消毒方法【專利摘要】本發(fā)明涉及消毒可植入生物材料的方法。具體地，本發(fā)明涉及用于消毒交聯(lián)的膠原基生物材料的方法，包括使所述交聯(lián)的膠原基生物材料接觸包括3％和6％v/v之間的氧化丙烯的消毒溶液和在30℃和55℃之間溫育所述生物材料大于48小時；條件是消毒溶液不包含醇?！緦＠f明】消毒方法【
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】[0001]本發(fā)明涉及消毒可植入生物材料的方法。具體地，本發(fā)明涉及消毒含膠原可植入生物材料和其后保存的方法。[0002]發(fā)明背景[0003]可植入生物材料，尤其是膠原基生物材料，要求消毒并常常在使用前存儲。通常，存在兩大類的可植入膠原基生物材料：（1)天然組織和（2)化學交聯(lián)組織。因此，根據(jù)膠原基生物材料的類型和是否已經(jīng)發(fā)生交聯(lián)，存在對消毒組織以及消毒后存儲組織的手段的需要。[0004]化學交聯(lián)的膠原基生物材料，諸如心血管補片、心瓣膜、基質和動脈，常常在交聯(lián)后被消毒并存儲在消毒溶液中，直到移植。在過去三十至四十年間，已經(jīng)測試和實施了若干化學交聯(lián)的膠原基生物材料的消毒方法，包括Y輻射、UV輻射和各種化學劑。盡管這些消毒方法大部分能有效預防污染，但不良作用，諸如結構損壞（肽鍵切割）和組織退化（抗拉強度降低），已經(jīng)使得一些這樣的方法在工業(yè)應用中較不受歡迎。[0005]例如，與戊二醛交聯(lián)的膠原基生物材料在暴露于醇基消毒溶液時會變得化學不穩(wěn)定，這是由于醇與組織中存在的殘留和未結合戊二醛的相互作用。醇與醛反應時形成不穩(wěn)定的半乙?；?。這些不穩(wěn)定的半乙酰基能夠與醇反應，形成乙酰基，乙酰基可分離，形成醛和醇。[0006]因此，目前，大部分膠原基生物材料制造商更喜歡使用戊二醛-甲醛組合用于化學交聯(lián)和非醒劑用于消毒。一種這樣的非醒劑是環(huán)氧乙燒（ethyleneoxide,oxirane)氣體，其已被用于消毒機械心瓣膜許多年。環(huán)氧乙烷氣體也已被用于消毒各種醫(yī)療裝置、一次性物品和機械心瓣膜。[0007]-旦膠原基生物材料已經(jīng)被消毒，其通常在植入前被保存一段時間。中長期存儲膠原基生物材料要求在生理學上穩(wěn)定的溶液中充分保護免于污染。盡管大部分商售膠原基生物材料仍存儲于醛基溶液中，但不良作用，諸如鈣化和纖維化也是眾所周知的。[0008]自1970年代以來，氧化丙烯已被用作消毒劑（見例如，Hart&Brown,1974,ApplMicrobiol,Dec.ρ·1069-1070;Brown&Ng,1975,ApplMicrobiol,Sept.p483_484)。在每種情況下，包括5%氧化丙烯加70%異丙醇或0.5%洗必泰或2%溴化十六烷基三甲銨的溶液能有效破壞細菌孢子懸浮物。然而，雖然已經(jīng)記錄了氧化丙烯的使用，但這通常是在醇（乙醇或異丙醇）的存在下應用的。因此，醇作為添加劑用于氧化丙烯消毒醛交聯(lián)組織（含殘留的醛）會導致醛水平升高，這又提高這些組織的鈣化可能和最終的生物假體失敗。[0009]因此，需要的是有效的消毒方法，該方法不僅消毒化學交聯(lián)的膠原基生物材料，而且還為消毒的生物材料提供便利的存儲介質?！?br/>發(fā)明內容】[0010]本【發(fā)明者】已經(jīng)發(fā)明了方法，該方法克服或至少緩解了與通常使用的用于交聯(lián)的膠原基生物材料的消毒和/或存儲方法有關的問題。toon]因此，在第一方面，本發(fā)明提供消毒交聯(lián)的膠原基生物材料的方法，包括使所述交聯(lián)的膠原基生物材料接觸包括3%和6%v/v之間的氧化丙烯的消毒溶液和在30°C和55°C之間溫育所述生物材料大于48小時；條件是消毒溶液不包含醇。[0012]在一些實施方式中，溫育溫度在30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、37°C、38°C、39°C、40°C、41°C、42°C、43°C、44°C、45°C、46°C、47°C、48°C、49°C、50°C、51°C、52°C、53°〇、541：和551：之間。在其它實施方式中，溫育溫度在301：和311：、321：、331：、341：、35°C、36°C、37°C、38°C、39°C、40°C、41°C、42°C、43°C、44°C、45°C、46°C、47°C、48°C、49°C、50°C、51°C、52°C、53°C、54°C或55°C之間。換言之，在范圍30°C和55°C之間的所有溫度組合均被考慮。在一些實施方式中，溫育溫度優(yōu)選在35°C和50°C之間，更優(yōu)選在40°C和48°C之間。在一些實施方式中，溫育溫度是大約45°C。[0013]當溫育階段過去后，即，已經(jīng)過去大于48小時，允許使溫度降至室溫。事實上，在初始48小時后，與在此時一樣，消毒的交聯(lián)的膠原基生物材料可保持在室溫一定的時間。當消毒的交聯(lián)的膠原基生物材料在氧化丙烯中已被溫育至少4天后，氧化丙烯將已經(jīng)轉化成丙二醇和膠原基生物材料將即可使用。[0014]在一些實施方式中，消毒溶液包含3.8%和4.5%v/v之間的氧化丙烯。在其它實施方式中，消毒溶液包含大約4%v/v的氧化丙烯。在一些實施方式中，消毒溶液主要由3%和6%v/v之間的氧化丙烯組成，更優(yōu)選消毒溶液由3%和6%v/v之間的氧化丙烯組成。在一些實施方式中，消毒溶液主要由3.8%和4.5%v/v之間的氧化丙烯組成，更優(yōu)選消毒溶液由3.8%和4.5%v/v之間的氧化丙烯組成。在一些實施方式中，消毒溶液主要由約4%v/v的氧化丙烯組成，更優(yōu)選消毒溶液由約4%v/v的氧化丙烯組成。[0015]應該理解，醇，尤其是乙醇和/或異丙醇不用于本發(fā)明的消毒溶液。[0016]要求消毒步驟進行大于48小時（2天）；然而，因為消毒溶液也可被用作存儲介質，所以消毒步驟可進行2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天。[0017]交聯(lián)的膠原基生物材料可以是任何材料，包含膠原、主要由膠原組成或由膠原組成。在一些實施方式中，膠原基生物材料直接分離自動物。生物材料可分離自任何動物，無論是來自與接受者相同的物種或來自與接受者不同物種的動物。優(yōu)選地，動物來自哺乳動物目之一，即，偶蹄目（Artiodactyla)、兔形目（Lagomorpha)、卩齒齒目（Rodentia)、奇蹄目(Perissodactyla)、食肉目（Carnivora)和有袋目（Marsupialia)。更優(yōu)選地，動物選自綿羊、牛、山羊、馬、豬、有袋類動物和人。[0018]生物材料可以是任意類型的細胞組織。優(yōu)選地，細胞組織選自心血管組織、心組織、心瓣膜、主動脈根、主動脈壁、主動脈小葉、心包組織、結締組織、硬膜、皮組織、血管組織、軟骨、心包膜、韌帶、腱、血管、臍組織、骨組織、筋膜、和粘膜下層組織和皮膚。[0019]在一些實施方式中，生物材料是和/或包含不連續(xù)的，即，分離的膠原，而不是天然產(chǎn)生的含膠原組織。不連續(xù)的膠原可以其分離狀態(tài)使用或形成本領域中已知的任意醫(yī)療裝置或制品。[0020]在一些實施方式中，生物材料是培養(yǎng)的組織、含獲自動物的細胞外基質的假器官、重構組織（例如膠原基質）或類似物。[0021]還應該理解，生物材料可進一步包含由合成聚合物、生物聚合物或兩者一包括通常在天然組織基質中發(fā)現(xiàn)的那些在內一形成的合成類似物。合適的合成聚合物包括，例如聚酰胺和聚砜。生物聚合物可以是天然產(chǎn)生的或通過例如發(fā)酵和類似方法體外產(chǎn)生。[0022]在第二方面，本發(fā)明提供用于消毒膠原基生物材料的方法，包括：[0023](a)提供膠原基生物材料并用冰冷的0.9%v/v鹽水溶液進行洗滌，并且，將所述生物材料放入冰冷的〇.9%v/v鹽水/苯基-甲基-磺?；?氟化物（PMSF)中；[0024](b)使所述膠原基生物材料與0·625%v/v的戊二醛溶液和磷酸二氫鉀，ρΗ7·4接觸，并將其在大約1-5°C溫育至少5天，以產(chǎn)生交聯(lián)的膠原基生物材料；[0025](c)在大約10°C，在無菌0.9%v/v氯化鈉中漂洗所述交聯(lián)的膠原基生物材料，然后使交聯(lián)的膠原基生物材料與包括3.8%和4.5%v/v之間的氧化丙烯的消毒溶液接觸，和在30°C和55°C之間溫育所述組織大于48小時；條件是消毒溶液不包含醇。[0026]在第三方面，本發(fā)明提供存儲消毒的、交聯(lián)的膠原基生物材料的方法，包括使交聯(lián)的膠原基生物材料與包括3%和6%v/v之間的氧化丙烯的溶液接觸，和在30°C和55°C之間溫育所述生物材料大于48小時，然后使所述生物材料保持接觸所述氧化丙烯，直到它們轉化成丙二醇；條件是溶液不包含醇。[0027]在第四方面，本發(fā)明提供由根據(jù)第一、第二或第三方面的方法產(chǎn)生的消毒的、交聯(lián)的膠原基生物材料。[0028]應該理解，當通過本發(fā)明方法已經(jīng)獲得消毒的、交聯(lián)的膠原基生物材料后，其可被可植入生物裝置包括。因此，在第五方面，本發(fā)明提供可植入生物裝置，其包括根據(jù)第四方面的消毒的、交聯(lián)的膠原基生物材料。[0029]在本發(fā)明的進一步的方面，本發(fā)明交聯(lián)的膠原基生物材料包含在試劑盒中，用于修復組織損傷。因此，在第六方面，本發(fā)明提供試劑盒，用于修復組織損傷，試劑盒包括：[0030](a)無菌容器，其包含根據(jù)第四方面的消毒的、交聯(lián)的膠原基生物材料或根據(jù)第五方面的裝置；和[0031](b)在受傷對象上使用的說明書。[0032]在第七方面，本發(fā)明提供容器，其包括消毒的、交聯(lián)的膠原基生物材料和3%至6%v/v的丙二醇溶液，其中所述丙二醇產(chǎn)生自3%至6%v/v的氧化丙烯溶液在生物材料存在時的原位轉化。[0033]本發(fā)明膠原基生物材料可通過本領域中已知的任意交聯(lián)膠原的方法而被交聯(lián)，所述交聯(lián)膠原的方法包括、但不限于Eyre等，1984,Annu.Rev.Biochem.537,717-748;Eyre,1982,In:SymposiumonHeritableDisordersofConnectiveTissue(Akeson等eds)pp.43-58,Mosby,St.Louis,Missouri；Davison&Brennan,1983,Connect.TissueRes.11,135-151；Robins,1982,MethodsBiochem.Analysis,28,330-379；Reiser,1991,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.196,17-29中描述的方法，其均通過引用以其整體并入本文。然而，交聯(lián)本發(fā)明膠原基生物材料的優(yōu)選方法包括：[0034](a)使膠原基生物材料暴露于含醇溶液至少24小時；[0035](b)使步驟（a)中所述生物材料暴露于交聯(lián)劑；和[0036](c)使步驟（b)中所述生物材料暴露于酸性溶液；[0037]其中步驟（b)和（c)與步驟（a)是連續(xù)的。[0038]步驟（a)中使用的含醇溶液優(yōu)選是水基液體，S卩，具有大于按體積計約50%v/v醇和優(yōu)選60%至80%之間醇的水溶液?？梢允褂镁彌_或非緩沖含醇溶液；然而，優(yōu)選使用非緩沖含醇溶液，因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，緩沖含醇溶液不利地影響隨后的交聯(lián)程序，產(chǎn)生黃色生物材料。[0039]優(yōu)選交聯(lián)方法可在含醇溶液中使用本領域中已知的任何醇。優(yōu)選地，在不含緩沖劑的溶液中，醇是(；_(；低級醇。甚至更優(yōu)選地，醇選自甲醇、乙醇、環(huán)己醇、異丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、異丁醇、仲-丁醇和叔-丁醇。[0040]在一些實施方式中，含醇溶液包含兩種或更多種醇的混合物，條件是醇的組合的體積大于50%v/v。例如，約70%v/v乙醇和約10%v/v異丁醇的混合物是有效的。[0041]步驟（a)中的生物材料可被暴露于含醇溶液任意長的時間，只要其足以使生物材料抵抗體內致病鈣化。優(yōu)選地，生物材料保持接觸含醇溶液足夠長的時間，以使醇能夠擴散和滲透到生物材料中。更優(yōu)選地，生物材料被暴露于含醇溶液至少24小時，甚至更優(yōu)選至少36小時和最優(yōu)選地，至少48小時。[0042]暴露于含醇溶液之后，生物材料被移除和暴露于一種或更多種交聯(lián)劑。本領域中已知的任意形式的交聯(lián)劑或其組合均可被使用，只要其能夠交聯(lián)膠原。因此，應該理解，交聯(lián)劑包括但不限于二乙烯基砜（DVS)、聚乙二醇二乙烯基砜（VS-PEG-VS)、羥乙基甲基丙烯酸酯二乙烯基砜（HEMA-DIS-HEMA)、甲醛、戊二醛、醛、異氰酸酯、烷基和芳基鹵化物、亞氨酸酯、N-取代的馬來酰亞胺、乙?；衔?、碳二亞胺、羥基氯化物、N-羥基琥珀酰亞胺、光(例如，藍光和UV光）、pH、溫度和其組合。優(yōu)選地，交聯(lián)劑是化學交聯(lián)劑，選自碳二亞胺、聚環(huán)氧醚、二乙烯基砜（DVS)、聚醛和二苯基磷?；B氮化物（DPPA)。[0043]在一些實施方式中，聚醛是雙_、三-或二-醛。戊二醛是特別優(yōu)選的。[0044]在一些實施方式中，交聯(lián)步驟（b)之后是步驟（c)--具有或不具有介入的洗滌步驟。步驟（c)中使用的酸性溶液包含能夠失活和/或改性步驟（b)后生物材料中存在的固定和/或未固定交聯(lián)劑部分以去除或減少可用的鈣結合點的任何酸?？蛇x地，或者另夕卜，步驟（c)中使用的酸性溶液含有能夠進一步交聯(lián)膠原上活化的羧基與活化的胺基團以形成酰胺鍵的任何酸。優(yōu)選地，酸性溶液中的酸包含氨基羧酸。優(yōu)選地，氨基羧酸是具有至少一個氨基基團和至少一個羧酸取代基的酸。更優(yōu)選地，氨基羧酸選自L-精氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-谷氨酸鹽或L-天冬氨酸鹽。[0045]利用0.9%v/v鹽水的不含磷酸鹽的溶液進行漂洗生物材料的步驟。[0046]雖然本領域的技術人員將會理解，優(yōu)選交聯(lián)方法中各步驟實施的溫度不是關鍵的，但應該理解，優(yōu)選地，溫度在2°C和40°C之間，更優(yōu)選在4°C和30°C之間和最優(yōu)選地，在5°C和25°C之間。[0047]在一個實施方式中，醇、酸性溶液和漂洗溶液均是不含緩沖劑的?！緦＠綀D】【附圖說明】[0048]圖1顯示2%氧化丙烯在15°C和45°C之間的不同溫度隨著時間對枯草芽孢桿菌(B.subtilis)孢子的作用。[0049]圖2顯示4%氧化丙烯在15°C和45°C之間的不同溫度隨著時間對枯草芽孢桿菌孢子的作用?！揪唧w實施方式】[0050]在詳細描述本發(fā)明之前，應該理解，本發(fā)明不限于具體示例的生產(chǎn)方法，當然，該方法可以變化。還應該理解，本文使用的術語僅為了描述本發(fā)明【具體實施方式】的目的，而不意圖限制只能由所附權利要求書進行限定的內容。[0051]本文引用的所有出版物、專利和專利申請--無論是在上文中還是在下文中--均通過引用以其整體被并入本文。然而，引用本文提及的出版物是為了描述和公開出版物中報道的并且可以結合本發(fā)明應用的方案和試劑的目的。本文中的任何內容都不能被理解為承認本發(fā)明由于之前的發(fā)明而沒有資格早于這樣的公開內容。[0052]而且，本發(fā)明的實踐應用--除非另有說明--本領域的技能之內的常規(guī)免疫技術、化學和藥理學。這樣的技術是熟練的工人熟知的，并且在文獻中被充分說明°見，例如，Coligan,Dunn,Ploegh,SpeicherandWingfield"CurrentprotocolsinProteinScience"（1999)VolumeIandII(JohnWiley&SonsInc.);和Bailey，J.E.andOllis,D.F.,BiochemicalEngineeringFundamentals,McGraw-HillBookCompany,NY,1986；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(MayerandWalker,eds.,AcademicPress,London,1987)；HandbookOfExperimentalImmunology,VolumesI_IV(D.M.WeirandC.C.Blackwell,eds·，1986)。[0053]必需注意，如本文和所附權利要求書所使用的，單數(shù)形式"一"（"a，""an，"）和"該"所述"，"the"）包括復數(shù)指代，除非上下文另外明確說明。因此，例如，提及"一種交聯(lián)劑"包括多種這樣的劑，和提及"一種醇"是指一種或更多種醇等等。除非另外限定，本文使用的所有技術和科學術語均具有本發(fā)明所述領域的普通技術人員通常所理解的含義。盡管類似于或等同于本文描述的材料和方法的任何材料和方法均可用于實踐或測試本發(fā)明，但現(xiàn)在描述優(yōu)選材料和方法。[0054]在一個最寬的方面，本發(fā)明涉及用于消毒膠原基生物材料的方法。[0055]如本文所使用的，術語"生物材料"是指任意含膠原材料，其潛在地具有生物學用途。膠原可以是來自任意源的任意類型的膠原，并且可以單獨存在或結合其它材料而存在。因此，膠原可表示為少至生物材料總重量的1%w/w或多至100%。[0056]如本文所使用的，術語"膠原"是指細胞外纖維蛋白家族，其特征在于其硬的、三鏈螺旋結構。三條膠原多肽鏈（"α-鏈"）彼此纏繞，以形成該螺旋分子。該術語還意圖包括各種類型的膠原。[0057]膠原螺旋狀部分的主要部分在哺乳動物物種之間幾乎沒有變化。事實上，一些膠原類型具有高度的核苷酸和氨基酸序列同源性。例如，在比較人、馬和鼠科動物時，膠原αI型II的核苷酸序列同源性為至少88%。人和馬在核苷酸水平具有93%序列同源性，而小鼠和馬具有89%序列同源性。人和小鼠的核苷酸序列同源性是88%(見，NCBI登錄號U62528(馬）、ΝΜ033150(人）和ΝΜ031163(小鼠）http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。其它類型的膠原具有類似水平的氨基酸同源性。例如，豬膠原αI型I和綿羊膠原αI型I之間的核苷酸序列同源性是90%(見，NCBI登錄號AF29287(綿羊）和AF201723(豬）http://www.ncbi.nlm.nih.gov)〇[0058]考慮到許多上述動物的共同祖先和生物學的水平、一些物種諸如牛、羊、小鼠和豬之間膠原的高度氨基酸和核苷酸序列同源性，本領域的技術人員會理解，本文所公開的生產(chǎn)生物材料的方法可適用于分離自所有哺乳動物的膠原材料。[0059]因此，在一些實施方式中，生物材料分離或收獲自哺乳動物目之一的動物，S卩，偶蹄目、兔形目、嚙齒目、奇蹄目、食肉目和有袋目。動物優(yōu)選是綿羊、牛、山羊、馬、豬、有袋類動物或人。盡管生物材料優(yōu)選分離自與接受者相同的動物物種，但考慮生物材料可分離自與接受者不同的物種。[0060]可選地，在一些實施方式中，生物材料包含培養(yǎng)的組織、重構的組織或類似物。[0061]生物材料可以是任意類型的細胞組織。例如，細胞組織可以是心血管組織、骨盆底組織、心組織、心瓣膜、主動脈根、主動脈壁、主動脈小葉、心包組織、結締組織、軟或實體器官的基質、皮組織、血管組織、硬膜、軟骨、心包膜、韌帶、腱血管、臍組織、骨組織、筋膜、和粘膜下層組織或皮膚，因為所有這些均包含一些膠原。[0062]還應該理解，生物材料可進一步包含由合成聚合物、純化的生物聚合物或兩者--包括通常在天然組織基質中發(fā)現(xiàn)的那些在內--形成的合成類似物。合適的合成聚合物包括，例如聚酰胺和聚砜。生物聚合物可以是天然產(chǎn)生的或通過，例如發(fā)酵和類似方法體外產(chǎn)生。[0063]通過技術，諸如編織、接合、澆鑄、模塑、擠出、細胞排列和磁排列，純化的生物聚合物可適當?shù)匦纬傻孜铩：线m的生物聚合物包括但不限于膠原、彈性蛋白、絲、角蛋白、明膠、聚氨基酸、多糖（例如纖維素和淀粉）以及任意這些的共聚物。例如，膠原和彈性蛋白聚合物可通過任意各種技術，諸如編織和模塑，而形成合成可植入材料。合成組織類似物模仿天然組織基質。可選地，合成底物可用于形成組織類似物--單獨的或與天然產(chǎn)生的底物一起。非限制性實例包括聚丙烯、聚乳酸、聚酯、尼龍、硅氧烷等。[0064]生物材料在獲得后即被交聯(lián)。交聯(lián)可利用任意熟知的程序，包括但不限于以下文獻中描述的那些：Eyre等，1984,Annu.Rev.Biochem.537,717-748;Eyre,1982,In:SymposiumonHeritableDisordersofConnectiveTissue(Akeson等eds)pp.43-58,Mosby,St.Louis,Missouri；Davison&Brennan,1983,Connect.TissueRes.11,135-151；Robins,1982,MethodsBiochem.Analysis28,330-379；Reiser,1991,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.196,17-29〇[0065]優(yōu)選交聯(lián)方法公開在申請人:的國際專利申請W02006/066327中，其通過引用以其整體被并入本文。簡言之，交聯(lián)本發(fā)明膠原基生物材料的優(yōu)選方法中的初始步驟包括使生物材料接觸含醇溶液。如本文所使用的，術語"接觸的"或"接觸"是指將膠原基生物材料浸入本文所述溶液或劑中的活化步驟，或者如下文所述，隨后使生物材料與交聯(lián)劑、酸性溶液或其它物質接觸足夠的時間段以產(chǎn)生期望的結果。使生物材料接觸，例如含醇溶液的方法在本領域中是眾所周知的。例如，一般地，生物材料可通過將生物材料噴霧、浸漬或浸入溶液或劑而被接觸。[0066]如本文所使用的，術語"醇"是指本領域中已知的任何醇，其能夠去除或減少甘油三酯的量和至少部分酯化在膠原上發(fā)現(xiàn)的羧基。優(yōu)選地，醇是水溶性醇。更優(yōu)選地，醇是不含緩沖劑的溶液中的Ci-C；低級醇。甚至更優(yōu)選地，醇選自甲醇、乙醇、環(huán)己醇、異丙醇、丙醇、丁醇、戊醇、異丁醇、仲-丁醇和叔-丁醇。[0067]不希望受任何具體理論或假說的束縛，本【發(fā)明者】考慮，含醇溶液有助于松開膠原三螺旋，從而暴露疏水位點（見，Karube&Nishida,1979,BiochimBiophysActa.，23;581(1):106-13)。他們還考慮，膠原中發(fā)現(xiàn)的羧基和胺基團在含醇溶液存在下被酯化，以便它們變得可在后面的步驟中用于交聯(lián)。因此，優(yōu)選醇溶液是這樣的醇溶液：其在不含緩沖劑的含水溶液中包括至少約50%v/v，更優(yōu)選至少約70%v/v和最優(yōu)選至少約80%v/v醇。在一個實施方式中，醇溶液是70%乙醇￥八在0.9%鹽水（含0.5禮？10〇中。[0068]在一些實施方式中，本文使用的含醇溶液以及其它溶液和試劑是"不含緩沖劑的"，因為假設含有醛的交聯(lián)劑在固定期間與緩沖劑起反應，導致醛解聚。[0069]使生物材料接觸含醇溶液的步驟可進行任意長的時間，只要該時間足以使生物材料抵抗體內致病鈣化，并且大部分（即，高百分比）在膠原中發(fā)現(xiàn)的羧基和胺基團被酯化。優(yōu)選地，生物材料保持接觸含醇溶液足夠長的時間，以使醇能夠擴散和滲透到生物材料中。更優(yōu)選地，生物材料被暴露于含醇溶液至少24小時、甚至更優(yōu)選至少36小時和最優(yōu)選地，至少48小時。[0070]膠原基生物材料一旦已經(jīng)被暴露于醇即被去除。在一些實施方式中，生物材料在暴露于醇后在漂洗溶液中被漂洗，漂洗溶液包括0.9%v/v鹽水的不含磷酸鹽的溶液。然而，任意非緩沖生理學上可接受的溶液均可被用作漂洗溶液。漂洗溶液的目的主要是去除過多的醇，因此不是關鍵的。[0071]在膠原基生物材料已經(jīng)被暴露于醇大于24小時之后，其然后接觸一種或更多種交聯(lián)劑，尤其是雙官能交聯(lián)劑。如本文所使用的，術語"雙官能的"是指兩個官能醛基，其存在于五碳鏈的兩端。交聯(lián)可通過本領域中已知的任意技術、用任意形式的交聯(lián)劑進行，只要其能夠交聯(lián)膠原。交聯(lián)劑包括但不限于乙?；衔?、己二酰二氯、醛、烷基和芳基鹵化物、雙亞胺酸酯（bisimidate)、碳二亞胺、二乙烯基砜（DVS)、甲醛、戊二醛、乙二醛、六亞甲基二異氰酸酯、羥基氯化物、羥乙基甲基丙烯酸酯二乙烯基砜（HEMA-DIS-HEMA)、亞氨酸酯、異氰酸酯、光（例如藍光和UV光）、N-羥基琥珀酰亞胺、N-取代的馬來酰亞胺、pH、聚醛、二苯基磷酰基疊氮化物（DPPA)、聚環(huán)氧化合物--包括17-25個碳和4-5個環(huán)氧基團的骨架、聚環(huán)氧醚、聚乙二醇二乙烯基砜（VS-PEG-VS)、聚甘油縮水甘油醚和溫度及其組合。[0072]在一些實施方式中，交聯(lián)劑是化學交聯(lián)劑諸如碳二亞胺、聚環(huán)氧醚、二乙烯基砜(DVS)、京尼平（Genipin)、戊二醛、甲醛和二苯基磷?；B氮化物（DPPA)。[0073]還證明，包括17-25個碳和4-5個環(huán)氧基團的骨架的聚環(huán)氧化合物對于交聯(lián)膠原表現(xiàn)出高效（見，例如美國專利申請?zhí)?0040059430(S/N10/618,447)。還顯示聚環(huán)氧化合物的毒性低于戊二醛的毒性，并且，如果與螺旋狀多肽分子諸如膠原起反應，組織的抗原性或免疫應答誘導與反應時間成比例地下降。自然地，其顯示相對好的生物相容性（見，例如，Lohre等，（1992)，Artif.Organs,16:630-633;Uematsu等，（1998)，Artif.Organs,22:909-913)。因此，所述聚環(huán)氧化合物是一種優(yōu)選交聯(lián)劑。[0074]在一些實施方式中，交聯(lián)劑包含大約1%戊二醛和暴露時間為至少約24小時。應該理解，將生物材料暴露于交聯(lián)劑的時間長度取決于所使用的劑、濃度和溫度。通常，暴露時間在24小時至28天之間。生物材料暴露于交聯(lián)劑的精確暴露時間量的確定在本領域技術人員的范圍內。[0075]再次，不希望受任何具體理論或假說的束縛，【發(fā)明者】考慮，通過將已經(jīng)暴露于醇的膠原基生物材料暴露于交聯(lián)劑，生物材料中存在的膠原上的酯化的羧基和胺基團被交聯(lián)。[0076]雖然本領域的技術人員將會理解，優(yōu)選交聯(lián)方法各步驟執(zhí)行的溫度不是關鍵的，但應該理解，優(yōu)選地，溫度在2°C和40°C之間，更優(yōu)選在4°C和30°C之間和最優(yōu)選地，在5°C和25°C之間。[0077]再次，在交聯(lián)步驟之后，膠原基生物材料優(yōu)選在漂洗溶液中被漂洗，所述漂洗溶液諸如在醇暴露步驟（a)后使用的漂洗溶液。然而，再次應該理解，漂洗步驟僅僅是優(yōu)選。[0078]在交聯(lián)步驟之后，或者在使用的情況下，在交聯(lián)步驟之后的漂洗步驟之后，膠原基生物材料可然后被消毒的，以供本文所述方法使用?？蛇x地，膠原基生物材料接觸酸性溶液，所述酸性溶液包含能夠失活和/或改性步驟（b)后生物材料中存在的固定和/或未固定交聯(lián)劑部分以去除或減少可用的鈣結合點的任何酸。可選地，或者另外，步驟（c)中使用的酸性溶液含有能夠進一步交聯(lián)膠原上活化的羧基與活化的胺基團以形成酰胺鍵的任何酸。[0079]優(yōu)選地，酸性溶液包含至少一種氨基羧酸。如本文所使用的，術語"氨基羧酸"是具有至少一個氨基基團和至少一個羧酸取代基的任意酸。在本發(fā)明中有用的氨基羧酸的代表性實例包括但不限于L-谷氨酸鹽、L-天冬氨酸鹽、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸。酸性溶液的目的是雙重的：首先，氨基羧酸有助于固定和未固定交聯(lián)劑部分的失活和/或改性，從而減少或減輕任意不良生物作用。其次，氨基羧酸進一步交聯(lián)膠原上的活化的羧基與活化的胺基團，以形成酰胺鍵。[0080]氨基羧酸的濃度將取決于使用的實際的酸和其它參數(shù)，諸如使用的生物材料的總質量等。另外，氨基羧酸與生物材料的最小濕重比可為約1:4。酸性溶液的最重要的方面是pH。pH必須低于pH7,優(yōu)選低于pH6,更優(yōu)選低于pH5和最優(yōu)選低于約pH4.6。[0081]在一個實施方式中，酸性溶液是每毫升去離子水8mg氨基羧酸，其是不含磷酸鹽的和約pH4。[0082]交聯(lián)的膠原基生物材料被暴露于氨基羧酸至少6小時，更優(yōu)選至少24小時，甚至更優(yōu)選大于48小時。雖然溫育溫度不是關鍵的，但其優(yōu)選在5°C和55°C之間，更優(yōu)選10°C和45°C之間，最優(yōu)選約45°C。[0083]在一些實施方式中，公開的交聯(lián)方法的步驟（c)由抑制金屬蛋白酶在生物材料中存在的彈性蛋白分子上形成的方法替代或補充。具體地，與其它組織相比，在組織諸如主動脈組織中，存在更高百分比的彈性蛋白。這些彈性蛋白分子可提供形成金屬蛋白酶的位點，因此，這些位點需要被減少、去除或失活。[0084]在將生物材料暴露于酸性溶液和/或含有多價陽離子的不含緩沖劑的溶液的步驟之前或之后，交聯(lián)的膠原基生物材料再次優(yōu)選在漂洗溶液中被漂洗。交聯(lián)的膠原基生物材料然后被消毒。[0085]消毒生物材料的步驟包括使交聯(lián)的膠原基生物材料接觸包括3%和6%v/v之間的氧化丙烯的消毒溶液和在30°C和55°C之間溫育所述生物材料大于48小時；條件是消毒溶液不包含醇。[0086]應該理解，醇，尤其是乙醇和/或異丙醇不用于本發(fā)明的消毒溶液。[0087]已經(jīng)很好地確定，在升高的溫度下，例如高于55°C，膠原經(jīng)歷細胞內降解。事實上，已經(jīng)顯示，人皮膚成纖維細胞內的膠原在高于41°C的溫度下開始經(jīng)歷加強的降解(Palotie，1983,CollRelatRes.Mar;3(2):105-13)。因此，在消毒本發(fā)明交聯(lián)的膠原基生物材料中，溫育溫度是關鍵因子。溫度優(yōu)選不大于55°C，因為這增加膠原開始降解的機會。然而，如在實施例9和別處所述，重要的是溫育溫度不小于30°C，因為低于30°C的溫度已經(jīng)降低消毒潛力。[0088]本領域技術人員會理解，低于3%的氧化丙烯濃度將不會提供充分的消毒，如本文所限定的。高于6%的氧化丙烯濃度是有毒性的，并對生物材料的完整性具有不良影響。在一些實施方式中，消毒溶液包含3.8%和4.5%之間氧化丙烯。在其它實施方式中，消毒溶液包含大約4%氧化丙烯。在一些實施方式中，消毒溶液主要由3%和6%之間氧化丙烯組成，更優(yōu)選消毒溶液由3%和6%之間氧化丙烯組成。在一些實施方式中，消毒溶液主要由3.8%和4.5%之間氧化丙烯組成，更優(yōu)選消毒溶液由3.8%和4.5%之間氧化丙烯組成。在一些實施方式中，消毒溶液主要由約4%氧化丙烯組成，更優(yōu)選消毒溶液由約4%氧化丙烯組成。[0089]如本文所使用的，術語"約"是指偏離術語的值10%以上或以下。例如，提及約4%氧化丙烯包括3.6%和4.4%之間范圍，S卩，4%值上下10%的范圍。這包括3.7%、3.8%、3·9%、4·0%、4·1%、4·2%、4·3%和4.4%氧化丙烯。[0090]要求消毒步驟進行大于48小時；然而，如本文所述，氧化丙烯也可被用作存儲介質，因此，消毒步驟可進行至少2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天。[0091]本文所述方法的一個主要益處是本文所用的消毒溶液，即，3%和6%v/v之間的氧化丙烯，將不僅消毒含膠原組織而不影響膠原原纖維，而且因為氧化丙烯在與生物材料接觸約4天后轉化成丙二醇（其沒有毒性），在初始48小時后，消毒的交聯(lián)的膠原基生物材料可良好地保持在消毒溶液中。事實上，考慮交聯(lián)的膠原基生物材料將被消毒和存儲，然后在相同容器中被船運至末端消費者而無須進一步處理。[0092]如本文所使用的，術語"消毒"意為交聯(lián)的膠原基生物材料滿足ISO14160的要求。ISO14160覆蓋保健用品的消毒，并涉及用于利用動物組織及其衍生物的單用途醫(yī)療裝置的液體化學消毒劑。簡言之，ISO14160要求組織接種以枯草芽孢桿菌孢子，然后被處理以除去污染物。ISO14160試驗的要求描述在上面實施例6中。[0093]在一些實施方式中，消毒溶液是不含緩沖劑的。在其它實施方式中，溶液包含去離子水。[0094]用本文公開的方法處理后，交聯(lián)的膠原基生物材料具有高水平的鈣化抗性，S卩，其是"抗鈣化生物材料"。如本文所使用的，術語"鈣化"是指與傳統(tǒng)生產(chǎn)的包含結締組織蛋白質（即，膠原和彈性蛋白）的生物材料有關的主要病理問題之一。之前已經(jīng)顯示，在植入體內后，這些材料可變得鈣化。這樣的鈣化可導致不期望的生物材料的硬化或降解。兩（2)種類型的鈣化：內在的和外在的，已知發(fā)生在固定的膠原生物材料中，盡管這樣的鈣化發(fā)生的確切機理（一種或多種）是未知的。內在的鈣化特征在于鈣和磷酸鹽離子在固定的生物假體組織--包括膠原基質和剩余細胞--中的沉淀。外在鈣化特征在于鈣和磷酸鹽離子在生物材料的貼壁（粘連，adherent)血栓-包括貼壁細胞-（例如，血小板）內的沉淀和生物材料上含磷酸鈣表面斑點的形成。[0095]因此，在應用于本發(fā)明的生物材料時，用語"高水平的鈣化抗性"或"抗鈣化"意為在體內植入至少200天后，生物材料在其去除后顯示小于50μg，優(yōu)選小于20μg和甚至更優(yōu)選小于10μg鈣/mg干燥組織。[0096]優(yōu)選地，本發(fā)明的生物材料還抵抗酶促降解。如本文所使用的，術語"抵抗酶促降解"是指本發(fā)明生物材料抵擋酶促降解的能力達到與傳統(tǒng)固定的組織相當?shù)乃?。[0097]-旦形成，本發(fā)明消毒的、交聯(lián)的膠原基生物材料可然后用于治療一些狀況和/或疾病。[0098]通常，術語"治療（treating或treatment)"等在本文中用于表示影響個體或動物、其組織或細胞，以獲得期望的藥理學和/或生理學作用。就狀況和/或疾病部分或全部治愈而言，該作用尤其是治療性的。如本文所使用的，"治療"涵蓋在脊椎動物、哺乳動物，尤其是人中對狀況和/或疾病的任何治療，包括：(a)抑制狀況和/或疾病，S卩，防止其發(fā)展；或（b)減輕或改善狀況和/或疾病的癥狀，S卩，導致酶促降解/狀況和/或疾病的癥狀消退。[0099]在本文中，術語"狀況"和/或"疾病"可互換使用，指影響動物，包括人的異常狀況，其可利用本發(fā)明的生物材料治療。因此，對傷口、損傷、組織退化、微生物感染、燒傷、潰瘍、皮狀況的治療包括在本發(fā)明內。而且，心瓣膜、主動脈根、主動脈壁、主動脈小葉、心包組織、結締組織、硬膜、皮組織、血管組織、軟骨、心包膜、韌帶、腱血管、臍組織、骨組織、筋膜、和粘膜下層組織的置換也包括在內。[0100]本發(fā)明的抗鈣化生物材料還可應用于醫(yī)療裝置的各種接觸表面的任一種。接觸表面包括但不限于意圖接觸動物--尤其包括人--的血液、細胞或其它體液或組織的表面。合適的接觸表面包括一個或更多個意圖接觸血液或其它組織的醫(yī)療裝置表面。醫(yī)療裝置包括動脈瘤線圈、人造血管、人造心、人造瓣膜、人造腎、人造腱和韌帶、血袋、血充氧器、骨和心血管替換物、骨假器官、骨蠟、心血管移植物、軟骨替換裝置、導管、接觸鏡、用于細胞和組織培養(yǎng)和再生的容器、栓塞顆粒、過濾系統(tǒng)、移植物、導向通道、留置導管、實驗室儀器、微珠、神經(jīng)生長導軌、眼移植物、矯形移植物、起搏器導線、探針、假器官、支路、支架、肽支持物、手術儀器、縫合線、注射器、尿道植入物、傷口包覆材料、傷口敷料、傷口愈合裝置和本領域中已知的其它醫(yī)療裝置。[0101]可得益于應用本發(fā)明的醫(yī)療裝置的其它實例對于手術和醫(yī)療程序領域的技術人員來說是顯而易見的，因而被本發(fā)明考慮。接觸表面可包括篩眼、線圈、線材、可充氣氣囊或能夠被植入到目標位置的任意其它結構，所述目標位置包括血管內位置、腔內位置、實體組織內的位置等。可植入裝置可計劃用于永久或暫時植入。這樣的裝置可通過血管內和其它醫(yī)療導管輸送或結合到血管內和其它醫(yī)療導管中。[0102]涂覆這樣的裝置的表面的方法可通過國際專利申請?zhí)朩096/24392中描述的等離子體涂覆技術來執(zhí)行。[0103]"包括"意為包括、但不限于詞語"包括"后面的所有內容。因此，術語"包括"的使用表明所列元素是必需的或強制性的，但其它元素是可選的并且可以存在或不存在。"由…組成"意為包括和限于用語"由…組成"后面的所有內容。因此，用語"由…組成"表示所列元素是必需的或強制性的，并且不存在其它元素。"主要由…組成"意為包括該用語后列出的任何元素，并限于不干涉或促進在公開內容中針對所列元素指定的活性或作用的其它元素。因此，用語"主要由…組成"表示所列元素是必需的或強制性的，但其它元素是可選的并且可以存在或不存在，這取決于它們是否影響所列元素的活性或作用。[0104]現(xiàn)在將通過僅參考以下非限制性實施例的方式進一步描述本發(fā)明。然而，應該理解，下面的實施例僅是說明性的，而不應該以任何方式被看做是對上面描述的本發(fā)明的一般性的限制。[0105]實施例1牛物材料的基本加工和存儲[0106]膠原衍生的生物材料的收獲[0107]在當?shù)赝涝讏鍪斋@成年豬的豬心，并在死亡后2-4小時內在冰袋上運輸至實驗室。在冰冷0.9%v/v鹽水溶液中洗滌心兩次，并從貼壁脂肪和松散結締組織仔細地進行清潔。將具有主動脈瓣的主動脈根從心切除并放入冰冷〇.9%v/v鹽水/苯基-甲基-磺酰基-氟化物（PMSF)，并在含PMSF的0.9%v/v鹽水溶液中洗滌具有瓣膜的主動脈根20分鐘。從主動脈瓣口去除瓣膜小葉并存貯在冰冷〇.9%v/v鹽水溶液中。[0108]生物材料的交聯(lián)（固定）[0109]在無菌去離子水中制備含9.07g/l磷酸二氫鉀緩沖劑的0.625%v/v的戊二醛溶液。用氫氧化鈉將戊二醛溶液的pH調至7.4。主動脈瓣小葉在戊二醛溶液中在1-5°C下交聯(lián)5天的最小時期，以交聯(lián)存在于組織膠原中的蛋白質。[0110]漂洗交聯(lián)的生物材料[0111]從戊二醛溶液中去除主動脈瓣小葉，并在無菌〇.9%v/v氯化鈉中漂洗約15分鐘。在漂洗階段中，漂洗溶液溫度維持在大約10°c。[0112]生物材料的最終消毒和存儲[0113]將豬主動脈瓣小葉浸入含29.02g/l磷酸二氫鉀緩沖劑的戊二醛在無菌去離子水中的2.0%v/v溶液中。用氫氧化鈉將醛溶液的pH調至7.4。消毒過程在大約25°C下進行5天。將消毒的組織分成四組并存儲于：（i)0.625%v/v戊二醛、（ii)5.0%v/v戊二醛、(iii)10%v/v戊二醒；和（iv)2%v/v的氧化丙烯，直到進一步的使用。[0114]實施例2存儲溶液對牛物材料鈣化屬件（profile)的影響[0115]在小和大動物模型中進行試驗研究，以評估上述消毒-存儲方法在減輕處理的含膠原生物材料的鈣化中的效率。[0116]在第一動物研究中，根據(jù)實施例1描述的方法消毒和存儲的豬主動脈瓣小葉被用于在小動物模型中進行評估。[0117]所有四組的消毒和存儲的豬主動脈瓣小葉均在0.9%v/v鹽水中被漂洗5分鐘。漂洗的組織經(jīng)手術植入皮下袋中（一只大鼠每組一個樣品），在成長的出周齡）雄性Wistar大鼠的中央腹壁區(qū)產(chǎn)生。這些組織在60天后去除，宿主組織被去除，并將樣品在Biotherm?培養(yǎng)箱（MarcusMedical,JHB，RSA)中，在90°C下干燥48h。干燥樣品被稱重，并在5.0ml6N超純鹽酸（Merck，JHB，RSA)中，在75°C下提取鈣含量24h。然后利用原子吸收分光光度計(VarianAA1275)測量可提取的鈣含量，并將其表示為yg鈣/mg組織（干重）。這些數(shù)據(jù)總結于表1中。結果（μg鈣/mg干燥組織）總結于表1。[0118]表1[0119]存儲溶液平均值±標準誤差漢...酸(0.625%)70.146.ugCa/mgf!!iM±7.037戊二醛（5.0%)88.439pgCa/mg組織土4.470漢.略(10.0%)66.870.ugCa/mg到L織±13.235氧化丙烯（2.0%)25.311pgCa/mg組織±5.292[0120]實施例3消毒和存儲溶液對牛物材料鈣化屬件的影響[0121]膠原衍生的生物材料的收獲[0122]在第二動物研究中，根據(jù)實施例1描述的方法收獲和分離豬主動脈瓣小葉。分離的豬主動脈瓣小葉被分成三組。組I接受常規(guī)交聯(lián)處理（對照）；組II接受專利交聯(lián)方法(見，W02006/066327,通過引用并入本文）；和組III接受與組II相同的交聯(lián)處理，但這之后是用包括約4%v/v的氧化丙烯的消毒溶液溫育交聯(lián)的生物材料和在30°C和55°C之間溫育生物材料大于48小時。[0123]主動脈瓣小葉的交聯(lián)（固定）[0124]在組I中，豬主動脈瓣小葉于在無菌去離子水中制備的含9.07g/l磷酸二氫鉀緩沖劑的0.625%的戊二醛溶液中進行交聯(lián)。用氫氧化鈉將戊二醛溶液的pH調至7.4。主動脈瓣小葉在戊二醛溶液中，在1_5°C下交聯(lián)5天的最小時期，以交聯(lián)存在于組織膠原中的蛋白質。[0125]在組II和III中，制備按體積計60-80%v/v醇乙醇的水溶性含醇溶液。在4°C存儲過夜后，將豬主動脈瓣小葉浸入到醇溶液中。具有瓣膜的主動脈根在冰冷〇.9%v/v鹽水（含0.5mMPMSF)中最后洗滌后即被浸入到相同的醇溶液中。在大約5°C，將豬主動脈瓣小葉保持在醇溶液最少24小時。[0126]將豬主動脈瓣小葉從醇溶液中移除，并用0.9%v/v鹽水漂洗約10分鐘。在漂洗期間，漂洗溶液溫度維持在大約10°c。[0127]主動脈瓣小葉被浸入含9.07g/l磷酸二氫鉀緩沖劑的戊二醛在無菌去離子水中的0.625%v/v溶液中。用氫氧化鈉將戊二醛溶液的pH調至7.4。心包膜和具有瓣膜的主動脈根在1_5°C，在戊二醛溶液中被固定24小時的最小時期，以交聯(lián)存在于組織膠原中的蛋白質。[0128]將豬瓣膜小葉從戊二醛溶液中移除，并在無菌0.9%v/v氯化鈉中漂洗約15分鐘。在漂洗期間，漂洗溶液溫度維持在大約10°c。[0129]然后，將豬主動脈瓣小葉浸入不含緩沖劑的、含8mg二羧酸/1ml去離子水體積的溶液中。用一定體積的稀釋鹽酸將溶液pH調至pH4.5。心包膜和具有瓣膜的主動脈根在約45°C溫度下被浸入溶液約48小時。[0130]生物材料的最終消毒和存儲[0131]然后，豬主動脈瓣小葉通過以下方式任意之一消毒和存儲：[0132](i)將組織浸入含9.07g/l磷酸二氫鉀緩沖劑的戊二醛在無菌去離子水中的0.25%￥八溶液中。用氫氧化鈉將醛溶液？!1調至7.4。消毒過程在約451：溫度下進行約120分鐘（處理A);或[0133](ii)在37°C下，在包括按重量計4%v/v的氧化丙烯組合20%v/v乙基醇的含水溶液中將豬主動脈瓣小葉消毒約24小時，并存儲在4%v/v的氧化丙烯溶液中，處理B-本發(fā)明）。[0134]所有三組的消毒的和存儲的豬主動脈瓣小葉均在0.9%v/v鹽水中被漂洗5分鐘。漂洗的組織經(jīng)手術植入皮下袋中（每組一個樣品/大鼠），在成長的出周齡）雄性Wistar大鼠的中央腹壁區(qū)產(chǎn)生。這些組織在60天后去除，宿主組織被去除，并將樣品在Biotherm?培養(yǎng)箱（SelbyScientific，Perth，WA)中，在90°C下干燥48h。干燥樣品被稱重，并在5.0ml6N超純鹽酸（Merck,Sydney,Australia)中，在75°C下提取I丐含量24h。然后利用原子吸收分光光度計（VarianAA1275)測量可提取的鈣含量，并將其表示為yg鈣/mg組織（干重）。結果（μg鈣/mg干燥組織）總結于表2。[0135]表2[0136]存儲溶液平均值±標準誤差戊:醛（0.625%)174.525pgCa/mg組織±6.884處理A0.25%戊二醛3.300pgCa/mg組織±0.289處理B4%氧化丙烯1.325pgCa/mg組織±0.317[0137]實施例4處理B對牛心包膜鈣化屬件的影響[0138]在第三動物研究中，將根據(jù)實施例3的組織制備的、交聯(lián)的和存儲的牛心包膜(0.625%緩沖戊二醛、處理A+0.2%戊二醛和處理Μ%v/v的氧化丙烯）的鈣化潛力與存儲在0.2%的戊二醛溶液中的商業(yè)牛心包膜（Hancock心包膜）的鈣化潛力進行比較。[0139]各組的代表性樣品均被修剪成lxlcm尺寸并在0.9%v/v鹽水中漂洗5分鐘。這些樣品經(jīng)手術植入皮下袋中，在成長的出周齡）雄性Wistar大鼠的中央背壁區(qū)產(chǎn)生。這些組織在60天后去除，宿主組織被去除，并利用原子吸收分光光度計測定鈣含量。結果（μg鈣/mg干燥組織）總結于表3。[0140]表3[0141]存儲溶液平均值±標準誤差戍..]?(0.625%)136.025pgCa/mgm\\±11.385ADAPT+0.25%jjc.4.100pgCa/mg紐織土0.204ADAPT+4%v,~1--化1人1.100pgCa/mgf|I.織±0.147Hancock心包膜（在0.2%戊二醛中）6.375pgCa/mg組織士1.993[0142]實施例5在大動物樽型中處理B對豬主動脈瓣組織（瓣膜小葉&主動脈壁）鈣化屬件的影響[0143]在第四動物研究中，在0.625%緩沖戊二醛中制備和交聯(lián)并存儲于（i)0.625%戊二醛、（ii)用處理Α(0·625%戊二醛）處理和（iii)用處理B(4%氧化丙烯）處理的豬主動脈瓣組織（瓣膜小葉和主動脈壁）的鈣化潛力。[0144]各組的代表性樣品均被修剪成大約1.2xlcm的卵圓形尺寸并在0.9%鹽水中漂洗5分鐘。這些樣品經(jīng)手術植入幼年羊（體重22-25kg)的頸靜脈中。這些組織在150天后被去除，宿主組織被去除，并利用原子吸收分光光度計測定鈣含量。結果（μg鈣/mg干燥組織）總結于表4-A(瓣膜小葉）和表4-B(主動脈壁）。[0145]表4-A(瓣膜小葉））[0146]存儲溶液平均值±標準誤差0.625%戊：醉211.10(HigCa/mg饑織±3.1342%氧化丙烯93.167pgCa/mg組織±23.764處理B(4%氧化丙烯）12.775pgCa/mg組織±12.442[0147]表4_B(主動脈壁）[0148]存儲溶液平均值±標準誤差0.625%戊...醛59.444Ca/mg饑織±12.2632%氧化丙烯28.633pgCa/mg組織±8.370處理B(4%氧化丙烯）18.287Ca/mg組織±7.305[0149]實施例6騎證：接種以枯草芽孢桿菌孢子的商業(yè)心瓣膜的消毒[0150]進行該驗證，以測試在48小時后，在45°C下，用4%氧化丙烯消毒商業(yè)心瓣膜組織的可行性。該可行性研究的目的是調查3.8%氧化丙烯（作為"最壞情況"濃度水平）是否能夠在由FDA條例規(guī)定的"最壞情況"條件（被枯草芽孢桿菌孢子污染）下消毒商業(yè)心瓣膜X組織。測試條件為：[0151]?將瓣膜從0.5%戊二醛中移除，并在總計lOOOmls的無菌蒸餾水中漂洗總計6mins〇[0152]?然后，無菌分離瓣膜支持物和瓣膜，然后干燥大約30mins或直到明顯干燥。[0153]?然后，各裝置的瓣膜支持物和瓣膜被接種以總計20μ1的枯草芽孢桿菌孢子懸浮物，其獲自STERISCorporation，USA。懸浮物含1·25χ106孢子。[0154]?然后，使瓣膜在室溫下干燥大約1小時。[0155]?然后，根據(jù)收到物再次組裝裝置，并將其放入無菌罐中。[0156]?向10個裝置中加入160ml新鮮制備的3.8%氧化丙烯。[0157]?向最終裝置中加入160ml大豆酪蛋白消化物培養(yǎng)基（Soybean-CaseinDigestmedium)(SCDM)。這是評估孢子懸浮物的陽性對照。陽性對照在32°C溫育48小時。[0158]?然后，將10個測試瓣膜在42°C溫育44小時。[0159]?在溫育后，對每一瓣膜進行無菌測試。[0160]?分離瓣膜，并將每一部分轉移至空的無菌罐中，向該罐中加入SCDM。[0161]?然后，在32°C溫育罐14天。[0162]?每日檢查罐的渾濁征兆。[0163]測試細節(jié)：[0164]實驗室號：7343042W[0165]方法：方法根據(jù)無菌測試，附錄XVI，英國藥典，2010(TestforSterility,AppendixXVI，BritishPharmacopoeia,2010)和制藥測試設備程序(PharmaceuticalTestingFacilityprocedure)MB:PT:0110〇[0166]表5[0167]測試結果SCDM:在32°C溫育14天后沒有檢測到生長.停滯測試：在測試期期滿時進行。SCDM顯示48小時內可視的白色念珠菌（C*.a/6/c<ms)生長。陽性對照24小時后檢測到生長。生長物被鑒定為枯草芽孢桿菌。[0168]實施例7在小動物樽型中處理B對商業(yè)心瓣臘纟目織（牛心何纟目織）鈣化屬件的影座[0169]表6顯示第五動物研究的結果，其中將在0.625%v/v戊二醛中交聯(lián)和消毒的牛心包膜（其用作參考對照-標記A)的鈣化潛力與商業(yè)心瓣膜組織（根據(jù)商業(yè)專利方案交聯(lián)和存儲的牛心包膜，所述商業(yè)專利方案是0.625%v/v緩沖戊二醛交聯(lián)+甲醛存儲-標記B)和在4%v/v的氧化丙烯中，在45°C消毒48小時，并存儲在4%v/v的氧化丙烯溶液中的同樣的商業(yè)心瓣膜組織-標記C進行比較。[0170]各組的代表性樣品均被修剪成lxlcm尺寸和并在0.9%v/v鹽水中漂洗5分鐘。這些樣品經(jīng)手術植入皮下袋中，在成長的出周齡）雄性Wistar大鼠的中央背壁區(qū)產(chǎn)生。這些組織在8、16和24周后去除，宿主組織被去除，并利用原子吸收分光光度計測定鈣含量。結果（μg鈣/mg干燥組織）總結于表6。[0171]表6[0172]存儲溶液ABC(本發(fā)明)8周85MgCa/mg組織±1212pgCa/mg組織±110.751pgCa/mg組織±0.2[0173]16周94pgCa/mg組織±1210μβCa/mg組織±80.74pgCa/mg組織±0.224周134.ugCa/mg組織士128pgCa/mg組織±63.56pgCa/mg組織土3[0174]實施例8在怏諫體外鈣化樽型中處理B對商業(yè)心瓣膜組織（牛心包）組織鈣化屬件的影響[0175]在進一步的試驗評估中，在快速體外鈣化模型中將商業(yè)瓣膜組織（對照組織）的鈣化潛力與在4%氧化丙烯中，在45°C消毒48小時和存儲在4%氧化丙烯溶液中的商業(yè)心瓣膜組織（處理的組織）進行比較。[0176]支架的商業(yè)心瓣膜（對照和處理的）被安裝在瓣膜疲勞試驗儀（RowanAshFatiguetester)中，并在上至五千萬個循環(huán)的加速流動（400個測試循環(huán)/分鐘）期間被暴露于生理溶液（具有高的鈣/磷酸鹽含量）。[0177]在五千萬個測試循環(huán)之后，心瓣膜被移除，并采取代表性組織樣品用于組織學。各瓣膜中三個瓣膜小葉各自的剩余組織被移除，并利用原子吸收分光光度計測定鈣含量。結果（μg鈣/mg干燥組織）總結于表7。[0178]轟1[0179]瓣膜組織平均值土標準誤差[0180]商業(yè)瓣膜49.71μgCa/mg組織±2.112[0181]商業(yè)瓣膜+4%氧化丙烯32.34μgCa/mg組織±1.336[0182]實施例9消毒和存儲方法對接種以枯草芽孢桿菌孢子的纟目織的作用[0183]圖1和2顯示2%v/v和4%v/v的氧化丙烯（各自）在15°C和45°C之間的不同溫度下隨著時間對枯草芽孢桿菌孢子的作用。利用的試驗條件描述在實施例6。主要地，可以看到兩種消毒溶液（2%或4%)在48小時之前均沒有一點消毒作用。由圖2還可見，在48小時之內，提高溫度的作用對消毒具有深遠影響。例如，在40°C及以上的溫度下，在24小時之后存在消毒，并且，甚至在25°C及以上的溫度下，到48小時時存在消毒。圖1顯示，為了通過2%v/v的氧化丙烯獲得消毒，組織需要在高于35°C的溫度下被溫育至少6天。在15至20°C下甚至溫育10天2%v/v的氧化丙烯對消毒也沒有實質性作用。[0184]因此，由圖1和2可見，通過用4%v/v的氧化丙烯溶液溫育組織和在大約45°C下溫育組織大于48小時獲得最佳消毒?！緳嗬蟆?.消毒交聯(lián)的膠原基生物材料的方法，包括使所述交聯(lián)的膠原基生物材料接觸包括3%和6%v/v之間的氧化丙烯的消毒溶液和在30°C和55°C之間溫育所述生物材料大于48小時；條件是所述消毒溶液不包含醇。2.權利要求1所述方法，其中所述溫育溫度在35°C和50°C之間。3.權利要求1所述方法，其中所述溫育溫度是大約45°C。4.權利要求1所述方法，其中48小時后所述溫育溫度降至室溫。5.權利要求1所述方法，其中所述消毒溶液包含3.8%和4.5%v/v之間的氧化丙烯。6.權利要求1所述方法，其中所述消毒溶液包含大約4%v/v的氧化丙烯。7.權利要求1所述方法，其中所述消毒步驟進行2至10天或更長。8.權利要求1所述方法，其中所述膠原基生物材料分離自動物，所述動物選自綿羊、牛、山羊、馬、豬、有袋類動物和人。9.權利要求1所述方法，其中所述生物材料是細胞組織，所述細胞組織選自心血管組織、心組織、心瓣膜、主動脈根、主動脈壁、主動脈小葉、心包組織、結締組織、硬膜、皮組織、血管組織、軟骨、心包膜、韌帶、腱、血管、臍組織、骨組織、筋膜、和粘膜下層組織和皮膚。10.權利要求9所述方法，其中所述生物材料進一步包含由合成聚合物、生物聚合物或兩者形成的合成類似物。11.用于消毒膠原基生物材料的方法，包括：(a)提供膠原基生物材料和接觸0.625%v/v的戊二醛溶液和磷酸二氫鉀，pH7.4;(b)在大約1-5°C溫育所述生物材料至少5天，以產(chǎn)生交聯(lián)的膠原基生物材料；(c)使所述交聯(lián)的膠原基生物材料與包括3%和6%v/v之間的氧化丙烯的消毒溶液接觸和在30°C和55°C之間溫育所述生物材料大于48小時；條件是所述消毒溶液不包含醇。12.消毒和存儲交聯(lián)的膠原基生物材料的方法，包括使所述交聯(lián)的膠原基生物材料接觸包括3%和6%v/v之間的氧化丙烯的溶液和在30°C和55°C之間溫育所述生物材料大于48小時，然后使所述生物材料保持接觸所述氧化丙烯，直到其轉化成丙二醇；條件是所述溶液不包含醇。13.消毒的、交聯(lián)的膠原基生物材料，由權利要求1所述方法產(chǎn)生。14.容器，包括消毒的、交聯(lián)的膠原基生物材料和3%至6%v/v的丙二醇溶液，其中所述丙二醇產(chǎn)生自3%至6%v/v的氧化丙烯溶液在所述生物材料存在時的原位轉化?！疚臋n編號】A61L2/20GK104114195SQ201280066574【公開日】2014年10月22日申請日期:2012年11月9日優(yōu)先權日:2011年11月10日【發(fā)明者】W·M·L·尼特林格申請人:愛得姆杜斯瑞珍私人有限公司