用于從蛋白質溶液中除去病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于從包括一種靶蛋白的溶液中選擇性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，從而將丙酮用作沉淀病毒和/或病毒DNA以及該靶蛋白的沉淀劑。
【專利說明】用于從蛋白質溶液中除去病毒的方法
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及一種用于純化蛋白質的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]分離自動物來源的蛋白質當例如在食品或藥物產品中使用這些蛋白質時易于被不需要的病毒顆粒和/或病毒DNA污染。已知用于純化此類蛋白質還將降低病毒顆粒和/或病毒DNA的水平的方法，例如層析、過濾、離心、提取或沉淀。然而，在一些情況下，純化一種感興趣的蛋白質是困難的、耗時的和/或昂貴的。所以，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于從感興趣的蛋白質中除去任何受污染的病毒顆粒和/或病毒DNA的方法。此類方法在工業(yè)規(guī)模中應該是快速的、有用的、廉價且有效的。
[0004]胰蛋白酶(EC3.4.21.4)是一種發(fā)現于許多脊椎動物的消化系統(tǒng)內并在其中水解蛋白質的絲氨酸蛋白酶。胰蛋白酶在哺乳動物的胰臟中以高數量可獲得，并且例如豬胰蛋白酶和牛胰蛋白酶可以相當容易地純化。因此，胰蛋白酶已經被廣泛地應用于各種生物技術工藝中。另外，將胰蛋白酶用于嬰兒食品中以預消化蛋白質。
[0005]2型豬環(huán)狀病毒(PCV2)是一種在真核細胞中自主復制的小的無包膜病毒。它是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的病原，該綜合征是一種在豬中新出現的且多因素的疾病。
[0006]本發(fā)明的一個目的是提供一種用于從提取自豬胰腺的胰蛋白酶中除去PCV2病毒顆粒和/或病毒DNA的方法。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明提供了一種用于從包括靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，所述方法包括:
[0009]a)將丙酮以選擇性地沉淀該病毒和/或病毒DNA的濃度添加至該溶液中，
[0010]b)進行一個分離步驟，以將沉淀的材料與包括該靶蛋白的溶液分開，
[0011]c)向該溶液中添加另外量的丙酮，以達到沉淀該靶蛋白的終濃度，并且
[0012]d)從該溶液中收集沉淀的靶蛋白。
[0013]發(fā)明詳細說明
[0014]本發(fā)明提供了一種用于從包括靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，所述方法包括:
[0015]a)將丙酮以選擇性地沉淀該病毒和/或病毒DNA的濃度添加至該溶液中，
[0016]b)進行一個分離步驟，以將沉淀的材料與包括該靶蛋白的溶液分開，
[0017]c)向該溶液中添加另外量的丙酮，以達到沉淀該靶蛋白的終濃度，并且
[0018]d)從該溶液中收集沉淀的靶蛋白。
[0019]為避免任何可能的疑問:以書面順序進行這些步驟。即，在步驟b)中進行分離，以將步驟a)的沉淀材料與包括該靶蛋白的溶液分開。在步驟c)中，向在步驟b)中獲得的溶液中添加另外量的丙酮。并且在步驟d)中，從該溶液中收集步驟c)的沉淀的靶蛋白。
[0020]該靶蛋白可以是任何蛋白質。它可以是一種分離自微生物，例如分離自細菌細胞或真菌細胞的蛋白質。它可以是一種分離自植物的蛋白質。優(yōu)選地，它是一種分離自動物來源的蛋白質。此類蛋白質可能易于被例如源自表達了該蛋白質的來源生物的病毒顆粒和/或病毒DNA污染。
[0021]可以從一種哺乳動物來源獲得該靶蛋白。它可以獲得自哺乳動物組織，例如獲得自哺乳動物腺體。在一個優(yōu)選實施例中，該靶蛋白獲得自?；蜇i胰臟。在一個更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白獲得自豬胰臟。
[0022]該靶蛋白可以是一種酶，優(yōu)選是一種活性酶或可以被再活化的酶。
[0023]可以獲得自哺乳動物胰臟(例如獲得自豬胰臟)的酶類包括但不限于:蛋白酶，包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜蛋白酶B、胰肽酶E、羧肽酶A以及羧肽酶B;脂肪酶，包括但不限于甘油酯水解酶(脂肪酶)、磷脂酶Al、磷脂酶A2以及留醇酯水解酶；核酸酶，包括但不限于核糖核酸酶以及脫氧核糖核酸酶；淀粉酶，包括但不限于α-淀粉酶。
[0024]在一個優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是一種蛋白酶，優(yōu)選是一種獲得自哺乳動物來源的蛋白酶，例如獲得自胰臟，優(yōu)選獲得自?；蜇i胰臟，更優(yōu)選獲得自豬胰臟。
[0025]在一個更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是胰蛋白酶，優(yōu)選獲得自胰臟的胰蛋白酶，更優(yōu)選獲得自?；蜇i胰臟的胰蛋白酶，甚至更優(yōu)選獲得自豬胰臟的胰蛋白酶。
[0026]包括該靶蛋白的水溶液優(yōu)選地具有一個低的導電性，例如低于3mS或低于ImS。這可以例如通過滲濾獲得，例如使用具有10，OOODa的截留的膜。包括該靶蛋白的水溶液優(yōu)選具有約2-5，例如約3-4，優(yōu)選約3.1-3.9，如約3.5的pH。
[0027]該水溶液的 干物質濃度可以是約8% -20%，例如約8% -15%，如約10%。
[0028]在本發(fā)明的方法中，從包括靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒和/或病毒DNA。該病毒可以是病毒顆粒。即，在一個優(yōu)選實施例中，該方法用于從包括靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒顆粒和/或病毒DNA。在一個更優(yōu)選實施例中，該方法用于從包括靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒DNA。
[0029]該病毒可以是一種傳染性病毒，例如一種發(fā)現于豬來源的傳染性病毒。
[0030]該病毒可以是一種DNA病毒,例如單鏈DNA病毒,如一種具有單鏈DNA和環(huán)狀DNA的病毒。該病毒可以是一種RNA病毒。
[0031]該病毒可以是一種無包膜病毒，例如一種小的無包膜病毒。它可以是一種無包膜DNA病毒或無包膜RNA病毒。
[0032]該病毒可以是一種在真核細胞中自主復制的病毒。
[0033]在一個優(yōu)選實施例中，該病毒是一種無包膜DNA病毒,例如一種小的無包膜DNA病毒。
[0034]該病毒可以選自下組，該組由以下各項組成:PCV2(豬環(huán)狀病毒2)、PCV1(豬環(huán)狀病毒I)、PPV (豬細小病毒)、EMCV (豬腦心肌炎病毒)、HEV (豬戊型肝炎病毒)以及SVDV (豬水皰病病毒)。在一個優(yōu)選實施例中，該病毒是PCV2。
[0035]在本發(fā)明的方法的步驟a)中，將丙酮以選擇性地沉淀該病毒和/或病毒DNA的濃度添加至包括該靶蛋白的溶液中。它可以是包括沉淀的病毒DNA或與其相關的病毒顆粒。和/或它可以本身是病毒DNA，例如沉淀的游離病毒DNA。
[0036]選擇性沉淀意指大部分的病毒和/或病毒DNA(即多于50% )被沉淀，同時少于50%的靶蛋白被沉淀。[0037]優(yōu)選地，在步驟a)中，至少60%，例如至少70%、至少80%或至少90%的病毒DNA被沉淀。更優(yōu)選地,在步驟a)中，至少95%，例如至少99%或至少99.9%的病毒DNA被沉淀。
[0038]優(yōu)選地，在步驟a)中，少于40%，例如少于30%的靶蛋白被沉淀。更優(yōu)選地，在步驟a)中，少于25 %，例如少于20 %、少于10 %或少于5 %的靶蛋白被沉淀。
[0039]本領域技術人員將知道如何確定有待在步驟a)中使用的丙酮的濃度。在一個優(yōu)選實施例中，在步驟a)中的丙酮的濃度是約12%-40% (v/v)，優(yōu)選是約12%-30% (v/V)，更優(yōu)選是約14%-30% (v/v)，甚至更優(yōu)選是約15%-20% (v/v)。在一個更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是胰蛋白酶并且在步驟a)中的丙酮的濃度是約12%-40% (v/v)，優(yōu)選是約12% -30% (v/v),更優(yōu)選是約 14%-30% (v/v),甚至更優(yōu)選是約 15%-20% (v/v)。在一個甚至更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是胰蛋白酶，該病毒是PCV2并且在步驟a)中的丙酮的濃度是約12% -40% (v/v),優(yōu)選是約12% -30% (v/v),更優(yōu)選是約14% -30% (v/v),甚至更優(yōu)選是約15% -20% (v/v)。
[0040]優(yōu)選地，在低于15°C的溫度下進行步驟a)中的選擇性沉淀。
[0041]在本發(fā)明的方法中的步驟b)是一個分離步驟，其中將已經在步驟a)中沉淀的材料與包括該靶蛋白的溶液分離。可以通過本領域已知的任何方法進行這樣的分離。分離可以包括過濾和/或離心。在一個優(yōu)選實施例中，在步驟b)中的分離包括深層過濾。
[0042]優(yōu)選地，在步驟b)中，至少50%，例如至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的病毒DNA被分離。更優(yōu)選地，在步驟b)中，至少95%，例如至少99%或至少99.9%的病毒DNA被分離。
[0043]在一個優(yōu)選實施例中，在步驟b)中分離出沉淀的材料以后，在包括該靶蛋白的溶液中檢測不到病毒DNA。
[0044]優(yōu)選地，在步驟b)中，少于40%，例如少于30%的靶蛋白被分離。更優(yōu)選地，在步驟b)中，少于25%，例如少于20%、少于10%或少于5%的靶蛋白被分離。
[0045]優(yōu)選地，在步驟b)中的分離以后，在該溶液中回收多于60%，例如多于70%的靶蛋白。更優(yōu)選地，在步驟b)中的分離以后，在該溶液中回收多于75%，例如多于80%、多于90%或多于95%的靶蛋白。
[0046]優(yōu)選地，在步驟b)中的分離以后，在該溶液中回收多于60%，例如多于70%的處于其活性形式的靶蛋白。更優(yōu)選地，在步驟b)中的分離以后，在該溶液中回收多于75%，例如多于80%、多于90%或多于95%的處于其活性形式的靶蛋白。
[0047]在步驟b)后,可以將該濾液的pH調至例如約pH4_5,如約pH4.5?？梢允褂萌魏螇A，優(yōu)選是一種弱堿，例如氨水。
[0048]在本發(fā)明的方法的步驟c)中，向包括該靶蛋白的溶液中添加另外量的丙酮。添加丙酮，以達到沉淀該靶蛋白的終濃度。
[0049]優(yōu)選地，在步驟c)中，存在于步驟b)后的溶液中的多于60%，例如多于70%或多于80%的靶蛋白被沉淀。更優(yōu)選地，在步驟c)中，存在于步驟b)后的溶液中的多于90%，例如多于95 %、多于98 %或多于99 %的靶蛋白被沉淀。
[0050]本領域技術人員將知道如何確定有待在步驟c)中使用的丙酮的濃度。在一個優(yōu)選實施例中，在步驟c)中的丙酮的終濃度是45%-95%，優(yōu)選是60%-70% (v/v)，更優(yōu)選是約66% (v/v)。在另一個優(yōu)選實施例中，在步驟a)中的丙酮的濃度是約12%-40% (v/V)，優(yōu)選是約12 % -30 % (v/V),更優(yōu)選是約14-30 % (v/v),甚至更優(yōu)選是約15 % -20 % (v/V)，并且在步驟c)中的丙酮的終濃度是45%-95%，優(yōu)選是60%-70% (v/v)，更優(yōu)選是約66% (v/v)。在一個更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是胰蛋白酶，在步驟a)中的丙酮的濃度是約12% -40% (v/v),優(yōu)選是約12% -30% (v/v),更優(yōu)選是約14% -30% (v/v),甚至更優(yōu)選是約15%-20% (v/v)，并且在步驟c)中的丙酮的終濃度是45%-95%，優(yōu)選是60%-70%(v/v)，更優(yōu)選是約66% (v/v)。在一個甚至更優(yōu)選實施例中，該靶蛋白是胰蛋白酶，該病毒是PCV2，在步驟a)中的丙酮的濃度是約12%-40% (v/v)，優(yōu)選是約12%-30% (v/v)，更優(yōu)選是約14%-30% (v/v)，甚至更優(yōu)選是約15%-20% (v/v)，并且在步驟c)中的丙酮的終濃度是45% -95%,優(yōu)選是60% -70% (v/v)，更優(yōu)選是約66% (v/v)。
[0051]優(yōu)選地，在低于15°C的溫度下進行步驟c)。
[0052]在本發(fā)明的方法的步驟d)中，從該溶液中收集沉淀的靶蛋白。可以通過本領域已知的任何方法進行沉淀的靶蛋白的這樣的收集。沉淀的靶蛋白的收集可以包括過濾和/或離心。
[0053]在收集以后，可以將該靶蛋白洗滌、干燥、研磨和/或標準化。
[0054]在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明涉及一種用于從豬胰蛋白酶的制劑(優(yōu)選是豬胰腺胰蛋白酶)中選擇性地除去PCV2病毒和/或PCV2病毒DNA的方法，所述方法包括: [0055]a)向包括該胰蛋白酶的水溶液中添加丙酮，以達到12% -30% (v/v)的丙酮濃度，
[0056]b)進行一個分離步驟，以將沉淀的材料與包括胰蛋白酶的溶液分開，
[0057]c)向該溶液中添加另外量的丙酮，以達到45% -95% (v/v)，優(yōu)選是60% -70%(v/v)的終濃度，并且
[0058]d)從該溶液中收集沉淀的胰蛋白酶。
[0059]優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法將至少50 %，例如至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %的病毒DNA與該靶蛋白分開。更優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法將至少95%，例如至少99%或至少99.9%的病毒DNA與該祀蛋白分開。
[0060]優(yōu)選地，與以相同方式純化但是未使用本方法的步驟a)和b)的靶蛋白相比，通過本發(fā)明的方法純化的靶蛋白包括少于50%病毒DNA。更優(yōu)選地，與以相同方式純化但是未使用本方法的步驟a)和b)的靶蛋白相比，通過本發(fā)明的方法純化的靶蛋白包括少于40%，例如少于30%、少于20%或少于10%病毒DNA。甚至更優(yōu)選地，與以相同方式純化但是未使用本方法的步驟a)和b)的靶蛋白相比，通過本發(fā)明的方法純化的靶蛋白包括少于5%，例如少于I %、少于0.5%或少于0.1 %病毒DNA。
[0061]在一個優(yōu)選實施例中，在步驟d)中收集的沉淀的靶蛋白不包括可檢測的病毒DNA。
[0062]可以通過本領域已知的任何方法檢測或量化病毒DNA。可以使用實時PCR。
[0063]可以使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中的DNA提取來提取DNA?？梢允褂每缮藤彽腄NA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后可以使用實時PCR檢測病毒DNA的存在。
[0064]在一個優(yōu)選實施例中，該病毒是PCV2并且使用可商購的PCV2檢測試劑盒進行實時 PCR。
[0065]通過實時PCR量化DNA的一般原理依賴于在對數尺度上相對于循環(huán)數目繪制的熒光。將用于檢測基于DNA的熒光的閾值設置地稍微高于背景并且將循環(huán)閾值(Ct)定義為熒光信號超過該閾值(即超過背景水平)所需的循環(huán)數目。在指數式擴增階段過程中，DNA靶標的序列每個循環(huán)都加倍。例如,其Ct領先于另一個樣品的Ct3個循環(huán)的DNA樣品包含23 = 8倍多的模板。
[0066]在一個實施例中，當在經歷40個擴增循環(huán)并且使用特異性針對該相關病毒DNA的引物的實時PCR測定中進行分析時，可以在提取自步驟d)中收集的沉淀的靶蛋白的總DNA中檢測到的病毒DNA的量導致至少38，優(yōu)選是至少39，更優(yōu)選是40的Ct值。
[0067]Ct值為40意指在40個擴增循環(huán)后，未超過用于檢測基于DNA的熒光的閾值，即從未檢測到信號。此外，稍微低于40的Ct值非?？赡苁羌訇栃缘牟⑶乙虼瞬坏扔诓《綝NA的檢測。
[0068]在一個優(yōu)選實施例中，該病毒是PCV2，并且當在經歷40個擴增循環(huán)并且使用特異性針對PCV2 DNA的引物的實時PCR測定中進行分析時，可以在提取自步驟d)中收集的沉淀的靶蛋白的總DNA中檢測到的PCV2 DNA的量導致至少38，優(yōu)選是至少39，更優(yōu)選是40的Ct值。
[0069]實例
[0070]實例I
[0071]來源:通過水性提取豬胰腺得到PCV2陽性胰蛋白酶批次。
[0072] 將該胰蛋白酶批次溶解于冷的自來水中，至11%溶液。通過添加鹽酸將溶液的pH調節(jié)至3.5。添加丙酮至20% v/v的終濃度，隨后添加1%助濾劑(Kieselguhr HyfloSuper Cel? )。在添加丙酮和助濾劑下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。隨后，在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)和細菌濾板(SeitzEKS)的壓濾機上過濾該不澄清溶液。在過濾過程中，將壓力保持在1.8巴以下。棄掉被保留在過濾器上的雜質。將澄清的濾液收集于罐中并且用氨水將PH調節(jié)至4.5。添加丙酮至66% v/v的終濃度。在添加丙酮下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。出現沉淀物(胰蛋白酶)。通過在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)的壓濾機上過濾來收集該沉淀物。在過濾過程中，將壓力保持在3.5巴以下。最后，在一個真空干燥機中干燥該沉淀物。最終壓力為0.5毫巴并且最終溫度為38°C。
[0073]使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中進行DNA提取來提取DNA。使用可商購的DNA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后在使用可商購的PCV2檢測試劑盒的實時PCR儀器中分析PCV2 DNA的存在。發(fā)現干燥的胰蛋白酶對于PCV2而言呈陰性。
[0074]實例2
[0075]來源:通過水性提取豬胰腺得到PCV2陽性液體胰蛋白酶批次。添加助濾劑(Kieselguhr Hyflo Super Cel? )并且在具有Seitz HS9000濾板的壓濾機上進行過濾。滲濾該濾液(使用具有10，OOODa的截留的膜)，直到導電性低于lmS。將濃度調節(jié)至10%干物質并且用鹽酸將PH調節(jié)至3.5。將該批次分為2個相等的部分。
[0076]a)添加丙酮至15 % v/v的終濃度，隨后添加I %助濾劑(KieselguhrHyfloSuper Cel? )。在添加丙酮和助濾劑下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。隨后，在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)和細菌濾板(SeitzEKS)的壓濾機上過濾該不澄清溶液。在過濾過程中，將壓力保持在1.8巴以下。棄掉被保留在過濾器上的雜質。將澄清的濾液收集于罐中并且用氨水將pH調節(jié)至4.5。添加丙酮至66% v/v的終濃度。在添加丙酮下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。出現沉淀物(胰蛋白酶)。通過在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)的壓濾機上過濾來收集該沉淀物。在過濾過程中，將壓力保持在3.5巴以下。最后，在一個真空干燥機中干燥該沉淀物。最終壓力為0.5毫巴并且最終溫度為38°C。
[0077]使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中進行DNA提取來提取DNA。使用可商購的DNA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后在使用可商購的PCV2檢測試劑盒的實時PCR儀器中分析PCV2 DNA的存在。發(fā)現干燥的胰蛋白酶對于PCV2而言呈陰性(Ct:40)。
[0078]b)向該溶液中添加I %助濾劑(KieselguhrHyfloSuper Cel.?)。在添加助濾劑
下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。隨后，在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)和細菌濾板(Seitz EKS)的壓濾機上過濾該不澄清溶液。在過濾過程中，將壓力保持在1.8巴以下。棄掉被保留在過濾器上的雜質。將澄清的濾液收集于罐中并且用氨水將PH調節(jié)至
4.5。添加丙酮至66% v/v的終濃度。在添加丙酮下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。出現沉淀物(胰蛋白酶)。通過在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)的壓濾機上過濾來收集該沉淀物。在過濾過程中，將壓力保持在3.5巴以下。最后，在一個真空干燥機中干燥該沉淀物。最終壓力為0.5毫巴并且最終溫度為38°C。
[0079]使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中進行DNA提取來提取DNA。使用可商購的DNA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后在使用可商購的PCV2檢測試劑盒的實時PCR儀器中分析PCV2 DNA的存在。發(fā)現干燥的胰蛋白酶對于PCV2而言呈陽性(Ct:36)。
[0080]實例3
[0081]來源:通過水性提取豬胰腺得到PCV2陽性液體胰蛋白酶批次。添加助濾劑(Kieselguhr Hyflo Super CeiK )并且在具有Seitz HS9000濾板的壓濾機上進行過濾。滲濾該濾液(使用具有10，OOODa的截留的膜)，直到導電性低于lmS。將濃度調節(jié)至10%干物質并且用鹽酸將PH調節(jié)至3.5。將該批次分為2個相等的部分。
[0082]a)添加丙酮至10 % v/v的終濃度，隨后添加I %助濾劑(KieselguhrHyfloSuper Cel? ) ?在添加丙酮和助濾劑下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。隨后，在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)和細菌濾板(SeitzEKS)的壓濾機上過濾該不澄清溶液。在過濾過程中，將壓力保持在1.8巴以下。棄掉被保留在過濾器上的雜質。將澄清的濾液收集于罐中并且用氨水將PH調節(jié)至4.5。添加丙酮至66% v/v的終濃度。在添加丙酮下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。出現沉淀物(胰蛋白酶)。通過在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)的壓濾機上過濾來收集該沉淀物。在過濾過程中，將壓力保持在3.5巴以下。最后，在一個真空干燥機中干燥該沉淀物。最終壓力為0.5毫巴并且最終溫度為38°C。
[0083]使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中進行DNA提取來提取DNA。使用可商購的DNA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后在使用可商購的PCV2檢測試劑盒的實時PCR儀器中分析PCV2 DNA的存在。發(fā)現干燥的胰蛋白酶對于PCV2而言呈陽性(Ct:35)。
[0084]b)向該溶液中添加1%助濾劑(KieselguhrHyflo Super Cel? )。在添加助濾劑
下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。隨后，在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)和細菌濾板(Seitz EKS)的壓濾機上過濾該不澄清溶液。在過濾過程中，將壓力保持在1.8巴以下。棄掉被保留在過濾器上的雜質。將澄清的濾液收集于罐中并且用氨水將PH調節(jié)至4.5。添加丙酮至66% v/v的終濃度。在添加丙酮下，攪拌該溶液并且將溫度保持在15°C以下。出現沉淀物(胰蛋白酶)。通過在具有耐丙酮的濾布(聚丙烯)的壓濾機上過濾來收集該沉淀物。在過濾過程中，將壓力保持在3.5巴以下。最后，在一個真空干燥機中干燥該沉淀物。最終壓力為0.5毫巴并且最終溫度為38°C。
[0085]使用溶解孵育，隨后是在相等體積的氯仿中進行DNA提取來提取DNA。使用可商購的DNA試劑盒最后純化并濃縮DNA。隨后在使用可商購的PCV2檢測試劑盒的實時PCR儀器中分析PCV2 DNA的存 在。發(fā)現干燥的胰蛋白酶對于PCV2而言呈陽性(Ct:36)。
【權利要求】
1.一種用于從包括一種靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒和/或病毒DNA的方法，所述方法包括: a)將丙酮以選擇性地沉淀該病毒和/或病毒DNA的濃度添加至該溶液中， b)進行一個分離步驟，以將沉淀的材料與包括該靶蛋白的溶液分開， c)向該溶液中添加另外量的丙酮，以達到沉淀該靶蛋白的終濃度，并且 d)從該溶液中收集該沉淀的靶蛋白。
2.如權利要求1所述的方法，其中在步驟a)中的丙酮的濃度是約12%-40% (v/v),優(yōu)選是約12% -30% (v/v),更優(yōu)選是約14% -30% (v/v),甚至更優(yōu)選是約15% -20% (v/V)。
3.如權利要求1所述的方法，其中在步驟a)中的丙酮的濃度是約15%(v/v) ο
4.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟c)中的丙酮的終濃度是45%-95%，優(yōu)選是 60%-70% (v/v)，更優(yōu)選是約 66% (v/v)。
5.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中該靶蛋白獲得自一種哺乳動物來源。
6.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中該靶蛋白是胰蛋白酶。
7.如以上權利要 求中任一項所述的方法，其中在低于15°C的溫度下進行步驟a)中的選擇性沉淀。
8.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟b)中的分離包括過濾和/或離心。
9.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟b)中的分離包括深層過濾。
10.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中步驟d)包括過濾和/或離心。
11.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中該病毒是一種無包膜病毒。
12.如以上權利要求所述的方法，其中該病毒是PCV2。
13.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟b)中，少于25%的靶蛋白被分離。
14.如以上權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟b)中，至少50%，優(yōu)選至少90%的病毒DNA被分離。
15.如以上權利要求中任一項所述的方法，該方法是一種用于從包括一種靶蛋白的水溶液中選擇性地除去病毒DNA的方法。
【文檔編號】A61L2/00GK104023752SQ201280061308
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年12月19日 優(yōu)先權日:2011年12月20日
【發(fā)明者】P·約翰森, C·J·克普卡 申請人:諾維信公司