τ谝吧捅樵诘鞍拙哂幸粋€或多個氨基酸取代的構(gòu)象 穩(wěn)定的遍在蛋白。在一些實施方案中，該一個或多個氨基酸取代穩(wěn)定該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋 白的β 1/β 2環(huán)，使該β 1/β 2環(huán)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank)編號3NHE鏈 B的約1.6 Λ均方根偏差內(nèi)的區(qū)域。在一些實施方案中，如通過NMR馬分散（dispersion) 所測量，與野生型遍在蛋白相比，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β1/β2環(huán)區(qū)顯示更慢的構(gòu)象 動態(tài)。在上述實施方案中任一個的一些實施方案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍 在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β?/β 2環(huán)附近區(qū)域中的微秒Rex值高至多40倍。在 上述實施方案中任一個的一些實施方案中，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在選自A7、A8、A13、A34、 A36、A69和A71的位置處包含一個或多個氨基酸取代，其中該位置是相對于A1-A76(SEQ ID NO: 1)。在一些實施方案中，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白包含（a)取代A7(C)或取代A8(C);和 (b)取代A69(C)。在一些實施方案中，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白進(jìn)一步包含選自A13(N、R、G、 K、Y、A、S、H、E、L、T、V、I、M*P)、A34(I、F、L、V、S、M*T)、A36(Y、F、L、H、A、V、W、I、M* N)和八71〇?、1(3、〇、1、6、!1、1、1?或6)的一個或多個取代。在一些實施方案中，該構(gòu)象穩(wěn)定 的遍在蛋白包含選自 A7 (D、F、R 或 S)、A8 (Y、A、G、Q、R 或 Y)、A13 (R、Y、E 或 P)、A34 (I、L 或 1')、六36〇^、￥、六或沁、六69仏、6、1、1(、￥或1)和471仏、1?、〇、1?或6)的一個或多個取代。在 上述實施方案中任一個的一些實施方案中，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白進(jìn)一步包含定位在A42、 A46、A49、A62、A65、A68或A70處的一個或多個氨基酸取代，其中該氨基酸殘基位置對應(yīng)于 SEQ ID NO: 1中的位置。在上述實施方案中任一個的一些實施方案中，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋 白進(jìn)一步包含定位在 A40、A42、A46、A47、A49、A62、A65、A68、A70、A71、A72、A73、A74、A75 或A76處的一個或多個氨基酸取代，其中該氨基酸殘基位置對應(yīng)于SEQ ID NO: 1中的位置。 在上述實施方案中任一個的一些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在 蛋白顯示與遍在蛋白特異性蛋白酶（USP)家族的脫遍在蛋白酶的結(jié)合增加。在上述實施方 案中任一個的一些實施方案中，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以納摩爾范圍內(nèi)Kd與該脫遍在蛋 白酶結(jié)合。在上述實施方案中任一個的一些實施方案中，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以比野生 型蛋白質(zhì)的親和力高至少1000倍的親和力與該脫遍在蛋白酶結(jié)合。在上述實施方案中任 一個的一些實施方案中，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白抑制該脫遍在蛋白酶的活性。在上述實施 方案中任一個的一些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白顯示與 遍在蛋白C末端水解酶（UCH)家族的脫遍在蛋白酶無結(jié)合或減少的結(jié)合。
[0014] 在一方面，提供編碼上述實施方案中任一個的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的核酸。
[0015] 在一方面，提供包含上述實施方案中任一個的核酸的載體。在一些實施方案中，該 載體是表達(dá)載體。
[0016] 在一方面，提供包含上述實施方案中任一個的核酸或載體的細(xì)胞。在一些實施方 案中，該細(xì)胞選自動物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、線蟲細(xì)胞和酵母細(xì)胞。在一些實施方案 中，該動物細(xì)胞是人細(xì)胞或非人細(xì)胞。
[0017] 在一方面，提供包含上述實施方案中任一個的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白和USP家族的 成員的脫遍在蛋白酶的蛋白復(fù)合物。在一些實施方案中，該脫遍在蛋白酶是USP7、USP5或 USP14。在一些實施方案中，該脫遍在蛋白酶是USP7。
[0018] 在一方面，提供與上述實施方案中任一個的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的一個或多個 共價連接的蛋白質(zhì)。
[0019] 在一方面，提供包含固定在其上的上述實施方案中任一個的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白 的固體支持物。在一些實施方案中，該固體支持物是適合用于表面等離振子共振的表面。在 一些實施方案中，該固體支持物是納米顆粒、球珠（bead)或玻璃。
[0020] 在一方面，提供包含在其表面表達(dá)上述實施方案中任一個的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白 的細(xì)胞的群體。
[0021] 在一方面，提供抑制USP家族的脫遍在蛋白酶的方法，其包括使該脫遍在蛋白酶 與上述實施方案中任一個的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白接觸。在一些實施方案中，該抑制是體內(nèi) 抑制或體外抑制。
[0022] 在一方面，提供鑒定與遍在蛋白的構(gòu)象形式結(jié)合的物質(zhì)的方法，該構(gòu)象形式有利 于與USP家族的脫遍在蛋白酶結(jié)合，其包括：a)使該物質(zhì)與上述實施方案中任一個的構(gòu)象 穩(wěn)定的遍在蛋白接觸；和b)測定該物質(zhì)是否與該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白結(jié)合。在一些實施方 案中，該物質(zhì)是小分子化合物、抗體、蛋白質(zhì)、抑制性核酸或其任意組合。
[0023] 在一方面，提供鑒定與包含USP家族的脫遍在蛋白酶和遍在蛋白的蛋白復(fù)合物結(jié) 合的物質(zhì)的方法，該方法包括：a)使該物質(zhì)與21-23項中任一項的蛋白復(fù)合物接觸；和b) 測定該物質(zhì)是否能夠與該蛋白復(fù)合物結(jié)合。在一些實施方案中，該物質(zhì)是小分子化合物、抗 體、蛋白質(zhì)、抑制性核酸或其任意組合。在一些實施方案中，該物質(zhì)破壞脫遍在蛋白酶和遍 在蛋白之間的相互作用。
[0024] 在一個實施方案中，提供通過上述實施方案中任一個的方法鑒定的物質(zhì)。
[0025] 在一方面，提供篩選蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定形式的方法，其中該構(gòu)象穩(wěn)定形式與野生 型蛋白質(zhì)相比具有增加的與結(jié)合配偶體的結(jié)合親和力，或具有增加的調(diào)節(jié)該結(jié)合配偶體的 活性的能力，該方法包括：a)使該結(jié)合配偶體與該蛋白質(zhì)的突變體形式的文庫接觸，其中 該突變體形式的文庫是通過在一個或多個預(yù)先選擇的位置處用另一氨基酸殘基取代構(gòu)象 動態(tài)蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基而產(chǎn)生，其中該預(yù)先選擇的位置定位在該蛋白質(zhì)的內(nèi)部；和b) 根據(jù)與該結(jié)合配偶體的結(jié)合或與野生型蛋白質(zhì)相比增加的調(diào)節(jié)該結(jié)合配偶體的活性的能 力來鑒定該構(gòu)象穩(wěn)定形式。在一些實施方案中，根據(jù)每個位置處的氨基酸殘基對該蛋白質(zhì) 內(nèi)或該蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)的構(gòu)象動態(tài)的貢獻(xiàn)來選擇該預(yù)先選擇的位置。在上述實施方案中任 一個的一些實施方案中，該文庫是編碼該蛋白質(zhì)的突變體形式的核酸的文庫。在一些實施 方案中，該文庫是噬菌體展不文庫。在一些實施方案中，用于該噬菌體展不文庫的載體選自 M13噬菌體、Π 噬菌體、fd噬菌體、Ike噬菌體、N1噬菌體、腸細(xì)菌噬菌體T4、噬菌體T7和 腸細(xì)菌噬菌體λ。在上述實施方案中任一個的一些實施方案中，該方法進(jìn)一步包括用其他 氨基酸殘基取代一個或多個表面氨基酸殘基來在所鑒定出的構(gòu)象穩(wěn)定蛋白質(zhì)的表面上突 變一個或多個氨基酸殘基，并篩選與不含一個或多個取代的表面氨基酸殘基的構(gòu)象穩(wěn)定蛋 白質(zhì)相比具有增加的結(jié)合親和力或調(diào)節(jié)能力的蛋白質(zhì)。在上述實施方案中任一個的一些實 施方案中，該蛋白質(zhì)選自G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)、核激素受體、酪氨酸激酶受體和配體門控 型離子通道。在一些實施方案中，該蛋白質(zhì)是遍在蛋白。在一些實施方案中，該結(jié)合配偶體 選自脫遍在蛋白酶、Ε1遍在蛋白活化酶、Ε2遍在蛋白綴合酶、Ε3遍在蛋白-蛋白連接酶及 細(xì)胞蛋白酶體復(fù)合物的一個或多個成員。在一些實施方案中，該結(jié)合配偶體是脫遍在蛋白 酶。在一些實施方案中，該脫遍在蛋白酶是遍在蛋白特異性蛋白酶（USP)家族脫遍在蛋白 酶的成員。在一些實施方案中，該脫遍在蛋白酶選自USP7、USP5和USP14。在一些實施方 案中，該脫遍在蛋白酶是USP7。
[0026] 附圖簡述
[0027] 圖1顯示通過構(gòu)象展示鑒定對USP7(U7Ub)具有高親和力的兩類遍在蛋白變體。 A)構(gòu)象展示篩選使構(gòu)象平衡崩解為單狀態(tài)的核心突變。在遍在蛋白的情況下，已有的構(gòu)象 平衡介導(dǎo)幾種蛋白質(zhì)相互作用，預(yù)測單構(gòu)象的選擇既降低結(jié)合的熵成本又提供特異性。B) 上部：大多數(shù)U7Ub包含位置7或8和位置69之間的二硫鍵，突出顯示可以如何通過共價 分子內(nèi)交聯(lián)介導(dǎo)構(gòu)象穩(wěn)定化。下部：少數(shù)U7Ub不含二硫鍵，通過非共價重包裝達(dá)到相同的 終點。C)通過噬菌體斑點ELISA顯示基于二硫鍵（例如克隆7)和不基于二硫鍵（例如克 隆25)的U7Ub25變體都特異性結(jié)合USP7。D)非二硫鍵U7Ub25變體以193± 17. 3nM的親 和力結(jié)合 USP7 的催化核心（Δ Η = -16. 67±0· 1562kcal/mol，Δ S = -7. 48kcal/mol，N = 0. 92±0. 0062)。
[0028] 圖2顯示蛋白復(fù)合物內(nèi)的遍在蛋白的β 1-β 2區(qū)的聚類均方根偏差（RMSD)分析， 其揭示了影響DUB結(jié)合的兩種不同構(gòu)象。A)配對比對球狀核心（殘基1-5和11-70)的其 余部分后，遍在蛋白復(fù)合物的所有高分辨率結(jié)構(gòu)中遍在蛋白的β?-β 2區(qū)（殘基6-10)的 RMSD的聚類熱圖。Β)在不檢查聚類RMSD的情況下，β 1-β 2區(qū)所采用的構(gòu)象作為可能的 構(gòu)象體的彌散出現(xiàn)。C) "上"和"下" β 1-β 2構(gòu)象體的比較。D)UCH型DUB與β 1-β 2的 "上"構(gòu)象結(jié)合（UCHL3-Ub復(fù)合物PDB編號lxd3)，而USP型DUB結(jié)合"下"狀態(tài)（USP14-Ub 復(fù)合物PDB編號2ayo)。遍在蛋白顯示為紅色,DUB顯示為藍(lán)色。包裝β1-β2從而限制其 構(gòu)象的DUB殘基（UCHL3-Leu220，USP14-Phel68)顯示為球體。Ε)在與UCH(淡紫色，PDB編 號lcmx、lxd3和3ifw)和USP (粉紅色，PDB編號2ayo、2hd5和2ibi)的復(fù)合物中解析的三 種遍在蛋白結(jié)構(gòu)的置加。顯不允許在噬菌體文庫中突變的殘基的側(cè)鏈。
[0029] 圖3用可變表面化學(xué)顯示接觸遍在蛋白（橙色）的β 1_β2環(huán)區(qū)的USP型脫遍在 蛋白酶（藍(lán)色）。與遍在蛋白接觸的脫遍在蛋白酶殘基和允許在構(gòu)象展示期間改變的遍在 蛋白殘基顯示為棍。所顯示的脫遍在蛋白酶是USP7(PDB編號1NBF)、USP14(PDB編號2ΑΥ0)、 USP2 (PDB 編號 2IBI)和 USP21 (PDB 編號 3I3T)。
[0030] 圖4顯示A)通過生物層干涉量度法篩選U7Ub變體。將等量的USP7催化結(jié)構(gòu)域活 性部位突變體（USP7catC223A)偶聯(lián)至各傳感器尖端，并浸沒在恒定濃度的各U7Ub中。根 據(jù)穩(wěn)態(tài)反應(yīng)及表觀結(jié)合速率和解離速率來選擇變體。B) U7Ub7變體對USP7catC223A的滴定 顯示約200nM的解離常數(shù)。
[0031] 圖5顯示非二硫鍵U7Ub表面的親和力成熟進(jìn)一步改善對USP7的親和力。A) 基于U7Ub25支架的親和力成熟的克隆的序列包含少量表面突變。B)親和力成熟的克隆 U7Ub25. 2540是蛋白質(zhì)ELISA測定中最有效的USP7催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合劑。C)生物層干涉量度 法顯示U7Ub25以90nM的解離常數(shù)結(jié)合USP7的催化結(jié)構(gòu)域，而親和力成熟的U7Ub25. 2540 具有增強(qiáng)3倍的親和力。
[0032] 圖6顯示A)U7Ub7和B)U7Ub25. 2540的按1 ζ描繪的2F〇-Fc電子密度。顯示最 終的細(xì)化模型用于參考。
[0033] 圖7顯示U7Ub的晶體結(jié)構(gòu)，揭示改變的主鏈構(gòu)象或核心包裝。A)顯示野生型 遍在蛋白的結(jié)構(gòu)用于參考，最初選擇的變體中突變的位置顯示為棍，并標(biāo)記β1-β2區(qū)。 B)U7Ub7的結(jié)構(gòu)揭示了位置8和69之間形成的二硫鍵，其扭曲了 β1-β2環(huán)的構(gòu)象。C) U7Ub25. 2540變體的主鏈構(gòu)象與野生型遍在蛋白的主鏈構(gòu)象幾乎相同，但在β 1-β 2區(qū)周 圍具有改變的包裝。親和力成熟的表面突變顯示為黃色。
[0034] 圖8顯示U7Ub變體的結(jié)構(gòu)分析。Α)類似于USP7結(jié)合的遍在蛋白且不同于apo遍 在蛋白，U7Ub7的β 1-β2環(huán)向下扭曲。B)包裝及U7Ub7的C端和蛋白質(zhì)的其余部分之間 的氫鍵相互作用。C)U7Ub25. 2540的β 1-β 2環(huán)的構(gòu)象類似于apo遍在蛋白的構(gòu)象。
[0035] 圖9顯示異核1?} -15Ν Ν0Ε數(shù)據(jù)，顯示Ub7. 7的C端在溶液中可移動，但相對于野 生型受限。
[0036] 圖10顯示核心重包裝和溶劑暴露突變都為U7Ub25達(dá)到高親和力所必需。雖然在 U7Ub25核心（U7Ub25_L71和U7Ub25. 2540_L71)的背景中將Leu71Arg突變回復(fù)為其野生 型同一性強(qiáng)烈降低親和力，但將Arg71引入野生型遍在蛋白（Ubwt_R71)對緊密結(jié)合而言是 不夠的。類似地，具有表面突變的所有組合的野生型遍在蛋白核心具有受損的與USP7的結(jié) 合（Ubwt_R71，Ubwt. 2540_L71，Ubwt. 2540_R71)。將重包裝的核心與野生型遍在蛋白表面 (U7Ub25_L71)組合對緊密結(jié)合而言也是不夠的。因此，新選擇的核心和重新排列的表面都 為高親和力結(jié)合所需（U7Ub25_R71，U7Ub25. 2540_R71)。
[0037] 圖11顯示U7Ub25具有類似于野生型遍在蛋白的微秒運動。U7Ub25在毫秒時間尺 度上沒有可檢測到的運動，因為針對U7Ub25測定的R 2值顯示對CPMG重聚焦脈沖的頻率沒 有依賴性（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0038] 圖12顯示，酶促測定揭示U7Ub25和U7Ub25. 250是全長USP7的有效抑制劑。A) U7Ub25和U7Ub25. 2540都強(qiáng)烈抑制全長USP7 (IC5(I分別為172nM和104nM)。C端二甘氨酸 基序的缺失（U7Ub25dGG)對抑制潛能無影響。B)U7Ub不抑制高活性的USP2催化結(jié)構(gòu)域。 C)細(xì)胞功能與USP7的細(xì)胞功能完全相反的USP10不受U7Ub抑制。D)雖然USP47是與 USP7最密切相關(guān)的脫遍在蛋白酶，但U7Ub是比USP7有效性更低的此DUB的抑制劑（IC5Q? 10 μ M)。E)上部：U7Ub 以 373nM(U7Ub25)和 253nM(U7Ub25. 2540)的 IC5(I 抑制全長 USP5。 但是，C端二甘氨酸的缺失（U7Ub25dGG)廢除了 USP5的抑制。下部：USP5由野生型遍在蛋 白而不由U7Ub強(qiáng)烈激活。除對初始延遲期后測量的最大速率歸一化的"USP5 (最大速率）" 夕卜，所有活性均對零濃度遍在蛋白下的初始速率歸一化。
[0039] 圖13顯示抗-USP7變體未通過E1和E2酶有效摻入Lys48_或Lys63_連接的 鏈。U7Ub3和U7Ub7都未在利用E1UBE1和E2Cdc34(其促進(jìn)K48多遍在蛋白化）或Uevla/ UbcH13(其促進(jìn)K63多遍在蛋白化）的生化連接測定中有效摻入K48-或K63-連接的鏈； 單體遍在蛋白庫的排除支持變體部分占用所評價的E1和/或E2酶。相反，用U7Ub25未達(dá) 到可檢測到的多聚化。
[0040] 圖14顯示U7Ub25. 2540變體是細(xì)胞環(huán)境中的內(nèi)源性USP7的選擇性抑制劑。A) U7Ub25. 2540在細(xì)胞中微弱地?fù)饺攵嗑郾樵诘鞍祖湥籙7Ub25. 2540AGG廢除了鏈摻入。圖15 中顯示特異性遍在蛋白鏈連接的研究。用所示表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，裂解物按所示 印跡或用所以抗體免疫沉淀；同種型對照（C)抗體是細(xì)胞培養(yǎng)級赫賽?。℉erceptin)。抝相 對于其他細(xì)胞DUB，U7Ub25. 2540 Λ GG選擇性結(jié)合內(nèi)源性USP7。用抗所示蛋白質(zhì)的抗體印跡 抗-ΗΑ抗體或同種型抗體對照（抗-c-myc)免疫沉淀或細(xì)胞裂解物。用HCT116USP7-/-細(xì) 胞系作為USP7結(jié)合的附加對照。C)U7Ub25. 2540AGG在細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)MDM2多遍在 蛋白化（內(nèi)源性USP7抑制的指示）。用所示構(gòu)建體轉(zhuǎn)染U20S細(xì)胞，用對照（曲妥珠單抗 (Trastuzumab))或K48譜系選擇性抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解物并印跡，以揭示MDM2遍在蛋白 化。D)U7Ub25. 2540AGG在細(xì)胞中的表達(dá)增加了 MDM2翻轉(zhuǎn)（內(nèi)源性USP7抑制的反映）。用 所示構(gòu)建體轉(zhuǎn)染U20S細(xì)胞，用100 μ Μ環(huán)己酰亞胺處理，在所示時間點收集，并用所示抗體 印跡裂解物。E) U7Ub25. 2540 Λ GG在細(xì)胞中的表達(dá)穩(wěn)定化ρ53,隨后上調(diào)ρ53響應(yīng)基因 p21。 用所示表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染U20S或SiHa細(xì)胞，并用所示抗體印跡裂解物。
[0041] 圖15顯示微弱地?fù)饺爰?xì)胞中的多聚遍在蛋白鏈的U7Ub25. 2540 ; U7Ub25. 2540 Λ GG廢除了鏈摻入。用所示表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，并用所示抗體免疫 沉淀裂解物；同種型對照（C)抗體是曲妥珠單抗。
[0042] 圖16顯示，相對于其他細(xì)胞DUB，U7Ub25. 2540與內(nèi)源性USP7和USP5結(jié)合。按所 示轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，并用抗所示蛋白質(zhì)的抗體印跡抗-HA免疫沉淀或細(xì)胞裂解物。
[0043] 圖17顯示U7Ub25. 2540 AGG富集細(xì)胞裂解物中的內(nèi)源性USP7。通過質(zhì)譜法分析 了對應(yīng)于圖14B的抗-HA免疫沉淀。顯示了針對所示DUB檢測到的肽總數(shù)，獨特肽的數(shù)目 顯示在括號中。
[0044] 圖18顯示A)針對USP14的5輪噬菌體淘選后分離的23個噬菌體克隆的序列偏 好。B)蛋白質(zhì)ELISA證明U14Ub對USP14具有增加的親和力，對UCHL3和UCHL1的親和力 具有相應(yīng)的降低。野生型遍在蛋白曲線以藍(lán)色顯示，多種U14Ub以黑色顯示。C)用U14Ub2 和U14Ubl4生物層干涉量度法滴定USP14。兩階段結(jié)合速率的慢成分顯示對U14Ub的濃度 的依賴性，指示誘導(dǎo)契合結(jié)合機(jī)制。4(1通過穩(wěn)態(tài)和動力學(xué)擬合測定的解離常數(shù)相符。
[0045] 圖19顯示U14Ub apo動態(tài)相對于野生型減慢。A)U14Ub對野生型的1H-15N HSQC 光譜中酰胺共振的強(qiáng)度的比值。將該比值對顯示無交換的共振歸一化。插圖顯示將這些比 值標(biāo)示在野生型遍在蛋白的結(jié)構(gòu)（PDB編號lubi)上；最顯著的改變發(fā)生在β 1-β2區(qū)中。 Β)針對U14Ubl4、U14Ub2和野生型遍在蛋白通過Rex測量定量的毫秒（藍(lán)色）和微秒（紅 色）運動。U14Ubl4和U14Ub2圖中的插圖分別顯示ms和ys Rex測量的原始數(shù)據(jù)的實例。 由于交換擴(kuò)大或光譜重疊而缺乏數(shù)據(jù)的共振用X表示。野生型遍在蛋白顯示在這些條件下 無 ms Rex〇
[0046] 圖20顯示遍在蛋白能量景貌的擾動影響USP14結(jié)合的機(jī)制，并產(chǎn)生不能支持體內(nèi) 生長的遍在蛋白變體。A)遍在蛋白結(jié)合可以通過構(gòu)象選擇或誘導(dǎo)契合而發(fā)生。野生型遍 在蛋白的構(gòu)象子態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)換很快，因此分開子態(tài)的能障是適度的。B)U14Ub的運動 比野生型慢得多，通過該途徑的構(gòu)象選擇臂減少流出，并導(dǎo)致結(jié)合機(jī)制由誘導(dǎo)契合主導(dǎo)。C) 盡管它們具有連入Lys48連接鏈的能力，但與人遍在蛋白不一樣，U14Ub不能取代酵母中的 內(nèi)源性遍在蛋白。
[0047] 圖21顯示PDB中的所有Ub-配偶體結(jié)構(gòu)的β l-β 2RMSD的聚類熱圖。按結(jié)果和 方法中所述比對并聚類結(jié)構(gòu)。沿每個軸列出的復(fù)合物為〈PDB編號X遍在蛋白鏈字母>-〈 配偶體鏈字母〉的形式。例如，2ibiB-A表示在PDB編號2ibi中與USP2(鏈Α)結(jié)合的來自 遍在蛋白（鏈B)的β 1-β2環(huán)。
[0048] 圖22顯示來自U14Ub改造實驗的設(shè)計結(jié)果。Α)單狀態(tài)設(shè)計和Β)多狀態(tài)設(shè)計的共 有序列偏好。
[0049] 圖23顯示5種U14Ub和野生型遍在蛋白的分配的4-1? HSQC光譜。突出顯示所 選擇的β 1-β 2區(qū)周圍顯示顯著交換擴(kuò)大的殘基。U14Ubl4顯示最嚴(yán)重的交換擴(kuò)大，與它具 有最大的ms Rex值一致。
[0050] 圖 24 顯不全部 5 種 U14Ub 的 CS-Rosetta 模型。全部 5 種 U14Ub 的 CS-Rosetta 模型（帶狀）與野生型遍在蛋白的CS-Rosetta模型（卡通）重疊。顯示各變體的兩個最 低能量模型。按圖19中的方案給U14Ub涂色：1為紫色，2為藍(lán)色，14為紅色，22為橙色，24 為綠色。各變體的折疊與野生型遍在蛋白不可區(qū)分。
[0051] 圖25顯示所有變體的微秒和毫秒Rex值。在18. 8T和297K測量Rex值。通過50 和950Hz的CPMG場的R2()bs之間的差異來估計各殘基的毫秒R ex。
[0052] 圖26顯示兩種場下的R2分散數(shù)據(jù)的組擬合。對于U14Ubl、U14Ub2和U14Ubl4,將 顯示并未太過雜亂而不可擬合的R 2分散的殘基顯示為定位至野生型遍在蛋白的晶體結(jié)構(gòu) 上的橙色球體。顯示顯著的ms Rex值的殘基在結(jié)構(gòu)中聚在一起。對于U14Ubl和U14Ub2,針 對突出顯示的所有殘基整體獲得Carver Richards方程的擬合。針對U14Ubl4突出顯示殘 基的三個聚類既由于其空間分開而作為獨立的組擬合，也整體擬合，產(chǎn)生相似的k ex值。此 處顯示的U14Ubl4的擬合是對于殘基4、14和15的聚類。
[0053] 圖27顯示用微分靜態(tài)光散射進(jìn)行的U14Ub和野生型遍在蛋白的熱穩(wěn)定性測量，其 顯示沒有一種突變體相對于野生型顯著去穩(wěn)定化。為了清楚而顯示激酶的轉(zhuǎn)換。在至多 81°C (設(shè)備的高溫極限）也未觀察到野生型遍在蛋白和U14Ub的轉(zhuǎn)換。將數(shù)據(jù)對低溫基線 的強(qiáng)度歸一化。
[0054] 圖28顯示生物層干涉量度法滴定擬合至兩階段結(jié)合模型。通過生物層干涉量度 法檢測的U14Ub對USP14的滴定（黑色）良好地擬合至兩階段結(jié)合模型（紅色）。用于測 定的 U14Ub 的濃度為 0· 068、0· 206、0· 618、1· 85、5· 17、16· 7 和 50μ M。
[0055] 圖29顯示來自穩(wěn)態(tài)響應(yīng)和用誘導(dǎo)契合模型擬合的kslOT^^U14Ub的濃度的 作圖的平衡K D。結(jié)合的慢速階段良好地擬合至Hammes等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13737-13741 (2009)所述的誘導(dǎo)契合模型。
[0056] 圖30顯示交叉?？?，表明遍在蛋白狀態(tài)可以區(qū)分USP-和UCH-型脫遍在蛋白 酶。A)各遍在蛋白-脫遍在蛋白酶組合的得分對Ca作圖，各模型的PDB編號在各圖上 方列出。先列出遍在蛋白部分（〈PDB編號〉B)，隨后是脫遍在蛋白酶（〈PDB編號〉A(chǔ))。例 如，2ibiB_2ayoA是來自2ibi(USP2結(jié)合的Ub)的遍在蛋白?？恐羴碜?ayo(USP14)的脫 遍在蛋白酶上，而lxd3B_2ayoA是來自lxd3(UCHL3結(jié)合的Ub)的遍在蛋白，?？恐羴碜?2ayo(USP14)的脫遍在蛋白酶上。按方法中所述制備和?？拷Y(jié)構(gòu)，排除遍在蛋白的C末端 尾，以避免晶體學(xué)偏差。B)圖A中交叉停靠結(jié)果的總結(jié)。將來自各交叉停靠實驗的最低的 5個RMSD平均，并呈現(xiàn)為聚類熱圖。注意，來自USP結(jié)合的遍在蛋白的所有遍在蛋白都更 易于?？恐罸SP-型DUB上（較低的RMSD)，UCH結(jié)合的遍在蛋白更易于停靠至UCH-型DUB 上，但交叉家族?？客ǔ２怀晒?。
[0057] 圖31顯示U14Ub2的晶體結(jié)構(gòu)。A)U14Ub2(藍(lán)色）與野生型遍在蛋白（小麥，TOB 編號：1UBI)的疊加。U14Ub2的總體折疊與野生型一樣，β1-β2區(qū)中的偏差可能是由晶 體包裝引起。Β)色氨酸71包裝入不對稱單元中鄰近分子的疏水核，扭曲β 1-β 2的構(gòu)象。 U14Ub2的結(jié)構(gòu)以與圖Α中相同的取向顯示為表面表示。不對稱單元中的鄰近分子以淺橙色 顯不。
[0058] 圖32顯示摻入K48連接的鏈。顯示通過UBEland cdc34以類似于野生型的程度 摻入K48連接的鏈的U14Ub變體的SDS-Page。U14Ub和野生型遍在蛋白之間的重鏈差異是 由于6xHis標(biāo)記的存在，其尚未從突變體切割。
[0059] 圖33顯示衍生自第二代親和力成熟的U7Ub25的高親和力克隆。術(shù)語"s/n比"指 信號：噪音比，其中"信號"是針對通過包被在384孔Maxisorp板上的NeutrAvidin捕獲的 生物素化USP7catC223A檢測到的斑點噬菌體ELISA信號；"噪音"是針對NeutrAvidin單 獨的ELISA信號。顯示遍在蛋白中的位置編號。
[0060] 圖34顯示通過ELISA測定的U7Ub25親和力成熟變體的親和力排序。
[0061] 圖35顯示生物層干涉量度法滴定（黑色）未擬合至單階段解離模型（紅色）。用 于測定的 U14Ub 的濃度為 0· 068、0· 206、0· 618、1· 85、5· 17、16· 7 和 50μ M。
[0062] 圖36顯示生物層干涉量度法滴定（黑色）擬合至單階段解離模型（紅色）。用于 測定的 U14Ub 的濃度為 0· 068、0· 206、0· 618、1· 85、5· 17、16· 7 和 50μ Μ。
[0063] 發(fā)明詳述
[0064] 本發(fā)明提供可以用來鑒定和/或篩選能夠以高親和力結(jié)合一種或多種結(jié)合配偶 體的構(gòu)象穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法（稱為"構(gòu)象展示"（CD))。與傳統(tǒng)噬菌體展示（其通常突變表 面氨基酸位置來發(fā)現(xiàn)新的焓接觸）不同，CD提供了改變埋藏在蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)內(nèi)的氨基 酸殘基來鑒定產(chǎn)生最佳結(jié)合構(gòu)象的新包裝排列的方法。本申請的方法與之前已在本領(lǐng)域中 實施的方法的不同在于，本文公開的方法提供了調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)構(gòu)象動態(tài)的能量學(xué)的能力，從 而代表了通過調(diào)節(jié)界面動態(tài)來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的親和力和選擇性二者而不 是僅調(diào)節(jié)焓接觸的手段。
[0065] 用CD來鑒定具有定位在遍在蛋白內(nèi)部的氨基酸取代的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，從 而相對于野生型蛋白質(zhì)的主要構(gòu)象狀態(tài)將遍在蛋白的β1_β2環(huán)區(qū)改變?yōu)?下"構(gòu)象。與 野生型遍在蛋白相比，遍在蛋白的這些構(gòu)象穩(wěn)定形式能夠以高得多的親和力結(jié)合遍在蛋白 特異性蛋白酶（USP)家族脫遍在蛋白酶的脫遍在蛋白酶。此外，通過CD產(chǎn)生的構(gòu)象穩(wěn)定的 遍在蛋白可以用作新的工具來鑒定和篩選一種或多種物質(zhì)，該物質(zhì)：1)能夠結(jié)合遍在蛋白 的特定構(gòu)象形式；2)與優(yōu)選結(jié)合遍在蛋白的特定構(gòu)象形式的遍在蛋白加工酶結(jié)合；或3)能 夠破壞USP-脫遍在蛋白酶/遍在蛋白復(fù)合物。
[0066] I. 一般技術(shù)
[0067] 除非另有說明，本發(fā)明的實施將利用分子生物學(xué)（包括重組技術(shù)）、微生物學(xué)、細(xì) 胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)。這類技術(shù)充分闡述 于文獻(xiàn)中，如"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，第 2 版（Sambrook 等，1989); "Oligonucleotide Synthesis"（M.J. Gait 編輯，1984) ;"Animal Cell Culture"（R. I. Freshney 編輯，1987) ;"Methods in Enzymology"（Academic Press, Inc.) ;"Current Protocols in Molecular Biology，'(F.M.Ausubel 等編輯，1987，及定期更新）；"PCR:The Polymerase Chain Reaction"，（Mullis等編輯，1994) ;"APractical Guide to Molecular Cloning"（Perbal Bernard V.，1988)。
[0068] 本發(fā)明中利用或描述的寡核苷酸、多核苷酸、肽、多肽和小分子可以用本領(lǐng)域已知 的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生。
[0069] II.定義
[0070] 在提到分子時，"分離的"指已鑒定并從其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的分子。 其天然環(huán)境的污染成分是干擾診斷或治療用途的物質(zhì)。
[0071] 本文所用的術(shù)語"多肽"包括蛋白質(zhì)、多肽的片段和融合蛋白質(zhì)。
[0072] "活性"多肽或其片段保留了該活性多肽的天然或天然存在的對應(yīng)物的生物活 性。生物活性指由該活性多肽的天然或天然存在的對應(yīng)物介導(dǎo)的功能。例如，結(jié)合或蛋白 質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用構(gòu)成生物活性。
[0073] "親和力"指分子（例如遍在蛋白，如遍在蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定形式）的單個結(jié)合部位 與它的結(jié)合配偶體之間非共價相互作用的總和的強(qiáng)度。除非另有說明，本文所用的"結(jié)合親 和力"指內(nèi)在的結(jié)合親和力，其反映結(jié)合對的成員之間的1:1相互作用。分子X對它的配偶 體Y的親和力一般可通過解離常數(shù)（Kd)來表示。親和力可以通過本領(lǐng)域公知的方法來測 量，包括本文中描述的那些。測量結(jié)合親和力的具體的說明性和示例性實施方案在下文中 描述。
[0074] 術(shù)語"抗體"在本文中以最廣泛的含義使用并涵蓋多種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單 克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）和抗體片段，只要它們顯示希 望的抗原結(jié)合活性。在一些實施方案中，抗體可以是嵌合抗體、人抗體、人源化抗體和/或 親和力成熟抗體。
[0075] "抗體片段"指除完整抗體以外的包含完整抗體的部分的分子，其結(jié)合該完整抗體 所結(jié)合的抗原?？贵w片段的實例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab' -SH、F(ab'）2 ;雙抗體； 線性抗體；單鏈抗體分子（例如scFv);及從抗體片段形成的多特異性抗體。
[0076] 與參考抗體"結(jié)合相同表位的抗體"指在競爭測定中將參考抗體與其抗原的結(jié)合 阻斷50%或更多的抗體，相反，參考抗體在競爭測定中將該抗體與其抗原的結(jié)合阻斷50% 或更多。本文提供示例性競爭測定。
[0077] 術(shù)語"嵌合"抗體指其中部分重鏈和/或輕鏈衍生自特定來源或物種，而重鏈和/ 或輕鏈的其余部分衍生自不同的來源或物種的抗體。
[0078] 抗體的"種類"指其重鏈所具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型。存在五個主要種 類的抗體 ：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，這些種類中的幾種可以進(jìn)一步劃分為亞類（同種型）， 例如IgGp IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2。對應(yīng)于不同種類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱 為 α、δ、ε、γ 和 μ。
[0079] 根據(jù)其恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可將來自任意脊椎動物物種的抗體的輕鏈分配 至稱為κ和λ的兩個明顯不同的類型之一。
[0080] 本文所用的術(shù)語"單克隆抗體"指獲自基本上同質(zhì)的抗體群體的抗體，即除例如包 含天然存在的突變或在產(chǎn)生單克隆抗體制劑的過程中出現(xiàn)的可能的變體抗體（這類變體 通常以較小的量存在）外，包含該群體的單種抗體相同和/或結(jié)合相同表位。與通常包含 抗不同決定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，單克隆抗體制劑中的每種單克 隆抗體抗抗原上的單個決定簇。因此，修飾詞"單克隆"表示抗體獲自基本上同質(zhì)的抗體群 體的特性，而不解釋為需要通過任意特定方法產(chǎn)生抗體。例如，待用于本發(fā)明的單克隆抗體 可以通過多種技術(shù)制備，包括但不限于雜交瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法及利用含有全 部或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物的方法，本文描述用于制備單克隆抗體的這類 方法和其他示例性方法。
[0081] 術(shù)語"嵌合"抗體指其中部分重鏈和/或輕鏈衍生自特定來源或物種，而重鏈和/ 或輕鏈的其余部分衍生自不同來源或物種的抗體。
[0082] "人源化"抗體指包含來自非人高變區(qū)（HVR)的氨基酸殘基和來自人構(gòu)架區(qū)（FR) 的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體將包含至少一個（通常兩個） 可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR (例如CDR)對應(yīng)于非人抗體，而全部 或基本上全部FR對應(yīng)于人抗體的那些。人源化抗體可選地包含至少部分衍生自人抗體的 抗體恒定區(qū)?？贵w（例如非人抗體）的"人源化形式"指已經(jīng)歷人源化的抗體。
[0083] "人抗體"是這樣的抗體，其具有對應(yīng)于由人或人細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的序列或衍生自 利用人抗體庫或其他人抗體編碼序列的氨基酸序列。人抗體的此定義明確排除了包含非人 抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
[0084] "親和力成熟的"抗體指在一個或多個HVR中具有一個或多個改變的抗體，與不具 有這類改變的親本抗體相比，這類改變導(dǎo)致抗體對抗原的親和力的改善。
[0085] "表位標(biāo)記的"多肽指與"標(biāo)記多肽"融合的嵌合抗體。這類標(biāo)記提供可以針對其 制備抗體或可獲得針對其的抗體的表位，但基本上不干擾多肽活性。為了減少抗-標(biāo)記抗 體與內(nèi)源表位的反應(yīng)性，標(biāo)記多肽通常是獨特的。適宜的標(biāo)記多肽通常具有至少6個氨基 酸殘基，通常在約8個和50個氨基酸殘基之間，優(yōu)選在8個和20個氨基酸殘基之間。附加 表位序列的實例包括來自流感病毒Α的ΗΑ、⑶和c-myc、poly-His和FLAG。
[0086] 本文中可互換使用的"多核苷酸"或"核酸"指任意長度的核苷酸聚合物，且包括 DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基、和/或其類 似物，或可以通過DNA或RNA聚合酶或通過合成反應(yīng)摻入聚合物中的任意底物。如果存在， 對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在組裝聚合物之前或之后進(jìn)行。核苷酸的序列可以由非核苷酸成 分中斷。多核苷酸可以在合成后進(jìn)一步修飾，如通過與標(biāo)記綴合。其他類型的修飾包括例 如"帽"，用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸，核苷酸間修飾，例如具有不帶電荷的 連接（例如磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等）和具有帶電荷的連接（例如硫代 磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的那些，包含懸垂部分（例如蛋白質(zhì)（例如核酸酶、毒素、抗體、 信號肽、聚-L-賴氨酸等））的那些，具有嵌入劑（例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等）的那些，包含螯 合劑（例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等）的那些，包含烷化劑的那些，具有修飾連 接的那些（例如α異頭核酸等），以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖中的 任意羥基可以例如通過膦酸基團(tuán)、磷酸基團(tuán)取代，通過標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或活化以制備與 附加核苷酸的附加連接，或可以綴合至固體或半固體支持物。5'和3'端0Η可以磷酸化或 用1至20個碳原子的胺或有機(jī)帽化基團(tuán)部分取代。其他羥基也可以衍生至標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。 多核苷酸還可以包含本領(lǐng)域公知的核糖或脫氧核糖的類似物形式，包括例如2' -0-甲基-、 2' -〇_烯丙基、2' -氟-或2' -疊氮基-核糖，碳環(huán)糖類似物，α -異頭糖，差向異構(gòu)糖如阿 拉伯糖、木糖或來蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，無環(huán)類似物和無堿基核苷類似物如甲 基核苷?？梢杂脗溥x的連接基團(tuán)取代一個或多個磷酸二酯鍵。這些備選的連接基團(tuán)包括但 不限于其中用？(〇)3("硫代"）、？(5)5("二硫代"）、（0)順2("酰胺"）、？(0)1^(0)(?'、0) 或CH2( "formacetal"）取代磷酸的實施方案，其中每個R或R'獨立地是Η或可選地包含 醚（-〇-)鍵的取代或未取代的烷基（1-20C)、芳基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或araldyl。多核 苷酸中的所有鍵無需相同。前面的描述適用于本文提到的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。 [0087] 本文所用的"寡核苷酸"泛指短的、通常為單鏈、通常為合成的多核苷酸，其長度通 常但并非必然小于約200個核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸"和"多核苷酸"并非相互排斥。上文 針對多核苷酸的描述同等地和完全地適用于寡核苷酸。
[0088] 本文在蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域的背景中所用的"運動"或"動態(tài)"指蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì) 區(qū)域的結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象變化。
[0089] 本文所用的"構(gòu)象動態(tài)蛋白質(zhì)"指能夠進(jìn)行一種或幾種運動的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū) 域。
[0090] 在本文中使用時，"構(gòu)象穩(wěn)定的"指且包括任意蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域，其就野生型 蛋白質(zhì)而言發(fā)生改變，使得它與野生型蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域相比經(jīng)歷較少的運動。例如，可 以通過R 2分散實驗（對毫秒時間尺度上的運動敏感）和/或HZNZ RiL測量（對微秒時間 尺度上的運動敏感）來測量蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象穩(wěn)定性程度。
[0091] 在本文中使用時，"構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白"指且包括任意遍在蛋白，就β 1_β 2環(huán)區(qū) 的運動而言，與野生型遍在蛋白中此區(qū)域的運動相比，其以一種或多種構(gòu)象狀態(tài)存在。
[0092] 術(shù)語"野生型遍在蛋白"在本文中指天然序列遍在蛋白多肽。本文所述的遍在蛋 白多肽可以是從多種來源（如從人組織類型或從另一來源）分離或通過重組或合成方法制 備的遍在蛋白多肽。"天然序列遍在蛋白多肽"包含具有與對應(yīng)的衍生自自然界的遍在蛋白 多肽相同的氨基酸序列的多肽。
[0093] 本文所用的定位在蛋白質(zhì)"內(nèi)部"的氨基酸殘基意指不處于蛋白質(zhì)表面的氨基酸 殘基?？梢酝ㄟ^例如溶劑可及性研究、X射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)、NMR結(jié)構(gòu)或基于一級氨基酸序列 的預(yù)測來確定氨基酸殘基是否定位在蛋白質(zhì)表面。
[0094] "突變"包括確定的一級氨基酸序列中至少一個氨基酸的氨基酸缺失、氨基酸插入 和氨基酸取代。在一些方面，一級氨基酸序列中一個或多個氨基酸的突變可以導(dǎo)致由該氨 基酸序列編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)具有改變的活性或表達(dá)水平。在其他方面，一級氨基酸序 列中一個或多個氨基酸的突變（如保守性突變）可以不導(dǎo)致由該氨基酸序列編碼的蛋白質(zhì) 在細(xì)胞內(nèi)具有活性或表達(dá)水平的實質(zhì)性改變。
[0095] 氨基酸"取代"意指用另一氨基酸取代確定的一級氨基酸序列的至少一個氨基酸 成分。本文所用的"包含A n(x、y或z)的取代的蛋白質(zhì)"意指就確定的氨基酸序列而言包 含定位在位置η的氨基酸殘基取代的蛋白質(zhì)，用X、y或z取代野生型氨基酸殘基。
[0096] "小分子"指具有例如小于約5kD、小于約4kD和小于0. 6kD的分子量的組合物。
[0097] 術(shù)語"肽"通常指通過肽鍵連接的氨基酸的連續(xù)和相對短的序列。通常，但并非必 然，肽具有約2至約50個氨基酸、約4-40個氨基酸或約10-30個氨基酸的長度。雖然術(shù)語 "多肽"通常指更長形式的肽，但兩個術(shù)語在本文中在某種程度可互換使用。
[0098] 術(shù)語"氨基酸"和"殘基"在本文中可互換使用。
[0099] 多肽的"區(qū)域"是2個或多個氨基酸的連續(xù)序列。在一些實施方案中，區(qū)域至少約 為3、5、10、15個連續(xù)氨基酸中的任一個。"C端區(qū)域"或其變體指包含最靠近多肽的C端定 位的1-5個殘基的多肽區(qū)域。"N端區(qū)域"或其變體指包含最靠近多肽的N端定位的1-5個 殘基的多肽區(qū)域。多肽的"內(nèi)部"區(qū)域指既不定位在多肽的N端也不定位在多肽的C端的 多肽區(qū)域。
[0100] 就參考多肽序列而言的"百分比（％)氨基酸序列同一性"定義為在比對序列并在 必要時引入缺口來達(dá)到最大百分比序列同一性，而不將任意保守取代視為序列同一性的部 分之后，候選序列中與參考多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。可以以 本領(lǐng)域技術(shù)之內(nèi)的多種方式來達(dá)到以測定百分比氨基酸序列同一性為目的的比對，例如， 使用公開可得的計算機(jī)軟件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以確定用于比對序列的適當(dāng)參數(shù)，包括在所比較的序列的全長內(nèi)達(dá)到最大比對 所需的任意算法。但是，為了本文的目的，用序列比較計算機(jī)程序ALIGN-2來產(chǎn)生％氨基酸 序列同一'丨生值。ALIGN-2序列比較計算機(jī)程序由Genentech, Inc.編寫，源代碼已隨用戶文 件提交美國版權(quán)辦公室，Washington D. C.，20559,它在美國版權(quán)辦公室注冊在美國版權(quán)注 冊號TXU510087之下。ALIGN-2程序從Genentech, Inc.，South San Francisco, California 公開可得，或者可以從源代碼編譯。ALIGN-2程序應(yīng)編譯用在UNIX操作系統(tǒng)上，包括數(shù)字 UNIX V4.0D。所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設(shè)定且不變動。
[0101] 在利用ALIGN-2來進(jìn)行氨基酸序列比較的情況下，按以下計算給定氨基酸序列A 與給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性（其可以備選地敘述為，具有或包含與給定氨 基酸序列B的某％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A):
[0102] 100乘以分?jǐn)?shù)X/Y
[0103] 其中X是在該程序的A和B的比對中通過序列比對程序ALIGN-2評分為相同的匹 配的氨基酸殘基的數(shù)目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)理解，在氨基酸序列A的 長度不等于氨基酸序列B的長度時，A與B的％氨基酸序列同一性將不等于B與A的％氨 基酸序列同一性。除非明確地另有說明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是用 ALIGN-2計算機(jī)程序按前一段落中所述獲得。
[0104] "融合蛋白質(zhì)"指具有共價連接在一起的兩個部分的多肽，其中每個部分衍生自不 同的蛋白質(zhì)。兩個部分可以通過單個肽鍵直接連接或通過包含一個或多個氨基酸殘基的肽 接頭連接。通常，兩個部分和接頭將相互符合讀框，并用重組技術(shù)產(chǎn)生。
[0105] "障礙"或"病理性病癥"是將從本發(fā)明的物質(zhì)/分子或方法的治療受益的任意病 癥。這包括慢性和急性障礙或疾病，包括使哺乳動物易患所討論的障礙的那些病理性病癥。 本文中的待治療的障礙的非限制性實例包括惡性和良性腫瘤；淋巴惡性腫瘤；神經(jīng)元、膠 質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞、下丘腦和其他腺體、巨噬細(xì)胞、上皮、基質(zhì)和囊胚腔障礙；炎性、免疫性和 其他血管發(fā)生相關(guān)障礙。
[0106] 本文所用的"治療"（及其語法變形）指改變所治療的個體的自然過程的嘗試中的 臨床干預(yù)，且可以為了預(yù)防而進(jìn)行或在臨床病理的過程中進(jìn)行。希望得到的治療作用包括 但不限于防止疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、減少疾病的任意直接或間接的病理結(jié)果、防止 轉(zhuǎn)移、降低疾病進(jìn)展的速率、改善或緩和疾病狀態(tài)及消退或改善的預(yù)后。
[0107] 術(shù)語"抗癌療法"指用于治療癌癥的療法。抗癌治療劑的實例包括但不限于例如化 療劑、生長抑制劑、細(xì)胞毒劑、用于放射療法的藥劑、抗血管發(fā)生劑、凋亡劑、抗微管蛋白劑， 及治療癌癥的其他藥劑、抗-⑶20抗體、血小板衍生生長因子抑制劑（例如Gleevec?(甲 磺酸伊馬替尼（Imatinib Mesylate)))、C0X_2抑制劑（例如塞來昔布（celecoxib))、干擾 素、細(xì)胞因子、結(jié)合一種或多種以下靶標(biāo)roGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA受體、TRAIL/Apo2的 拮抗劑（例如中和抗體）及其他生物活性劑和有機(jī)化學(xué)劑等。本發(fā)明還包括其組合。
[0108] 本文所用的術(shù)語"細(xì)胞毒劑"指抑制或阻止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞的破 壞的物質(zhì)。該術(shù)語旨在包括放射性同位素（例如At 211、I131、I125、Y9°、Re186、Re 188、Sm153、 Bi212、P32和Lu的放射性同位素），化療劑，例如氨甲喋呤、阿霉素、長春花生物堿（長春 花新堿（vincristine)、長春滅癌堿（vinblastine)、依托泊苷（etoposide))、多柔比星 (doxorubicin)、苯丙氨酸氮芥（melphalan)、絲裂霉素 C、苯丁酸氮芥（chlorambucil)、柔 紅霉素（daunorubicin)或其他嵌入劑，酶及其片段，如核溶解酶，抗生素，及毒素，如細(xì)菌、 真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體，及下文公開的 多種抗腫瘤或抗癌劑。下文描述其他細(xì)胞毒劑。殺腫瘤劑引起腫瘤細(xì)胞的破壞。
[0109] "化療劑"指用于治療癌癥的化合物。化療劑的實例包括：烷化劑，如噻替 派（thiotepa)和環(huán)磷酰胺（CYTOXAN?);燒基磺酸鹽，如白消安（busulfan)、 英丙舒凡（improsulfan)和哌酰硫燒（piposulfan);氮丙陡，如benzodopa、卡波醌 (carboquone)、meturedopa 和 uredopa ;氮丙陡和 methylamelamine，包括六甲蜜胺 (altretamine)、三亞胺嗪（triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰 胺和 trimethylolomelamine ;多聚乙醜（acetogenin)(尤其是番蒸枝內(nèi)酯（bullatacin) 和布拉它辛酮（bul latacinone)) ; δ -9-四氫大麻酚（屈大麻酚（dronabinol)， MARINOL? ) ; β -拉帕醌（beta-lapachone);拉帕醇（lapachol);秋水仙喊；枠木 酸；喜樹堿（包括合成類似物拓?fù)涮婵担╰opotecan) (HYCAM_n：V?)、CPT-11 (伊 立替康（irinotecan)，CAMPTOSAR?)、乙酰喜樹堿、莨菪亭（scopolectin)和 9-氨基喜樹堿）；苔蘚抑素（bryostatin) ;callystatin ;CC-1065 (包括其阿多來新 (adozelesin)、卡折來新（carzelesin)和比折來新（bizelesin)合成類似物）；鬼臼毒素； 鬼白酸；替尼泊音（teniposide) ;cryptophycin (尤其是 cryptophycin 1 和 cryptophycin 8);多拉司他汀（dolastatin) ;duocarmycin(包括合成類似物 KW-2189 和 CB1-TM1); eleutherobin ;pancratistatin ;sarcodictyin ;spongistatin ;氮芥，如苯丁 酸氮芥、萘 氮芥（chlornaphazine)、氯憐酉先胺（chlorophosphamide)、憐雌氮芥（estramustine)、 異環(huán)憐酸胺（ifosfamide)、氮芥（mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥（mechlorethamine oxide hydrochloride)、苯丙氨酸氮芥、新氮芥（novembichin)、膽固醇對苯乙酸氮 芥（phenesterine)、松龍苯芥（prednimustine)、氯乙環(huán)憐酸胺（trofosfamide)、尿 啼陡氮芥（uracil mustard);亞硝脲（nitrosourea)，如卡莫司?。╟armustine)、氯 脲菌素（chlorozotocin)、福莫司汀（fotemustine)、洛莫司汀（lomustine)、尼莫司 ?。╪imustine)和雷莫司汀（ranimnustine);抗生素，如 enediyne antibiotics (例 如棘孢霉素，尤其是棘孢霉素 Yll和棘孢霉素 ΩΙ1(見例如Nicolaou等，Angew. Chem Intl.Ed.Engl.，33:183-186(1994)) ;CDP323, 口服 α-4 整聯(lián)蛋白抑制劑；蒽環(huán)類抗生 素（dynemicin)，包括蒽環(huán)類抗生素 A ;esperamicin ;以及新制癌菌素色基和相關(guān)色蛋白 enediyne抗生素色基）、阿克拉霉素（aclacinomycin)、放線菌素、authramycin、重氮絲氨 酸（azaserine)、博來霉素、放線菌素 C、carabicin、洋紅霉素、嗜癌素（carzinophilin)、 色霉素（chromomycin)、更生霉素（dactinomycin)、柔紅霉素、地托比星（detorubicin)、 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星（包括ADRIAMYCIN?、嗎啉基-多 柔比星、氰基嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液 (DOXIL?)、脂質(zhì)體多柔比星tlc d-9<MYOCET⑩)、聚乙二醇化脂質(zhì)體多柔比星 .(CAELYX?)和脫氧多柔比星）、表柔比星（epirubicin)、依索比星（esorubicin)、 伊達(dá)比星（idarubicin)、麻西羅霉素（marcellomycin)、絲裂霉素（如絲裂霉素 C)、 霉酚酸、諾加霉素（nogalamycin)、橄欖霉素（olivomycin)、派來霉素（peplomycin)、 泊非霉素（porfiromycin)、_呤霉素（puromycin)、三鐵阿霉素（quelamycin)、羅多 比星（rodorubicin)、鏈黑菌素（streptonigrin)、鏈唑霉素（streptozocin)、殺結(jié) 核菌素（tubercidin)、烏苯美司（ubenimex)、新制癌菌素（zinostatin)、佐柔比星 (zorubicin);抗代謝劑，如氨甲碟呤、吉西他濱（gemcitabine) (GEMZL4R?)、替 加氟（tegafur) (UFTORAIJ?)、卡培他濱（capecitabine) (XELODA?)、埃坡 霉素（epothilone)和5-氟尿啼陡（5-FU);葉酸類似物，如二甲葉酸（denopterin)、 氨甲碟呤、蝶酰三谷氨酸（pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate) ; _呤類似 物，如氟達(dá)拉濱（fludarabine)、6_巰基票呤、硫咪票呤（thiamiprine)、硫鳥票呤 (thioguanine);啼陡類似物，如鹽酸環(huán)胞苷（ancitabine)、氮雜胞苷（azacitidine)、 6-氮尿苷（6-azauridine)、卡莫氟（carmofur)、阿糖胞苷（cytarabine)、雙脫氧 尿苷（dideoxyuridine)、去氧氟脈苷（doxifluridine)、依諾他賓（enocitabine)、 去氧氟脲苷（floxuridine);雄激素，如卡普睪酮（calusterone)、丙酸甲雄焼酮 (dromostanolone propionate)、環(huán)硫雄酉享（epitiostanol)、美雄焼（mepitiostane)、睪 內(nèi)酯（testolactone);抗腎上腺素（anti-adrenal)，如氨魯米特（aminoglutethimide)、 米托坦（mitotane)、曲洛司坦（trilostane);葉酸補(bǔ)充劑，如frolinic acid ;醋葡 內(nèi)酯（aceglatone);醒磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿啼陡（eniluracil);安吖陡 (amsacrine) ;bestrabucil ;比生群（bisantrene);依達(dá)曲沙（edatraxate);地憐酉先 胺（defofamine);秋水仙胺（demecolcine);地卩丫醌（diaziquone) ;elfornithine;醋 酸輕卩比咔唑（elliptinium acetate) ;epothilone;乙環(huán)氧陡（etoglucid);硝酸嫁；輕 基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明（lonidainine);美登木素生物堿，如美登素和美登木素柄型 菌素；米托月瓜月宗（mitoguazone);米托蔥酉昆（mitoxantrone) ；mopidanmol ；nitraerine ； 噴司他丁（pentostatin);蛋氨氮芥（phenamet);卩比柔比星（pirarubicin);洛索蒽 醌（losoxantrone) ;2_ethylhydrazide;甲基節(jié)餅（procarbazine) ; PSK? 多糖復(fù)合 物（JHS Natural Products，Eugene，OR);丙亞胺（razoxane);根霉素（rhizoxin);西佐 喃（sizofiran);螺旋鍺（spirogermanium);細(xì)格孢氮雜酸（tenuazonic acid);三亞胺 醌（triaziquone) ;2, 2'，2"-三氯三乙胺；單端孢霉烯（trichothecene)(尤其是T-2 毒素 、verracurin Α、桿抱菌素（roridin)A 和 anguidine);烏拉坦（urethan);長春喊 酉先胺（vindesine) (ELDISINE? % F1LDES1N馨）；達(dá)卡巴曝（dacarbazine); 甘露莫司?。╩annomustine);二溴甘露醇（mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇（mitolactol); 溴丙哌嗪（pipobroman) ;gacytosine ;阿糖胞苷（arabinoside) ( "Ara_C"）；噻替派 (thiotepa) ;taxoid，例如紫杉醇（paclitaxel) (TAXOL?)、紫杉醇的清蛋白改造納米 顆粒制劑（ABRAXANE?)和 doxetaxel (TA.XOTERE?>; chloranbucil ;6_ 硫鳥噪呤； 巰基噪呤；氨甲碟呤；鉬藥劑，如順鉬、奧沙利鉬（oxaliplatin)(例如ELOXATIN? )和卡鉬；vincas，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括長春滅瘟堿（VELBAN?)、 長春花新堿（ONCOViN?)、長春堿酰胺（ELMSINE?、F1LDESIN?):和 長春瑞濱（vinorelbine) (NAVELB丨.NE?);依托泊苷（VP-16);異環(huán)磷酰胺；米 托蒽醌；亞葉酸（leucovorin);諾消靈（novantrone);依達(dá)曲沙（edatrexate);柔 紅霉素；氨基喋呤；伊班磷酸鹽（ibandronate);拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000 ;二 氟甲基鳥氨酸（DMF0);類視黃醇，如視黃酸，包括貝沙羅?。═AKCRtynN?); 二膦酸鹽，如氯膦酸二鈉（例如，BONEFOSi)或OSTAC? )、依替膦酸鈉 (etidronate) (Ι)ΙΙ)ΚΧ)〇ΑΙ_:..Β))、NE-58095、唑來勝酸（zoledronic acid)/唑來勝酸鹽 (zoledronate) (ZOMETA?)、阿侖膦酸鈉 (alendronate) (FOSAMAX?)、氨 輕二憐酸二鈉（pamidronate) (AREDIA?)、替魯膦酸鈉（tiludronate) (SICELjID?) 或利塞勝酸鈉（risedronate) (ACTONEL?);曲沙他濱（troxacitabine) (1，3_ 二 氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物）；反義寡核苷酸，尤其是抑制涉及異常細(xì)胞增殖的信號傳 導(dǎo)途徑中的基因（例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體（EGF-R))的表達(dá)的 那些；疫苗，如THERATOPE?疫苗和基因療法疫苗，例如AIXOVECTIN⑩ 疫苗、LEUVECT丨N?疫苗和VAXID?疫苗；拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑（例如 LURTOTECAN? ) ;rmRH(例如 ABAREL1X⑩）；BAY439006(索拉非尼 (sorafenib) ;Bayer) ;SU_11248 (舒尼替尼（sunitinib), SUTENT?，Pfizer);哌立 福新（perifosine)，C0X-2抑制劑（例如塞來昔布或etoricoxib)，蛋白體抑制劑（例 如 PS341);波替單抗（bortezomib) (VELCADE?) ; CCI-779 ;tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510 ;Bcl_2 抑制劑，如 oblimersen 鈉鹽（GENASENSE?);匹克生瓊 (pixantrone) ;EGFR抑制劑（見下文定義）；酪氨酸激酶抑制劑（見下文定義）；絲氨酸-蘇 氨酸激酶抑制劑，如雷帕霉素（西羅莫司（sirolimus)，RAPAMUNE?);法尼基轉(zhuǎn)移 酶抑制劑，如l〇nafarnib(SCH 6636, SARASARTM);以上任一種的可藥用鹽、酸或衍生物；以 及以上兩種或多種的組合，如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春花新堿和強(qiáng)的松龍的聯(lián)合治 療的縮寫）和F0LF0X (奧沙利鉬（EL0XATIN?)與5-FU和亞葉酸組合的治療方案的縮寫）。 [0110] 本文定義的化療劑包括"抗激素劑"或"內(nèi)分泌治療劑"，其發(fā)揮作用來調(diào)節(jié)、減 少、阻斷或抑制可促進(jìn)癌癥生長的激素的作用。它們本身可以是激素，包括但不限于：具有 混合的激動劑/拮抗劑譜的抗雌激素,包括他莫昔芬（tamoxifen) (NOLVADEX?)、 4-輕基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen)、托瑞米芬（toremifene) (FARESTON?)、艾 多昔芬（idoxifene)、屈洛昔芬（droloxifene)、雷洛昔芬（raloxifene) (EVISTA?)、 曲沃昔芬（trioxifene)、鹽酸雷洛昔芬（keoxifene)和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑 (SERM)，如SERM3 ;無激動劑特性的純抗雌激素，如fulvestrant (FASLODEX?)和 EM800(這類藥劑可以阻斷雌激素受體（ER)二聚化，抑制DNA結(jié)合，增加 ER翻轉(zhuǎn)，和/或 抑制ER水平）；芳香酶抑制劑，包括類固醇芳香酶抑制劑，如福美坦（formestane)和 依西美坦（exemestane) (A ROM AS丨：S?)，及非類固醇芳香酶抑制劑，如阿那曲唑 (anastrazole) (ARiMIDEX?)、來曲唑（letrozole) (FEMAJRA?)和氛魯米特 (aminoglutethimide)，及其他芳香酶抑制劑，包括伏氯唑（vorozole) (MVISOR?)、 醋酸甲地孕酮（megestrol acetate) (MEGASE?)、法倔唑（fadrozole)和 4(5)-咪 唑；促黃體激素釋放激素激動劑，包括醋酸亮丙瑞林（leuprolide) (UJPRON⑩和 E3LIGARJD? )、戈舍瑞林（goserelin)、布舍瑞林（buserelin)和 tripterelin ;性類固 醇，包括progestine，如醋酸甲地孕酮和醋酸甲輕孕酮（medroxyprogesterone acetate)， 雌激素，如己烯雌酚（diethylstilbestrol)和馬雌激素（premarin)，及雄激素/類視黃 醇，如氟輕甲睪酮（fluoxymesterone)、全反式維甲酸和芬維A胺（fenretinide);奧那司酮 (onapristone);抗孕酮；雌激素受體下調(diào)劑（ERD);抗雄激素，如氟他胺（flutamide)、尼魯 米特（nilutamide)和比卡米特（bicalutamide);及以上任一種的可要用鹽、酸或衍生物； 以及以上兩種或多種的組合。
[0111] 本申請中所用的術(shù)語"前體藥物"指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生形式，與親本 藥物相比，其對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，且能夠通過酶激活或轉(zhuǎn)化為更具活性的親本 形式。見例如 Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy，'Biochemical Society Transactions, 14, 375-382頁，615th Meeting Belfast(1986);和Stella等，"Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,，'Directed Drug Delivery, Borchardt 等，（編輯），247-267頁，Humana Press (1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于：包含磷 酸的前體藥物、包含硫代磷酸的前體藥物、包含硫酸的前體藥物、包含肽的前體藥物、D-氨 基酸修飾的藥物、糖基化的前體藥物、包含β-內(nèi)酰胺的前體藥物、包含可選地取代的苯氧 乙酰胺的前體藥物或包含可選地取代的苯乙酰胺的前體藥物、5-氟胞嘧啶及可以轉(zhuǎn)化為更 具活性的細(xì)胞毒性游離藥物的其他5-氟胞嘧啶前體藥物?？梢匝苌鸀橛糜诒景l(fā)明的前體 藥物形式的細(xì)胞毒性藥物的實例包括但不限于上文所述的那些化療劑。
[0112] 在本文中使用時，"生長抑制劑"指抑制細(xì)胞生長的化合物或組合物。生長 抑制劑的實例包括阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程（在S期以外的地方）的藥劑，如誘導(dǎo)G1阻滯 和Μ期阻滯的藥劑。經(jīng)典的Μ期阻斷劑包括長春堿（例如長春花新堿和長春滅瘟堿）、 紫杉烷（taxane)及諸如多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、依托泊苷和博來霉素的拓?fù)?異構(gòu)酶II抑制劑。阻滯G1的那些藥劑也涉及S期阻滯，例如DNA烷化劑，如他莫昔 芬、強(qiáng)的松、達(dá)卡巴嗪、氮芥、順鉬、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。其他信息可以 見于 The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn 和 Israel,編輯，第 1 章，標(biāo)題 ''Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs^by Murakami 等(WB Saunders:Philadelphia, 1995)，尤其是第13頁。紫杉燒（紫杉醇和紫杉廠（docetaxel)) 二者都是衍生自紫杉的抗癌藥物。衍生自歐洲紫杉的紫杉廠（TAXOTERE?, Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇（_IAXOL?，Bristol-Myers Squibb)的半合成類似 物。紫杉醇和紫杉萜促進(jìn)從微管蛋白二聚體組裝微管，并通過阻止解聚來穩(wěn)定微管，這導(dǎo)致 細(xì)胞有絲分裂的抑制。
[0113] "放射療法"意指用定向的Y射線或β射線來誘導(dǎo)對細(xì)胞的足夠損傷，以限制其 正常執(zhí)行功能的能力或完全破壞細(xì)胞。應(yīng)理解，將存在本領(lǐng)域已知的許多方式來確定處理 的劑量和持續(xù)時間。典型的處理作為一次性施用提供，典型的劑量在每天10至200單位 (Gray)范圍內(nèi)。
[0114] 藥劑（例如藥物制劑）的"有效量"指對在必要的劑量和時間下達(dá)到希望的治療 或預(yù)防結(jié)果有效的量。本發(fā)明的物質(zhì)/分子、激動劑或拮抗劑的"治療有效量"可以根據(jù)諸 如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重、物質(zhì)/分子、激動劑或拮抗劑在個體中引出希望的 反應(yīng)的能力的因素而變。治療有效量還是這樣的量，其中物質(zhì)/分子、激動劑或拮抗劑的治 療有益作用超過了任意毒性作用或有害作用。"預(yù)防有效量"指對在必要的劑量和時間下達(dá) 到希望的預(yù)防結(jié)果有效的量。通常但并非必然，由于預(yù)防性劑量是在疾病之前或疾病的早 期階段用于個體，預(yù)防有效量將低于治療有效量。
[0115] 術(shù)語"藥物制劑"指這樣的制劑，其處于這樣的形式，使得允許包含在其中的活性 成分的生物學(xué)活性有效，且其不包含對將施用該制劑的個體具有不可接受的毒性的附加成 分。
[0116] "可藥用載體"指藥物制劑中除活性成分外的成分，其對個體無毒性?？伤幱幂d體 的實例包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。
[0117] "個體"或"受試者"是哺乳動物。哺乳動物包括但不限于家養(yǎng)動物（例如牛、綿羊、 貓、狗和馬）、靈長類（例如人類和非人靈長類，如猴）、兔和嚙齒類（例如小鼠和大鼠）。在 某些實施方案中，該個體或受試者是人。
[0118] 用術(shù)語"包裝說明書"來指通常包含在治療性產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說明，其包含關(guān) 于適應(yīng)癥、用途、劑量、施用、組合療法、禁忌癥的信息和/或關(guān)于這類治療性產(chǎn)品的用途的 敬生 目R 〇
[0119] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，本文提到"約"某個值或參數(shù)包括（和描述）指向該值 或參數(shù)本身的實施方案。例如，提到"約X"的描述包括"X"的描述。
[0120] 應(yīng)理解，本文所述的本發(fā)明的方面和實施方案包括"由方面和實施方案組成"和/ 或"基本由方面和實施方案組成"。除非另有說明，本文所用的單數(shù)形式"一"、"一個"和"該" 包括復(fù)數(shù)指代物。
[0121] III.本發(fā)明的組合物
[0122] 本文提供相對于野生型遍在蛋白的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸取代的構(gòu) 象穩(wěn)定的遍在蛋白。在一些方面，與野生型遍在蛋白與遍在蛋白加工酶的結(jié)合親和力相比， 該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白顯示提高的與一種或多種遍在蛋白加工酶（如但不限于遍在蛋白 特異性蛋白酶（USP)家族脫遍在蛋白酶的一個或多個成員）的結(jié)合親和力。在一些方面， 如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白中β?/β 2環(huán)區(qū)的動態(tài)相比，該構(gòu)象穩(wěn)定的 遍在蛋白的此區(qū)域顯示更慢的構(gòu)象動態(tài)。本文還提供編碼該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的核酸， 用于表達(dá)和分離該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的載體和細(xì)胞，以及包含構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白和以 高親和力結(jié)合遍在蛋白的特定構(gòu)象形式的結(jié)合配偶體的蛋白復(fù)合物。
[0123] Α.構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白
[0124] 在一些方面，本文所述的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以納摩爾范圍內(nèi)的Kd與結(jié)合配偶 體（例如USP家族脫遍在蛋白酶）結(jié)合。在一些方面，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以比野生型 蛋白質(zhì)的親和力高至少1000倍的親和力與結(jié)合配偶體（例如USP家族脫遍在蛋白酶，如 USP7)結(jié)合。在一些方面，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白抑制一種或多種遍在蛋白加工酶或脫遍在 蛋白酶的活性。在一些方面，與野生型蛋白質(zhì)的結(jié)合相比，該構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白顯示與結(jié) 合配偶體（例如UCH家族脫遍在蛋白酶的成員）無結(jié)合或具有減少的結(jié)合。
[0125] 在一些實施方案中，本文公開的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與結(jié)合配偶體（例如USP家 族脫遍在蛋白酶）具有通過Kd測定的小于約1. 0mM、500 μ M、100 μ Μ、50 μ Μ、25 μ M、10 μ M、 5μ Μ、1μΜ、900ηΜ、800ηΜ、700ηΜ、600ηΜ、500ηΜ、400ηΜ、300ηΜ、200ηΜ、150ηΜ、100ηΜ、90ηΜ、 80ηΜ、70ηΜ、60ηΜ、50ηΜ、45ηΜ、40ηΜ、35ηΜ、30ηΜ、25ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、ΙΟηΜ、5ηΜ 或 ΙηΜ (包含，包 括這些數(shù)字之間的任意值）中的約任一個的結(jié)合親和力。在一些實施方案中，該結(jié)合配偶 體是遍在蛋白加工酶，如但不限于任意Ε1、Ε2或Ε3遍在蛋白加工酶或脫遍在蛋白酶。在一 些實施方案中，該結(jié)合配偶體是USP家族脫遍在蛋白酶的成員（如但不限于USP7、USP5和 /或USP14)。在一些實施方案中，通過本領(lǐng)域已知的任意方法（尤其是本文所述的方法） 來測定結(jié)合親和力。
[0126] 在一些方面，與結(jié)合配偶體與野生型遍在蛋白的結(jié)合相比，本文公開的構(gòu)象穩(wěn)定 的遍在蛋白以更高的親和力與結(jié)合配偶體結(jié)合。在一些方面，與結(jié)合配偶體與野生型遍 在蛋白的結(jié)合相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以高至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、 6000、7000、8000、9000或10,000(包含，包括這些數(shù)字之間的任意值）倍中任一個的親和 力與結(jié)合配偶體結(jié)合。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是遍在蛋白加工酶，如但不限于任意 E1、E2或E3遍在蛋白加工酶或脫遍在蛋白酶。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是USP家族 脫遍在蛋白酶的成員（如但不限于USP7、USP5和/或USP14)。在一個實施方案中，結(jié)合配 偶體是USP7。在一些實施方案中，通過本領(lǐng)域已知的任意方法（尤其是本文所述的方法） 來測定結(jié)合倍數(shù)親和力。
[0127] 在一些方面，與野生型蛋白質(zhì)的結(jié)合相比，本文提供的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白顯示 與結(jié)合配偶體無結(jié)合或具有減少的結(jié)合。在一些實施方案中，與結(jié)合配偶體與野生型遍 在蛋白的結(jié)合相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以減少至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、 6000、7000、8000、9000或10, 000 (包含，包括這些數(shù)字之間的任意值）倍中任一個的親和力 與結(jié)合配偶體結(jié)合。在一些實施方案中，與結(jié)合配偶體與野生型遍在蛋白的結(jié)合相比，構(gòu)象 穩(wěn)定的遍在蛋白以低至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包含，包括這些值之間的任意百分 比）中任一個的親和力與結(jié)合配偶體結(jié)合。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白不與 結(jié)合配偶體結(jié)合。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是遍在蛋白加工酶，如但不限于任意E1、 E2或E3遍在蛋白加工酶或脫遍在蛋白酶。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是UCH家族脫 遍在蛋白酶的成員。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，本文提供的構(gòu)象穩(wěn)定的遍 在蛋白顯示與UCH家族脫遍在蛋白酶的成員無結(jié)合或具有減少的結(jié)合，同時顯示增加的與 USP家族脫遍在蛋白酶的成員的結(jié)合。在一些實施方案中，通過本領(lǐng)域已知的任意方法（尤 其是本文所述的方法）來測定通過Kd測定的結(jié)合親和力。
[0128] 在另一方面，本文提供的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白抑制（例如完全抑制）一種或多種 遍在蛋白加工酶或一種或多種脫遍在蛋白酶的活性。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋 白引起的這些酶的抑制相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白使一種或多種遍在蛋白加工酶（如但不 限于El、E2或E3遍在蛋白加工酶）或一種或多種脫遍在蛋白酶的活性抑制約5%、10%、 15 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %, 90%、95%或100% (包含，包括這些值之間的任意百分比）中的任一個。在一些實施方 案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白不能摻入多聚遍在蛋白鏈或單遍在蛋白化靶蛋白。在一些實施 方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白能夠摻入多聚遍在蛋白鏈或單遍在蛋白化靶蛋白。在一些實 施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白能夠摻入多聚遍在蛋白鏈，但與野生型遍在蛋白摻入多聚 遍在蛋白鏈相比，以低約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包含，包括這些值之間的任意百分 比）中任一個的效率摻入。
[0129] 在本文公開的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中任一個的一些方面，一個或多個氨基酸取代 穩(wěn)定化蛋白質(zhì)的β?/β 2環(huán)，使得β?/β 2環(huán)的構(gòu)象動態(tài)相對于野生型遍在蛋白中此區(qū)域 的運動減慢。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白中此區(qū)域所顯示構(gòu)象動態(tài)相比，構(gòu)象穩(wěn) 定的遍在蛋白中的β 1/β 2環(huán)區(qū)顯示慢約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%或100% (包含，包括這些值之間的任意百分比）中任一個的構(gòu)象動態(tài)。在一些實施方 案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β1/β2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3ΝΗΕ鏈Β的約0. 5 至3 A (包括約0.7至2.7 Α、1.0至2.4 Α、1.3至2.1 Α、1.6至1.8Α.)均方根偏差 (RMSD)內(nèi)的區(qū)域。在一個實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β?/β 2環(huán)區(qū)限制于蛋白 質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3ΝΗΕ鏈Β的約1J贏RMSD內(nèi)的區(qū)域。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋 白相比，本文公開的任意構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β 1/β 2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒值高至 多約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000(包 含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中的任一個。在具體實施方案中，與野生型遍在蛋白相 t匕，本文公開的任意構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β 1/β 2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒Rex值高至多約 40倍。在一些實施方案中，通過本領(lǐng)域已知的任意方法（尤其是本文所述的方法）來測定 本文公開的遍在蛋白變體的β?/β 2環(huán)區(qū)較慢的構(gòu)象動態(tài)的程度。在一個實施方案中，該 方法是NMR R2分散。
[0130] 本文提供構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白。在一些方面，本文公開的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在 遍在蛋白的三級結(jié)構(gòu)內(nèi)部具有一個或多個氨基酸取代，其穩(wěn)定化該蛋白質(zhì)為特定的構(gòu)象狀 態(tài)。
[0131] 在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在選自47、48313334、436、469和八71 的氨基酸殘基處包含一個或多個取代，其中氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID N0:1。在一些 實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與結(jié)合配偶體具有通過Kd測定的小于約1. OmM、500 μ Μ、 100 μ Μ、50 μ Μ、25 μ Μ、10 μ Μ、5 μ Μ、1 μ Μ、900ηΜ、800ηΜ、700ηΜ、600ηΜ、500ηΜ、400ηΜ、300ηΜ、 200ηΜ、150ηΜ、100ηΜ、90ηΜ、80ηΜ、70ηΜ、60ηΜ、50ηΜ、45ηΜ、40ηΜ、35ηΜ、30ηΜ、25ηΜ、20ηΜ、 15ηΜ、ΙΟηΜ、5ηΜ或ΙηΜ (包含，包括這些數(shù)字之間的任意值）中的約任一個的結(jié)合親和力。在 一些實施方案中，與野生型遍在蛋白引起的這些酶的抑制相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白使一 種或多種酶促遍在蛋白結(jié)合配偶體的活性抑制約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包含，包括 這些值之間的任意百分比）中的任一個。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是遍在蛋白加工 酶，如但不限于任意El、Ε2或Ε3遍在蛋白加工酶或脫遍在蛋白酶。在一些實施方案中，結(jié) 合配偶體是USP家族脫遍在蛋白酶的成員（如但不限于USP7、USP5和/或USP14)。在一些 實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié)合。在一些實施方案中， 與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以高約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、 200、300、400、500、600、700、800、900或1000 (包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中任 一個的親和力與USP7結(jié)合。在另一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP14結(jié)合但不能 與USP7結(jié)合。在一個實施方案中，結(jié)合配偶體是USP7。在一個實施方案中，如通過NMRR 2 分散所測量，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β1/β2環(huán)周圍的區(qū)域中的 微秒 Rex 值高至多約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、 900或1000(包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中的任一個。在具體實施方案中，如通 過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β 1/β 2環(huán)周圍的區(qū) 域中的微秒Ιζχ值高至多約40倍。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β?/β 2 環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3NHE鏈B的約0.5至3 i (包括約0.7至2.7 1、1.0至 2,4 1.3至2.1 1.6至丨,8.\)RMSD內(nèi)的區(qū)域。在一個實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍 在蛋白中的β 1/β 2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3NHE鏈B的約1J ▲ RMSD內(nèi)的區(qū)域。 在一些實施方案中，取代導(dǎo)致在遍在蛋白中形成一個或多個二硫鍵。在另一實施方案中，取 代未導(dǎo)致在遍在蛋白中形成一個或多個二硫鍵。
[0132] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在選自A7(C)、A8(C)和A69(C)的氨基酸殘基處 包含一個或多個取代，其中氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID N0:1。在具體實施方案中，蛋 白質(zhì)包含A7(C)或A8(C)和A69(C)。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在A13處具 有進(jìn)一步的取代。在一個實施方案中，A13處的取代是取代為極性氨基酸殘基。在另一實 施方案中，蛋白質(zhì)包含A13 (R、N、D、C、E、Q、Η、K、S、T或Y)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包 含A13 (N、R、G、K、Y、A、S或H)。還在另一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在A71處具有 進(jìn)一步的取代。在一個實施方案中，A71處的取代是取代為堿性氨基酸。在另一實施方案 中，蛋白質(zhì)包含A71(R、K或H)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A13(R或K)。在另一實施 方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在A13處和A71處都具有進(jìn)一步的取代，其中A13處的取代是 取代為極性氨基酸殘基，而A71處的取代是取代為堿性氨基酸。在一些實施方案中，蛋白質(zhì) 包含八13〇?、隊0、(：4、〇、!1、1(、5、1'或￥)和471〇?、1(或!1)。在另一實施方案中，蛋白質(zhì)包含 八13(隊1?、6、1(、￥、4、3或!1)和六71〇?或1()。在另一實施方案中，蛋白質(zhì)包含47(〇、48(〇 或 A69 (C)，且可以在 A36 (Y、F、L 或 Η)、A34 (I、F、L 或 V)、A13 (N、R、G、K、Y、A、S 或 H)或 A71(R或K)中的一處或多處具有附加的取代。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與 結(jié)合配偶體具有通過Kd測定的小于約1. 0mM、500 μ M、100 μ Μ、50 μ Μ、25 μ M、10 μ Μ、5 μ M、 1 μ Μ、900ηΜ、800ηΜ、700ηΜ、600ηΜ、500ηΜ、400ηΜ、300ηΜ、200ηΜ、150ηΜ、100ηΜ、90ηΜ、80ηΜ、 70ηΜ、60ηΜ、50ηΜ、45ηΜ、40ηΜ、35ηΜ、30ηΜ、25ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、10ηΜ、5ηΜ 或 ΙηΜ(包含，包括這 些數(shù)字之間的任意值）中的約任一個的結(jié)合親和力。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋 白引起的這些酶的抑制相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白使一種或多種酶促遍在蛋白結(jié)合配偶體 的活性抑制約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包含，包括這些值之間的任意百分比）中的任 一個。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是遍在蛋白加工酶，如但不限于任意E1、E2或E3遍在 蛋白加工酶或脫遍在蛋白酶。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是USP家族脫遍在蛋白酶的 成員（如但不限于USP7、USP5和/或USP14)。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與 USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié)合。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍 在蛋白以高約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000(包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中任一個的親和力與USP7結(jié)合。在另一實施 方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP14結(jié)合但不能與USP7結(jié)合。在一個實施方案中，結(jié)合 配偶體是USP7。在一個實施方案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu) 象穩(wěn)定的遍在蛋白的β 1/β2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒Rex值高至多約10、20、30、40、50、60、 70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 (包含，包括這些值之間的任意 數(shù)字）倍中的任一個。在具體實施方案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白 相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β1/β2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒Rex值高至多約40倍。在一 些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β?/β 2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3NHE鏈B 的約 0.5 至3 A (包括約 〇·7 至 2J Α、1·〇 至 2.4 A、1.3 至 2.1 A、1.6 至1.8A) RMSD內(nèi)的區(qū)域。在一個實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β?/β 2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì) 數(shù)據(jù)庫編號3ΝΗΕ鏈Β的約1J 1 RMSD內(nèi)的區(qū)域。在一些實施方案中，取代導(dǎo)致在遍在蛋 白中形成一個或多個二硫鍵。
[0133] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在氨基酸殘基Α71處包含取代，其中氨基酸殘 基位置是相對于SEQ ID Ν0:1。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A71(R、K、A、Q、G、W、H、I* R)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A71(R)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A71(K)。在 一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A71(W)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A71(G)。在一些實 施方案中，在A71處具有取代的蛋白質(zhì)可以在A69 (C、G、A、W、K、Y、V、F或I)、A36 (Y、F、L、 H、A、V、W、I、M*N)、A34(I、F、L、V、S、M*T)、A13(N、R、G、K、Y、A、S、H、E、L、T、V、I、M* ?)、六8(1\(：、0、1?、6、(：、1\六、〇、？、1^或￥)和/或六7((：、隊？、5、1?、6、￥或0)中的一處或多 處具有附加的取代。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與結(jié)合配偶體具有通過Kd測 定的小于約 1. 0mM、500 μ M、100 μ Μ、50 μ Μ、25 μ M、10 μ Μ、5 μ Μ、1 μ M、900nM、800nM、700nM、 600ηΜ、500ηΜ、400ηΜ、300ηΜ、200ηΜ、150ηΜ、1ΟΟηΜ、90ηΜ、80ηΜ、70ηΜ、60ηΜ、50ηΜ、45ηΜ、40ηΜ、 35ηΜ、30ηΜ、25ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、ΙΟηΜ、5ηΜ或ΙηΜ (包含，包括這些數(shù)字之間的任意值）中的約 任一個的結(jié)合親和力。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白引起的這些酶的抑制相比，構(gòu) 象穩(wěn)定的遍在蛋白使一種或多種酶促遍在蛋白結(jié)合配偶體的活性抑制約5%、10%、15%、 20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %, 95%或100% (包含，包括這些值之間的任意百分比）中的任一個。在一些實施方案中，結(jié)合 配偶體是遍在蛋白加工酶，如但不限于任意El、Ε2或Ε3遍在蛋白加工酶或脫遍在蛋白酶。 在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是USP家族脫遍在蛋白酶的成員（如但不限于USP7、USP5 和/或USP14)。在一個實施方案中，結(jié)合配偶體是USP7。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍 在蛋白與USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié)合。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu) 象穩(wěn)定的遍在蛋白以高約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、 800、900或1000 (包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中任一個的親和力與USP7結(jié)合。 在另一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP14結(jié)合但不能與USP7結(jié)合。在一些實施方 案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β?/β 2 環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒 Rex 值高至多約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、 500、600、700、800、900或1000(包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中的任一個。在具 體實施方案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的 β 1/β 2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒值高至多約40倍。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍 在蛋白中的β 1/ β 2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3NHE鏈B的約0. 5至3 ▲(包括約〇. 7 至2,71、ι·〇至2,4贏、1.3至2.1 1.6至l,ft|)RMSD內(nèi)的區(qū)域。在一個實施方案 中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β1/β2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3NHE鏈B的約1.魯▲ RMSD內(nèi)的區(qū)域。
[0134] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在氨基酸殘基Α34處包含取代，其中氨基酸殘 基位置是相對于SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，A34處的取代是取代為疏水性氨基酸。 在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含六34仏、￥、1、1^、厘、？、￥或吣。在一些實施方案中，蛋白質(zhì) 包含A34(I、F、L、V、T、S、Μ或T)。在一些實施方案中，在A34處具有取代的蛋白質(zhì)可以在 Α71 (R、K、A、Q、W、G、Η、I、R 或 G)、Α69 (C、G、A、W、Κ、Υ、V、F 或 I)、Α36 (Y、F、L、H、A、W、I、Μ *N)、A13(N、R、G、K、Y、A、S、H、E、L、T、V、I、M*P)、A8(T、C、D、R、G、C、T、A、Q、F、L*Y) 和/或八7((：、隊？、5、1?、6、￥或0)中的一處或多處具有附加的取代。在一些實施方案中，構(gòu) 象穩(wěn)定的遍在蛋白與結(jié)合配偶體具有通過Kd測定的小于約1. 0mM、500 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、 25 μ Μ、10 μ Μ、5 μ Μ、1 μ Μ、900ηΜ、800ηΜ、700ηΜ、600ηΜ、500ηΜ、400ηΜ、300ηΜ、200ηΜ、150ηΜ、 ΙΟΟηΜ、90ηΜ、80ηΜ、70ηΜ、60ηΜ、50ηΜ、45ηΜ、40ηΜ、35ηΜ、30ηΜ、25ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、ΙΟηΜ、5ηΜ 或 ΙηΜ(包含，包括這些數(shù)字之間的任意值）中的約任一個的結(jié)合親和力。在一些實施方案中， 與野生型遍在蛋白引起的這些酶的抑制相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白使一種或多種酶促遍在 蛋白結(jié)合配偶體的活性抑制約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100% (包含，包括這些值之間的任 意百分比）中的任一個。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是遍在蛋白加工酶，如但不限于任 意Ε1、Ε2或Ε3遍在蛋白加工酶或脫遍在蛋白酶。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是USP家 族脫遍在蛋白酶的成員（如但不限于USP7、USP5和/或USP14)。在一個實施方案中，結(jié)合 配偶體是USP7。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié)合。 在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以高約10、20、30、40、50、 60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000(包含，包括這些值之間的 任意數(shù)字）倍中任一個的親和力與USP7結(jié)合。在另一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與 USP14結(jié)合但不能與USP7結(jié)合。在一些實施方案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型 遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β 1/β 2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒值高至多約10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000(包含，包括 這些值之間的任意數(shù)字）倍中的任一個。在具體實施方案中，如通過NMR R2分散所測量，與 野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β 1/β 2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒值高至多 約40倍。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β1/β2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 編號3ΝΗΕ鏈Β的約0.5至3 ▲(包括約0.7至2,7 1.0至2.4 1.3至2.1 Α、 1.6至ljl)RMSD內(nèi)的區(qū)域。在一個實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β 1/β2環(huán)區(qū) 限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3ΝΗΕ鏈Β的約1.6 A RMSD內(nèi)的區(qū)域。
[0135] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在氨基酸殘基Α7處包含取代，其中氨基酸殘基 位置是相對于SEQ ID Ν0:1。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)包含A7(C、N、F、S、D、F、R、G*V)。 在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A7 (G)。在一些實施方案中，在A7處具有取代的蛋白質(zhì)可 以在 A71 (R、K、A、Q、W、G、Η、I、R 或 G)、A69 (C、G、A、W、K、Y、V、F 或 I)、A34 (I、F、L、V、S、Μ *T)、A13(N、R、G、K、Y、A、S、H、E、L、T、V、I、M*P)、A8(T、C、D、R、G、C、T、A、Q、F、L*Y) 和/或八36(￥、？、1^、!1、1、4或沁中的一處或多處具有附加的取代。在一些實施方案中，構(gòu) 象穩(wěn)定的遍在蛋白與結(jié)合配偶體具有通過Kd測定的小于約1. 0mM、500 μ Μ、100 μ Μ、50 μ Μ、 25 μ Μ、10 μ Μ、5 μ Μ、1 μ Μ、900ηΜ、800ηΜ、700ηΜ、600ηΜ、500ηΜ、400ηΜ、300ηΜ、200ηΜ、150ηΜ、 ΙΟΟηΜ、90ηΜ、80ηΜ、70ηΜ、60ηΜ、50ηΜ、45ηΜ、40ηΜ、35ηΜ、30ηΜ、25ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、ΙΟηΜ、5ηΜ 或 InM(包含，包括這些數(shù)字之間的任意值）中的約任一個的結(jié)合親和力。在一些實施方案中， 與野生型遍在蛋白引起的這些酶的抑制相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白使一種或多種酶促遍在 蛋白結(jié)合配偶體的活性抑制約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或 100% (包含，包括這些值之間的任 意百分比）中的任一個。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是遍在蛋白加工酶，如但不限于任 意E1、E2或E3遍在蛋白加工酶或脫遍在蛋白酶。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是USP家 族脫遍在蛋白酶的成員（如但不限于USP7、USP5和/或USP14)。在一個實施方案中，結(jié)合 配偶體是USP7。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié) 合。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以高約10、20、30、40、 50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000(包含，包括這些值之間 的任意數(shù)字）倍中任一個的親和力與USP7結(jié)合。在另一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白 與USP14結(jié)合但不能與USP7結(jié)合。在一些實施方案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生 型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β 1/ β 2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒值高至多約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000(包含，包 括這些值之間的任意數(shù)字）倍中的任一個。在具體實施方案中，如通過NMR R2分散所測量， 與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β 1/β 2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒值高至 多約40倍。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β1/β2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù) 庫編號3ΝΗΕ鏈Β的約0.5至3 A (包括約〇·7至2.7 Α、1·〇至2.4 1.3至2.1 Α、 1.6至1.8l)RMSD內(nèi)的區(qū)域。在一個實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β 1/β2環(huán)區(qū) 限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3ΝΗΕ鏈Β的約1J A RMSD內(nèi)的區(qū)域。
[0136] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在氨基酸殘基A36處包含取代，其中氨基酸殘 基位置是相對于SEQ ID N0:1。在一些實施方案中，A36處的取代是取代為芳族氨基酸。在 一個實施方案中，蛋白質(zhì)包含A36 (W或Y)。在另一實施方案中，蛋白質(zhì)包含A36 (L、F、W、M、 Y、Η、I、A或N)。在一些實施方案中，在A36處具有取代的蛋白質(zhì)可以在A71 (R、K、A、Q、W、 G、Η、I、R 或 G)、A69 (C、G、A、W、K、Y、V、F 或 I)、A34 (I、F、L、V、S、Μ 或 T)、A13 (N、R、G、K、 ￥、八、5、!^、1^、1\￥、1、]\1或？）、八8(1\(：、0、1?、6、(：、1\八、〇、卩、1^或￥)和/或八7((：、隊卩、5、 R、G、V或D)中的一處或多處具有附加的取代。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與 結(jié)合配偶體具有通過Kd測定的小于約1. 0mM、500 μ M、100 μ Μ、50 μ Μ、25 μ M、10 μ Μ、5 μ M、 1μΜ、900ηΜ、800ηΜ、700ηΜ、600ηΜ、500ηΜ、400ηΜ、300ηΜ、200ηΜ、150ηΜ、100ηΜ、90ηΜ、80ηΜ、 70ηΜ、60ηΜ、50ηΜ、45ηΜ、40ηΜ、35ηΜ、30ηΜ、25ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、10ηΜ、5ηΜ 或 ΙηΜ(包含，包括這 些數(shù)字之間的任意值）中的約任一個的結(jié)合親和力。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋 白引起的這些酶的抑制相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白使一種或多種酶促遍在蛋白結(jié)合配偶體 的活性抑制約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包含，包括這些值之間的任意百分比）中的任 一個。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是遍在蛋白加工酶，如但不限于任意El、E2或E3遍 在蛋白加工酶或脫遍在蛋白酶。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是USP家族脫遍在蛋白酶 的成員（如但不限于USP7、USP5和/或USP14)。在一個實施方案中，結(jié)合配偶體是USP7。 在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié)合。在一些實施方 案中，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以高約10、20、30、40、50、60、70、80、90、 100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000 (包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中 任一個的親和力與USP7結(jié)合。在另一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP14結(jié)合但不 能與USP7結(jié)合。在一些實施方案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu) 象穩(wěn)定的遍在蛋白的β 1/β2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒Rex值高至多約10、20、30、40、50、60、 70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 (包含，包括這些值之間的任意 數(shù)字）倍中的任一個。在具體實施方案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白 相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β1/β2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒Rex值高至多約40倍。在一 些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β?/β 2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3NHE鏈B 的約 0.5 至3 A (包括約 0.7 至 2JA、1.0 至 2.4 Α、1.3 至 2.1 Α、1.6 至 l.8A)RMSD 內(nèi)的區(qū)域。在一個實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β1/β2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù) 庫編號3ΝΗΕ鏈Β的約1,6 A RMSD內(nèi)的區(qū)域。
[0137] 在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在氨基酸殘基A7或A8處及A69和A71 處包含取代，其中氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID N0:1。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含 A7(C)或A8(C)和A69(C)，且A71處的取代是取代為堿性氨基酸。在一個實施方案中，蛋白 質(zhì)包含A7(C)、A71(R或K)和△8(1\0、1?、6、(：、1\4、〇、？、1^或￥)。在另一實施方案中，蛋白 質(zhì)包含A8 (C)、A71 (R或K)和A7 (N、F、S、R、G、V或D)。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍 在蛋白進(jìn)一步在八34(1、卩、1^、￥、5、]?或1')、八13(隊1?、6、1(、￥、八、5、!13兒、1'、￥、1、]\1或？）和 /或A36 (Y、F、L、Η、I、A或N)中的任意處包含一個或多個取代。
[0138] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在氨基酸殘基A7或A8處以及A69和A34處包含 取代，其中氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID N0:1。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A7(C) 或A8(C)、A69(C)和A34(I)。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)包含A7(C)和A8(T、D、R、G、C、T、 A、Q、F、L或Y)。在另一實施方案中，蛋白質(zhì)包含A8(C)和六7(隊？、5、1?、6、￥或0)。在一些 實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白進(jìn)一步在A13 (N、R、G、K、Y、A、S、Η、E、L、T、V、I、Μ或P)、 八71〇?、1(、六、〇、1、6、!1、1、1?或6)和/或六36(￥、？、1^!1、1、4或吣中的任意處包含一個或多 個取代。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié)合。在一 些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以高約10、20、30、40、50、60、 70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 (包含，包括這些值之間的任意 數(shù)字）倍中任一個的親和力與USP7結(jié)合。
[0139] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在氨基酸殘基Α7或Α8處以及Α69、Α34和Α36 處包含取代，其中氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID Ν0:1。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含 A7 (C)或A8 (C)、A69 (C)、A34 (I)，且A36處的取代是取代為芳族氨基酸。在一個實施方案 中，蛋白質(zhì)包含47(〇、436$或￥)和48(1\0、1?、6、(：、1\4、0、？、1^或￥)。在一個實施方案 中，蛋白質(zhì)包含A8(C)、A36(F或Y)和八7(隊？、5、1?、6、￥或0)。還在另一實施方案中，構(gòu)象 穩(wěn)定的遍在蛋白進(jìn)一步在 A13 (N、R、G、K、Y、A、S、Η、E、L、T、V、I、Μ 或 P)和 / 或 A71 (R、K、 A、Q、W、G、H、I、R或G)處包含一個或多個取代。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與 USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié)合。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍 在蛋白以高約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000(包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中任一個的親和力與USP7結(jié)合。
[0140] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在氨基酸殘基A7、A13和A71處包含取代，其中 氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID N0:1。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A7(F)、A13(Y)和 A71(R)。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白進(jìn)一步在A34(I、F、L、V、S、M或T)、A69(C、 6、八、1、1(、￥、￥、卩或1)、六8(1\(：、0、1?、6、(：、1\六、〇、卩、1^或￥)和/或六36(￥、卩、1^、!1、1、八或 N)處包含一個或多個取代。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP7結(jié)合但不能與 USP14結(jié)合。在另一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP14結(jié)合但不能與USP7結(jié)合。
[0141] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在氨基酸殘基A7、A13、A34、A36和A71處包含 取代，其中氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID N0:1。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A7(F)、 A13(Y)、A71(R)、A34(I或L)和A36(I或L)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A34(L)和 A36(I)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A34(I)和A36(L)。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定 的遍在蛋白進(jìn)一步在 A69 (C、G、A、W、K、Y、V、F 或 I)和 / 或 A8 (T、C、D、R、G、C、T、A、Q、F、L 或Y)處包含一個或多個取代。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP7結(jié)合但不 能與USP14結(jié)合。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以高約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000(包含，包 括這些值之間的任意數(shù)字）倍中任一個的親和力與USP7結(jié)合。在另一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn) 定的遍在蛋白與USP14結(jié)合但不能與USP7結(jié)合。
[0142] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在氨基酸殘基A7、A13、A34、A36、A69和A71處 包含取代，其中氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID N0:1。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含 A7 (F)、A13 (Y)、A71 (R)、A34 (I 或 L)、A36 (I 或 L)和 A69 (G 或 W)。在一個實施方案中，蛋 白質(zhì)包含A69G)、A34(L)和A36(I)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A69(G)、A34(I)和 A36(L)。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)包含A69(W)、A34(L)和A36(I)。在另一實施方案中， 蛋白質(zhì)包含A69(W)、A34(I)和A36(L)。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白進(jìn)一步在 八8(1\(：、0、1?、6、(：、1\4、〇、？、1^或￥)處包含取代。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋 白與USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié)合。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn) 定的遍在蛋白以高約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、 900或1000(包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中任一個的親和力與USP7結(jié)合。在另 一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP14結(jié)合但不能與USP7結(jié)合。
[0143] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在氨基酸殘基A7和A71處包含取代，其中氨基 酸殘基位置是相對于SEQ ID N0:1。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A7(G)和A71(W)。在 一個實施方案中，蛋白質(zhì)在A8處具有進(jìn)一步的取代，取代為F或L。在一些實施方案中，蛋 白質(zhì)包含A8(F)。在另一實施方案中，蛋白質(zhì)包含A8(L)。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的 遍在蛋白進(jìn)一步在 A34 (I、F、L、V、S、Μ 或 T)、A69 (C、G、A、W、K、Y、V、F 或 I)、A13 (N、R、G、 1(、￥、4、5、!^、1^、1\￥、1、]\1或？）和/或436(￥、？、1^、!1、1、4或吣處包含一個或多個取代。 在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié)合。在一些實施方 案中，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以高約10、20、30、40、50、60、70、80、90、 100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000 (包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中 任一個的親和力與USP7結(jié)合。在另一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP14結(jié)合但不 能與USP7結(jié)合。
[0144] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白包含選自氨基酸殘基A7、A8、A13、A34、A36、A69 和A71的一個或多個取代，其中氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID N0:1，且其中取代導(dǎo)致至 少一個二硫鍵的形成。在一些方面，蛋白質(zhì)包含A7 (C)、A8 (L)、A13 (N)、A34 (I)、A36 (Y)、 A69 (C)和 A71 (R)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (C)、A8 (T)、A13 (R)、A34 ⑴、A36 (F)、A69 (C) 和 A71 (R)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (N)、A8 (C)、A13 (G)、A34 (F)、A36 (Y)、A69 (C)和 A71 (R)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (C)、A8 (L)、A13 (N)、A34 (I)、A36 (Y)、A69 (C)和 A71 (R)。 在一些方面，蛋白質(zhì)包含六7(〇、六8(0)、六13〇()、六34(1)、六36(1^、六69(〇和六71〇〇。在一 些方面，蛋白質(zhì)包含六7(〇、六8(0)、六13〇〇、六34(1)、六36的、六69(〇和六71〇()。在一些方 面，蛋白質(zhì)包含 A7 (C)、A8 (T)、A13 (R)、A34 (I)、A36 (F)、A69 (C)和 A71 (R)。在一些方面，蛋 白質(zhì)包含八7的、八8〇〇、八13(￥)、八34仏)、八36(1)、八69(6)和八71〇〇。在一些方面，蛋白質(zhì) 包含六7(〇、六8(1')、六13〇〇、六34〇^)、六36的、六69(〇和六71〇〇。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (C)、A8 (G)、A13 (A)、A34 (V)、A36 ⑶、A69 (C)和 A71 (R)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (C)、 A8 ⑴、A13 (R)、A34 (L)、A36 (F)、A69 (C)和 A71 (R)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (C)、A8 (R)、 A13 ⑶、A34 (L)、A36 ⑴、A69 (C)和 A71 (R)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (C)、A8 (L)、A13 (N)、 A34 (I)、A36 (Y)、A69 (C)和 A71 (R)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (C)、A8 (D)、A13 (K)、A34 (I)、 A36 (F)、A69 (C)和 A71 (K)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (C)、A8 (R)、A13 (S)、A34 (L)、A36 (Y)、 A69 (C)和 A71 (R)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (C)、A8 (D)、A13 ⑷、A34 ⑴、A36 (L)、A69 (C) 和 A71 (R)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (S)、A8 (C)、A13 (Η)、A34 (I)、A36 (Y)、A69 (C)和 A71(R)。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié)合。在一 些實施方案中，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以高約10、20、30、40、50、60、 70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900 或 1000 (包含，包括這些值之間的任意 數(shù)字）倍中任一個的親和力與USP7結(jié)合。在一些方面，蛋白質(zhì)包含表1中所示的任意克隆 的取代。
[0145] 表l.U7Ub二硫鍵克隆
[0146] UTOb 二iSfcitA 隆 克隆 ID A7 AS ...U4 ..\允.\沾..\7i \u i L 丨 Li L L 171 hi C L N ? Y C R L71 b3 C： T R I F C it L7U?4 、 C G F Y C R vn：h7 C L N I Y (：： 1 L：7U>9 C： D K I L ( 1 17Π>15 C D K I F (.: K L 71 bl? (：： T R I F ( K l:7Lh25 l· R 、 L I C 1 171 h30 C T R L F ( m Vll：h3^ C C Λ ￥ H C： R l：7U>4i) C T R L F C R i：7L：h50 C； E S L Y C； R 17LU5I C L N I Y C Μ l;7lb55 C D K I F C K VH：h59 i R S L Y (.: K l：7U>74 C D K I L ( 1 UTOMS S C H 1 Y C M
[0147] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白包含選自氨基酸殘基A7、A8、A13、A34、A36、A69 和A71的一個或多個取代，其中氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID N0:1，且其中取代未導(dǎo)致 至少一個二硫鍵的形成。在一些方面，蛋白質(zhì)包含A7 (D)、A8 (Y)、A13 (R)、A34 (L)、A36 (I)、 A69 (A)和 A71 (A)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (F)、A8 (A)、A13 ⑴、A34 (L)、A36 ⑴、A69 (G) 和 A71 (R)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (F)、A8 (G)、A13 (Y)、A34 (I)、A36 (L)、A69 (W)和 八71〇〇。在一些方面，蛋白質(zhì)包含六7$)、六8仰、六13(￥)434仏）436(1)、六69(6)和六71〇〇。 在一些方面，蛋白質(zhì)包含六7的、六8〇〇、六13以)、六34仏）、六36(1)、六69(6)和六71〇〇。在一 些方面，蛋白質(zhì)包含六7〇〇、六8仰、六13缶）、六34仏)、六36以)、六69〇〇和六71仰。在一些方 面，蛋白質(zhì)包含 Α7 (R)、Α8 (R)、Α13 (Ρ)、Α34 (Τ)、Α36 (A)、Α69 (Υ)和 Α71 (R)。在一些方面，蛋 白質(zhì)包含六7(3)、六8(￥)、六13(丫)、六34(1)、六36(吣、六69(1)和六71(6)。在一些實施方案中， 構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP7結(jié)合但不能與USP14結(jié)合。在一些實施方案中，與野生型遍在 蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以高約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、 500、600、700、800、900或1000(包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中任一個的親和力與 USP7結(jié)合。在一些方面，蛋白質(zhì)包含表2中所示的任意克隆的取代。
[0148] 表2. U7Ub非二硫鍵克隆
[0149] l!7L b非二硫鍵克隆 克隆 11) A7 A8 A13 A34 Α3β Α69 Α?. νν ? JfL# 夏 JEi!# ? U71 b55i D Y R L I A A L 7L b490 F A ￥ L I G R U7Lh5ll F G Y I L W R L71 b432 F Q Y L 1 G R U7l：b523(l：7Uh25) F R Y L I G R U71 b526 R Q E L ￥ K Q U7Lb402 E R P T A Y R U7l：h455 S Y Y I M 1 G
[0150] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白包含選自氨基酸殘基A7、A8、A13、A34、A36、A69 和A71的一個或多個取代，其中氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID N0:1。在一些方面，蛋白 質(zhì)包含六7(6)、六8(1^)、六13(1')434(1')、六36仏)46"1)和六71〇￥)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (G)、A8 (F)、A13 (L)、A34 ⑴、A36 (L)、A69 ⑶和 A71 (W)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (G)、 A8 (L)、A13 (V)、A34 (V)、A36 (L)、A69 ⑴和 A71 (W)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (G)、A8 (L)、 A13 (L)、A34 ⑶、A36 (L)、A69 (V)和 A71 (W)。在一些方面，蛋白質(zhì)包含 A7 (G)、A8 (F)、A13 (L)、 A34(T)、A36(W)、A69(Y)和A71(H)。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP14結(jié)合 但不能與USP7結(jié)合。在一些方面，蛋白質(zhì)包含表3中所示的任意克隆的取代。
[0151] 表 3.U14Ub 克隆
[0152] 1:141.丨> 克隆 克隆丨[)Λ7 A8 Λ13 Λ34 Λ36 Λ69 Α7Ι wt 1 L I E I I, I. 1141 bi ('； L T T L 1 W l'14lbi4 G F L T L S W 1141..,1)2 C L V V L I \\ li 141： 1.)22 G L L S L ￥ W l：14U?24 (, F L T W ￥ H
[0153] 在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的蛋白質(zhì)包含任意U7Ub25、U7Ub7或U14Ub2克隆的取代。
[0154] 在另一方面，本文所述的任意構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白可以進(jìn)一步在蛋白質(zhì)的表面上 具有一個或多個增加其對一種或多種結(jié)合配偶體的親和力的氨基酸取代。在一些實施方案 中，構(gòu)象穩(wěn)定的蛋白質(zhì)在A42、A46、A49、A62、A65、A68或A70處具有一個或多個表面氨基酸 取代，其中氨基酸殘基位置對應(yīng)于SEQ ID N0:1的A1-A76。在一個實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定 的遍在蛋白在 A42 (K、T 或 W)、A46 (G 或 S)、A49 (T、N、L 或 R)、A62 (E)、A65 (T 或 A)、A68 (R) 或A70(I)中的一處或多處具有表面氨基酸取代。在另一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋 白在A42(W)、A49(R)和A68(R)處具有表面氨基酸取代。在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的蛋白質(zhì) 包含克隆U7Ub25. 2540的取代。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與結(jié)合配偶體具 有通過 Kd 測定的小于約 1. OmM、500 μ M、100 μ M、50 μ M、25 μ M、10 μ M、5 μ Μ、1 μ Μ、900nM、 800ηΜ、700ηΜ、600ηΜ、500ηΜ、400ηΜ、300ηΜ、200ηΜ、150ηΜ、100ηΜ、90ηΜ、80ηΜ、70ηΜ、60ηΜ、 50ηΜ、45ηΜ、40ηΜ、35ηΜ、30ηΜ、25ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、ΙΟηΜ、5ηΜ 或 ΙηΜ (包含，包括這些數(shù)字之間 的任意值）中的約任一個的結(jié)合親和力。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白引起的這 些酶的抑制相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白使一種或多種酶促遍在蛋白結(jié)合配偶體的活性抑制 約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%或100% (包含，包括這些值之間的任意百分比）中的任一個。在一 些實施方案中，結(jié)合配偶體是遍在蛋白加工酶，如但不限于任意El、E2或E3遍在蛋白加工 酶或脫遍在蛋白酶。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是USP家族脫遍在蛋白酶的成員（如但 不限于USP7、USP5和/或USP14)。在一個實施方案中，結(jié)合配偶體是USP7。在一些實施方 案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β1/β2 環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒 Rex 值高至多約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、 500、600、700、800、900或1000(包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中的任一個。在具 體實施方案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的 β 1/β 2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒Rex值高至多約40倍。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在 蛋白中的β 1/β 2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3NHE鏈B的約0. 5至3 ▲(包括約0. 7 至2.7 A、L〇至2,4 Α、1.3至2.1 Α、1.6至1.8A)RMSD內(nèi)的區(qū)域。在一個實施方案 中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β 1/ β 2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3NHE鏈B的約1J ▲ RMSD內(nèi)的區(qū)域。在一些方面，蛋白質(zhì)包含表4中所示的任意克隆的取代。
[0155] 表4.表面殘基取代
[0156] 克隆 ID A2 A4 A14 A40 A42 A46 A47 A49 A62 A64 A65 A66 Λ68 Λ70 Wt QFTQKAGQQE S T HV llb7.25 / w( qfxqraGTQETTHV uh-?v25RI51 QFTQRGGMQES T II V uh7\2?RI54 QFTQRAGQQES T II V 猶.25 QFTQTSGLIEATHI uh7^25RI55；S QFTQRGGLEES T Η V uh-7>25RI554 Q F T Q K A G Q Q E S T II V ub7v25RI52 QFTQWAGRQES T R V
[0157] 還在其他方面，本文所述的任意構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白可以進(jìn)一步在蛋白質(zhì)的C端 區(qū)域的表面上具有一個或多個增加其對一種或多種結(jié)合配偶體的親和力的氨基酸取代。在 一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的蛋白質(zhì)在A40、A42、A46、A47、A49、A62、A65、A68、A70、A71、 A72、A73、A74、A75或A76處具有一個或多個表面氨基酸取代，其中氨基酸殘基位置對應(yīng)于 SEQ ID N0:1的A1-A76。在一個實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在A42(M)、A46(L或N)、 A49 (V、Y、L 或 T)、A62 (G 或 R)、A65 (A)、A68 (Q)、A70 (R)、A72 (W 或 H)、A73 (A、R 或 K)、A74 (S、 V、G、Y或W)、A75 (A、R、P、E、V、H或Y)或A76 (R、S、V、A或L)中的一處或多處具有表面氨 基酸取代。在另一實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白在A42 (Μ)、A49 (V)、A70 (R)、A72 (W)、 A73(K)、A74(K)、A75(R)和A76(V)處具有表面氨基酸取代。在一些方面，構(gòu)象穩(wěn)定的蛋白 質(zhì)包含克隆Ub7. 25. 216的取代。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與結(jié)合配偶體 具有通過 Kd 測定的小于約 1. 0mM、500 μ M、100 μ Μ、50 μ Μ、25 μ M、10 μ Μ、5 μ Μ、1 μ M、900nM、 800ηΜ、700ηΜ、600ηΜ、500ηΜ、400ηΜ、300ηΜ、200ηΜ、150ηΜ、100ηΜ、90ηΜ、80ηΜ、70ηΜ、60ηΜ、 50ηΜ、45ηΜ、40ηΜ、35ηΜ、30ηΜ、25ηΜ、20ηΜ、15ηΜ、ΙΟηΜ、5nM 或 InM (包含，包括這些數(shù)字之間 的任意值）中的約任一個的結(jié)合親和力。在一些實施方案中，與野生型遍在蛋白引起的這 些酶的抑制相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白使一種或多種酶促遍在蛋白結(jié)合配偶體的活性抑制 約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%或100% (包含，包括這些值之間的任意百分比）中的任一個。在一 些實施方案中，結(jié)合配偶體是遍在蛋白加工酶，如但不限于任意El、E2或E3遍在蛋白加工 酶或脫遍在蛋白酶。在一些實施方案中，結(jié)合配偶體是USP家族脫遍在蛋白酶的成員（如但 不限于USP7、USP5和/或USP14)。在一個實施方案中，結(jié)合配偶體是USP7。在一些實施方 案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的β1/β2 環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒 Rex 值高至多約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、 500、600、700、800、900或1000(包含，包括這些值之間的任意數(shù)字）倍中的任一個。在具 體實施方案中，如通過NMR R2分散所測量，與野生型遍在蛋白相比，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白的 β 1/β 2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒值高至多約40倍。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍 在蛋白中的β 1/ β 2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3NHE鏈B的約0. 5至3 Λ (包括約〇. 7 至2.71、1.0至2.4 Α、1.3至2.1 Α、1.6至1.8i)RMSD內(nèi)的區(qū)域。在一個實施方案 中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的β 1/ β 2環(huán)區(qū)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3NHE鏈B的約1J A RMSD內(nèi)的區(qū)域。在一些方面，蛋白質(zhì)包含表5中所示的任意克隆的取代。
[0158] 表5. C端區(qū)域表面殘基取代
[0159] 克麼 0> A聊 A42 A46 A47 A49 A62 A65 A68 A70 A72 A73 Α?4 A75 Λ76 \\i Q R Λ (, Q Q S If V R L K (, <； i Q R L G Q (； Λ II V Η V S Λ R { 〇 U A G Q C. S II V W R K (>； S " (J M A G ￥ S II K 、\ K V U \ i g κ A G L g s Q v 、v κ R p λ i h7,25.225 〇 R A G ￥ 〇 S II V k K G i R l：h7,25.226 Q R N G ￥ Q S li V k R Y \ L l hi 25.227 〇 R A G Q 〇 S Η V W K S H G l h7,25.23S Q R A G T R S Η V l\ K S V A l Q R A G Q Q S Η V \V K W \ S
[0160] 除本文公開的在構(gòu)象上穩(wěn)定化遍在蛋白的具體氨基酸殘基取代外，遍在蛋白還可 以包含并不特異性影響構(gòu)象穩(wěn)定性的附加突變。這些突變導(dǎo)致本文定義的遍在蛋白多肽與 本文公開的任意天然序列遍在蛋白多肽具有至少約80%氨基酸序列同一性。這類遍在蛋 白多肽變體包括，例如，其中在天然氨基酸序列的N-或C-端（如遍在蛋白C端二甘氨酸基 序）添加或缺失了一個或多個氨基酸殘基的遍在蛋白多肽。通常，遍在蛋白多肽變體將與 本文公開的天然序列遍在蛋白多肽序列具有至少約80%氨基酸序列同一性，備選地，至少 約 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96 %、97 %、98 %或99 %氨基酸序列同一性?？蛇x地，與天然遍在蛋白多肽序列相比，遍在蛋 白變體多肽將具有不超過一個保守氨基酸取代，備選地，與天然遍在蛋白多肽序列相比不 超過2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守氨基酸取代。
[0161] 通常，本文所述的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白變體包括已用其他氨基酸取代序列中特定 位置處的殘基的變體，且進(jìn)一步包括在親本蛋白質(zhì)/肽的兩個殘基之間插入一個或多個附 加殘基的可能性，以及從親本序列缺失一個或多個殘基或向親本序列添加一個或多個殘基 的可能性。本發(fā)明可以涵蓋任意氨基酸取代、插入或缺失。在一些實施方案中，優(yōu)選在保留 和穩(wěn)定化蛋白質(zhì)的部分或全部構(gòu)象時，取代是本文所述的保守取代。
[0162] 在一些方面，本文所述的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白包含一個或多個氨基酸殘基的缺 失。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含A75和A76的缺失，其中氨基酸殘基位置是相對于SEQ ID NO: 1。在一些實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白與USP7結(jié)合但不能與USP5結(jié)合。在另一 實施方案中，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白使USP7的酶促活性抑制約5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100% (包含，包括這些值之間的任意百分比）中的任一個，但不抑制USP5的酶促活性。在一些方 面，構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白包含克隆U7Ub25A AGG的取代和缺失。
[0163] 肽/多肽的保守取代顯示在表6中的表頭"優(yōu)選的取代"之下。如果這類取代導(dǎo) 致生物學(xué)活性的變化，則可以引入表6中稱為"示例性取代"或下文中參考氨基酸種類進(jìn)一 步描述的更實質(zhì)性的變化，并篩選產(chǎn)物。
[0164] 表6.潛在的氨基酸取代
[0165]

【權(quán)利要求】
1. 構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其相對于野生型遍在蛋白包含一個或多個氨基酸取代。
2. 權(quán)利要求1的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其中所述一個或多個氨基酸取代穩(wěn)定蛋白質(zhì)的 β 1/ β 2環(huán)，使得β 1/ β 2環(huán)限制于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫編號3NHE鏈B的約1.6 ▲均方根偏差內(nèi) 的區(qū)域。
3. 權(quán)利要求1或2的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其中如通過NMR R2分散所測量，與野生型 遍在蛋白相比，所述蛋白質(zhì)的β 1/β 2環(huán)區(qū)顯示更慢的構(gòu)象動態(tài)。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其中如通過NMRR2分散所測量，與野 生型遍在蛋白相比，所述β 1/β 2環(huán)周圍的區(qū)域中的微秒Rex值高至多40倍。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其中所述蛋白質(zhì)在選自A7、A8、A13、 A34、A36、A69和A71的位置處包含一個或多個氨基酸取代，其中位置相對于A1-A76(SEQ ID ΝΟ:1)。
6. 權(quán)利要求5的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其包含（a)取代A7(C)，或取代A8(C);及（b)取 代 A69 (C)。
7. 權(quán)利要求6的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其進(jìn)一步包含選自A13(N、R、G、K、Y、A、S、H、E、 L、T、V、I、Μ 或 P)、A34 (I、F、L、V、S、Μ 或 T)、A36 (Y、F、L、Η、A、V、W、I、Μ 或 N)和 A71 (R、K、 八、〇、1、6、!1、1、1?或6)的一個或多個取代。
8. 權(quán)利要求5的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其包含選自A7(D、F、R或S)、A8(Y、A、G、Q、R* Y)、A13 (R、Y、E 或 P)、A34 (I、L 或 T)、A36 (L、Y、A 或 N)、A69 (A、G、W、K、Y 或 I)和 A71 (A、R、 Q、R或G)的一個或多個取代。
9. 權(quán)利要求5-8中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其進(jìn)一步包含定位在A42、A46、A49、 A62、A65、A68或A70處的一個或多個氨基酸取代，其中氨基酸殘基位置對應(yīng)于SEQ ID ΝΟ:1 中的位置。
10. 權(quán)利要求5-9中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其進(jìn)一步包含定位在A40、A42、 A46、A47、A49、A62、A65、A68、A70、A71、A72、A73、A74、A75 或 A76 處的一個或多個氨基酸取 代，其中氨基酸殘基位置對應(yīng)于SEQ ID NO: 1中的位置。
11. 權(quán)利要求1-10中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其中與野生型遍在蛋白相比，構(gòu) 象穩(wěn)定的遍在蛋白顯示與遍在蛋白特異性蛋白酶（USP)家族的脫遍在蛋白酶的結(jié)合增加。
12. 權(quán)利要求1-11中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其中構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以納摩 爾范圍內(nèi)的Kd與脫遍在蛋白酶結(jié)合。
13. 權(quán)利要求1-12中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其中構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白以比野 生型蛋白質(zhì)的親和力高至少1000倍的親和力與脫遍在蛋白酶結(jié)合。
14. 權(quán)利要求1-13中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其中構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白抑制脫 遍在蛋白酶的活性。
15. 權(quán)利要求1-14中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，其中與野生型遍在蛋白相比，構(gòu) 象穩(wěn)定的遍在蛋白顯示與遍在蛋白C端水解酶（UCH)家族的脫遍在蛋白酶無結(jié)合或結(jié)合減 少。
16. 核酸，其編碼權(quán)利要求1-15中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白。
17. 載體，其包含權(quán)利要求16的核酸。
18. 權(quán)利要求17的載體，其中載體是表達(dá)載體。
19. 細(xì)胞，其包含權(quán)利要求15的核酸，或權(quán)利要求17或18的載體。
20. 權(quán)利要求19的細(xì)胞，其中細(xì)胞選自動物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、線蟲細(xì)胞和酵 母細(xì)胞。
21. 權(quán)利要求20的細(xì)胞，其中動物細(xì)胞是人細(xì)胞或非人細(xì)胞。
22. 蛋白復(fù)合物，其包含權(quán)利要求1-15中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白，和USP家族的 成員的脫遍在蛋白酶。
23. 權(quán)利要求22的蛋白復(fù)合物，其中脫遍在蛋白酶是USP7、USP5或USP 14。
24. 權(quán)利要求23的蛋白復(fù)合物，其中脫遍在蛋白酶是USP7。
25. 蛋白質(zhì)，其共價連接至權(quán)利要求1-15中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白中的一種或 多種。
26. 固體支持物，其包含固定在其上的權(quán)利要求1-15中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋 白。
27. 權(quán)利要求26的固體支持物，其中固體支持物是適合用于表面等離振子共振的表 面。
28. 權(quán)利要求26的固體支持物，其中固體支持物是納米顆粒、球珠或玻璃。
29. 細(xì)胞的群體，其細(xì)胞包含表達(dá)在其表面上的權(quán)利要求1-15中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的 遍在蛋白。
30. 抑制USP家族的脫遍在蛋白酶的方法，其包括使脫遍在蛋白酶與權(quán)利要求1-15中 任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白接觸。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中抑制是體內(nèi)的或體外的。
32. 鑒定結(jié)合遍在蛋白的構(gòu)象形式的物質(zhì)的方法，所述構(gòu)象形式有利于與USP家族的 脫遍在蛋白酶結(jié)合，所述方法包括： a) 使物質(zhì)與權(quán)利要求1-15中任一項的構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白接觸；和 b) 測定物質(zhì)是否與所述構(gòu)象穩(wěn)定的遍在蛋白結(jié)合。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中物質(zhì)是小分子化合物、抗體、蛋白質(zhì)、抑制性核酸，或其任 意組合。
34. 鑒定與蛋白復(fù)合物結(jié)合的物質(zhì)的方法，所述蛋白復(fù)合物包含遍在蛋白和USP家族 的脫遍在蛋白酶，所述方法包括： a) 使物質(zhì)與權(quán)利要求22-24中任一項的蛋白復(fù)合物接觸；和 b) 測定物質(zhì)是否能夠與所述蛋白復(fù)合物結(jié)合。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中物質(zhì)是小分子化合物、抗體、蛋白質(zhì)、抑制性核酸，或其任 意組合。
36. 權(quán)利要求34的方法，其中物質(zhì)破壞脫遍在蛋白酶和遍在蛋白之間的相互作用。
37. 物質(zhì)，其通過權(quán)利要求32-36中任一項的方法鑒定。
38. 篩選蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定形式的方法，其中與野生型蛋白質(zhì)相比，構(gòu)象穩(wěn)定形式具有 提高的與結(jié)合配偶體的結(jié)合親和力，或具有提高的調(diào)節(jié)結(jié)合配偶體的活性的能力，所述方 法包括： a)使結(jié)合配偶體與蛋白質(zhì)的突變體形式的文庫接觸，其中突變體形式的文庫是通過在 一個或多個預(yù)先選擇的位置處用另一氨基酸殘基取代構(gòu)象動態(tài)蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基而 產(chǎn)生，其中預(yù)先選擇的位置定位在蛋白質(zhì)的內(nèi)部；和 b)根據(jù)與結(jié)合配偶體的結(jié)合或與野生型蛋白質(zhì)相比提高的調(diào)節(jié)結(jié)合配偶體的活性的 能力來鑒定構(gòu)象穩(wěn)定形式。
39. 權(quán)利要求38的方法，其中根據(jù)每個位置處的氨基酸殘基對蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)的區(qū) 域內(nèi)的構(gòu)象動態(tài)的貢獻(xiàn)來選擇預(yù)先選擇的位置。
40. 權(quán)利要求38或39的方法，其中文庫是編碼所述蛋白質(zhì)的突變體形式的核酸的文 庫。
41. 權(quán)利要求40的方法，其中文庫是噬菌體展示文庫。
42. 權(quán)利要求41的方法，其中用于噬菌體展示文庫的載體選自M13噬菌體、Π 噬菌體、 fd噬菌體、Ike噬菌體、N1噬菌體、腸細(xì)菌噬菌體T4、噬菌體T7和腸細(xì)菌噬菌體λ。
43. 權(quán)利要求38-42中任一項的方法，其進(jìn)一步包括通過用其他氨基酸殘基取代一個 或多個表面氨基酸殘基來突變所鑒定的構(gòu)象穩(wěn)定蛋白質(zhì)的表面上的一個或多個氨基酸殘 基，并篩選與不含一個或多個取代的表面氨基酸殘基的構(gòu)象穩(wěn)定蛋白質(zhì)相比具有提高的結(jié) 合親和力或調(diào)節(jié)能力的蛋白質(zhì)。
44. 權(quán)利要求38-43中任一項的方法，其中蛋白質(zhì)選自G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)、核激素 受體、酪氨酸激酶受體和配體門控型離子通道。
45. 權(quán)利要求38-44中任一項的方法，其中蛋白質(zhì)是遍在蛋白。
46. 權(quán)利要求38的方法，其中結(jié)合配偶體選自脫遍在蛋白酶、Ε1遍在蛋白活化酶、Ε2 遍在蛋白綴合酶、Ε3遍在蛋白-蛋白質(zhì)連接酶，和細(xì)胞蛋白酶體復(fù)合物的一個或多個成員。
47. 權(quán)利要求46的方法，其中結(jié)合配偶體是脫遍在蛋白酶。
48. 權(quán)利要求47的方法，其中脫遍在蛋白酶是遍在蛋白特異性蛋白酶（USP)家族脫遍 在蛋白酶的成員。
49. 權(quán)利要求48的方法，其中脫遍在蛋白酶選自USP7、USP5和USP14。
50. 權(quán)利要求49的方法，其中脫遍在蛋白酶是USP7。
【文檔編號】A61P35/00GK104254541SQ201280071486
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月16日
【發(fā)明者】J·E·科恩, Y·張, A·H·菲利普斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司