包含兩親性的在親水部分總體帶正電的分子類型a和兩親性的分子類型b以及多酚c的分 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含兩親性的在親水部分具有正的總電荷的分子類型A和兩親性的分子類型B和多酚C的分子混合物，還涉及這種分子混合物的制備方法及其應(yīng)用。其中所述分子類型A和B以l(±0.2):l(=0.2)mol/mol的A:B的摩爾比存在。還公開了制備這種混合物的方法及其應(yīng)用。
【專利說明】包含兩親性的在親水部分總體帶正電的分子類型A和兩親性的分子類型B以及多酚C的分子混合物其制備方法及應(yīng)用
[0001]本發(fā)明涉及包含兩親性的在親水部分具有正的總電荷的分子類型A和兩親性的分子類型B和多酚C的分子混合物，還涉及這種分子混合物的制備方法及其應(yīng)用。
現(xiàn)有技術(shù)
[0002]多酚是存在于植物種子、葉和果實中的次級植物化學(xué)物。這種物質(zhì)中的一些對癌細(xì)胞起抑制作用(Mentha, R.G., Murillo G., Naithani R.和 Peng X.，Pharm Res(2010) 24:950-961)或保護(hù)而免受所不希望的氧化過程(Queen B.L., Tollefsbold T.0.，Curr.AgingSe1.(2010).3:34-42)。因此，它們屬于人類營養(yǎng)中的重要成分。另一方面，他們也是化療中的重要成分，因為它們在極高的濃度下具有毒性作用。由于多酚的高的治療重要性，其對生物體可控而有效的施用是令人極其感興趣的。
[0003]在水溶液中的這類疏水性活性物質(zhì)的施用具有多種缺點。一方面，需要非常高的濃度以達(dá)到治療效果。而絕大部分的有效物質(zhì)不能夠達(dá)到細(xì)胞，因此大約99%的多酚沒有被細(xì)胞吸收。另一方面，它們由于在水性環(huán)境中不希望的氧化而失去其效果。
[0004]脂質(zhì)體和聚合物膠囊提高了多酚的生物可用性，因為相比于水性施用，它們更易于表現(xiàn)出物理化學(xué)性質(zhì)和親水性(Nair H.B.等人，Biochem.Pharmacology
(2010).80:1833-18 43; Kristi J.等人，Eu.J.0f Pharmaceutics andBiopharmaceutics (2009).73:253-259; Narayanan N.K., Nargi D., Randolph C,和Narayanan B.A., (2009).1nt.J.Cancer.125:1-8)。盡管這些膠囊因此具有優(yōu)點，但不利的是不能保證可控的釋放和多酚被靶細(xì)胞快速地吸收。脂質(zhì)體也只能部分地保護(hù)多酚免受所不希望的氧化過程。
[0005]本發(fā)明的目的和解決方案
本發(fā)明的目的因此在于，提供一種分子混合物，在其中使多酚穩(wěn)定并保護(hù)其免受氧化過程。多酚或多酚的混合物應(yīng)該如下存在，即其可以迅速和高效地甚至以超過平均水平的高量控制，即以所希望的量引入到活的細(xì)胞中，并由此獲得對細(xì)胞的有針對性的預(yù)防效果或有針對性的毒性效果。此外，本發(fā)明的目的還在于提供制備所述混合物的方法及其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的通過本發(fā)明的根據(jù)獨立權(quán)利要求的混合物，制備該混合物的方法和該混合物的用途得以實現(xiàn)。有利的實施方案可以從各自的從屬權(quán)利要求，特別是從要求保護(hù)作為脂質(zhì)體的分子混合物的權(quán)利要求6中獲得。
[0007]本發(fā)明的分子混合物具有至少兩種分子類型A和B以及多酚C。
[0008]所述兩種分子類型A和B的摩爾比為A:B為大約1:1?？梢栽试S與該優(yōu)選的1:1mol/mol 的比例有微小的偏差，即 I (±0.2):1 (±0.2) mol/mol 的 A:B。
[0009]有利地，分子類型A、B和多酚C的摩爾比應(yīng)該為約1( + 0.2):1(±0.2):0.1-25mol/mol，特別有利的是I (±0.2):1 (±0.2):0.1-10 mol/mol，和非常特別有利的是1(±0.2):1(±0.2):0.5-5 mol/mol 0對于最后提及的情況，在體外已經(jīng)證明多酚C經(jīng)由脂質(zhì)體結(jié)合到靶細(xì)胞中。
[0010]如已提及的，與所述比例的微小偏差是允許的，只要分子類型A的相互排斥的電荷能通過中性的輔助分子B平衡。對于多酚C來說，A:B: C的比例在體外自大約1: 1:5 mol/mo I變化到毒性濃度。
[0011]可以理解，對于每種分子類型A和B的相應(yīng)中間值是允許的，即例如對于分子類型A和分子類型B來說0.8,0.9、1.0、1.1和1.2和反之其中間值都是允許的。這同樣適用于多酚C，即只要僅確保多酚C能夠快速地由混合物結(jié)合到靶細(xì)胞中并且特別是由脂質(zhì)體結(jié)合到細(xì)胞中，所有數(shù)值0.01,0.02,0.03,0.04...24.98,24.99和25.00可允許與在具有分子類型A和B的所述混合物中的所述數(shù)值的自由組合。
[0012]此外，在本發(fā)明范圍內(nèi)認(rèn)識到，相較于如現(xiàn)有技術(shù)中按照Kristl等人所做般由中性脂質(zhì)體開始，借助由本發(fā)明的混合物制成的帶正電的脂質(zhì)體可以更好地使多酚含于并結(jié)合到靶細(xì)胞中及其細(xì)胞膜中。在那里由于制備方法造成在制成的脂質(zhì)體的表面上白藜蘆醇僅少量盡可能加載在脂質(zhì)體上，因為在那里在水相中制備脂質(zhì)體之后才加入多酚。與此相反，在本發(fā)明的情況中，在由經(jīng)干燥的混合物制備脂質(zhì)體時已經(jīng)存在多酚。因此，多酚是脂質(zhì)體膜中的基本成分，并大量結(jié)合在其中。由此有利地將多酚C可控地、有針對性地、完全地加載于脂質(zhì)體上。此外，在本發(fā)明范圍內(nèi)認(rèn)識到，然后在脂質(zhì)體膜中的多酚發(fā)生由細(xì)胞的膜引發(fā)的自身融合。由此有利導(dǎo)致所述多酚高效并快速地轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中。
[0013]此外已發(fā)現(xiàn)，所述多酚在形成脂質(zhì)體的膜中受到非常好的保護(hù)避免初期氧化。
[0014]對所述混合物的制備方法已認(rèn)識到，多酚通?？闪己玫厝芙庠谟袡C(jī)溶劑如乙醇或氯仿中，因此這可阻止多酚的初期氧化。因此，為提供本發(fā)明的混合物，將溶解的多酚與分子類型A和B的中性和帶正電的脂質(zhì)在至少一種有機(jī)溶劑中進(jìn)行混合。這起到均化分子混合物的作用。
[0015]可以理解，在除去有機(jī)溶劑之后，該混合物有利地以粉末狀的、均化的形式存在。僅此就已實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0016]當(dāng)用于混合時，也應(yīng)相應(yīng)于用于制備方法一般，選擇分子比例A:B為1(±0.2):1(±0.2) mol/mol O有利地，分子類型A、B的正電和中性的脂質(zhì)和多酚C的摩爾比應(yīng)該為或設(shè)定為約1(±0.2):1(±0.2):0.1-25 mol/mol,特別有利的是1(±0.2):1(±0.2):1-10 mol/mol，和非常特別有利的是 I (±0.2):1 (±0.2):0.5-5 mol/mol。如如所述，在此些許偏差是允許的。
[0017]本發(fā)明的混合物(優(yōu)選定義為脂質(zhì)體)和基于本發(fā)明的混合物(特別是脂質(zhì)體)的獲得應(yīng)用的藥物因此以給定的比例包含分子類型A和分子類型B以及多酚C。
[0018]在另一特別有利的本發(fā)明的實施方案中，通過將有機(jī)相經(jīng)過粉末狀相轉(zhuǎn)移到水性的脂質(zhì)體的環(huán)境中，以特別有利的方式提高了多酚用于治療目的的生物可用性，同時保護(hù)其免受氧化作用。
[0019]因此將所述由分子類型A和B與多酚C構(gòu)成的本發(fā)明的分子混合物與一種或多種有機(jī)溶劑分離并小心地轉(zhuǎn)移到PH約為7的水性緩沖液中。也就是說，為了制備所述脂質(zhì)體，基本上將有機(jī)組分替換成基于水性的生理緩沖液的體系。[0020]在水性環(huán)境中才形成該特別優(yōu)選的多層封閉的球形結(jié)構(gòu)，即所謂的脂質(zhì)體。通過另外的步驟，例如超聲處理、擠壓或溶液的多次冷卻和加熱(最低到4°C和最高到70°C)，可以進(jìn)一步均化該脂質(zhì)體。由于分子類型A，這些結(jié)構(gòu)具有正電荷(ζ電勢Uz=30-100 mV)。大多數(shù)非極性的多酚位于脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)體膜的內(nèi)部，由此以有利的方式屏蔽掉反應(yīng)性的氧自由基并受到保護(hù)。可以由所有根據(jù)本發(fā)明的混合物形成這種脂質(zhì)體。
[0021]由于帶正電的脂質(zhì)與植物多酚的離域電子的相互作用，加載有多酚C的本發(fā)明的脂質(zhì)體通過簡單的表面接觸經(jīng)幾分鐘(5-20分鐘)高效地與動物細(xì)胞的質(zhì)膜融合。
[0022]如果所述混合物以脂質(zhì)體形式存在，則多酚C絕大多數(shù)結(jié)合到脂質(zhì)體膜中存在。只有較少部分在脂質(zhì)體本身的內(nèi)部中溶解到水性緩沖液中。這樣造成多酚本身引發(fā)與靶細(xì)胞膜的融合。
[0023]在治療應(yīng)用期間，所述酚類本身代替細(xì)胞分子被氧化。由此，多酚的存在有利地阻止了細(xì)胞的過氧化。因此，本發(fā)明的混合物和由其制成的藥物在治療所有氧化性疾病過程時或?qū)δ承┌┌Y疾病是有效的治療劑。
[0024]如果在體外在混合物中或在脂質(zhì)體中應(yīng)存在較大量的這種自由基捕獲劑，則可以使用或給予分子類型A、B和多酚C的摩爾比例的值為約1:1:5 mol/mol ο這種混合物則更確切地說起毒性作用。因此，在癌癥治療中推薦這種大量或甚至更大的量，以高度過氧化癌細(xì)胞并由此將其殺死。在體內(nèi)，其它濃度是可能的并可以考慮。
[0025]所述混合物和帶正電的脂質(zhì)體因此必須含有分子類型A和分子類型B。分子類型A的標(biāo)準(zhǔn)是，(a)該分子具有帶至少一個或多個正電荷的親水部分，因此該分子的親水部分的總電荷是正的。 在分子的目的是，通過靜電力將該融合混合物帶到帶負(fù)電的細(xì)胞膜附近。(b)分子類型A還具有疏水部分，優(yōu)選帶或不帶雙鍵的C10-C30-部分。雙鍵的有利作用是使產(chǎn)生的脂質(zhì)體的膜變得有彈性，從而使該脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合變得容易。合適的分子例如是1，2- 二油酰基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、N-(2.3- 二油基氧基丙基)-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)、二甲基-二-十八烷基溴化銨(DDAB)或(1_[2_(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥基乙基)氯化咪唑啉鎗(DOTIM)。作為第一個實例可提及DOTAP(1，2- 二油酰基-3-三甲基銨丙烷(氯化物鹽))。
[0026]分子類型B的標(biāo)準(zhǔn)是，(a)該分子必須具有親水部分以及帶或不帶雙鍵的疏水部分(特別是C10-C30)。關(guān)于雙鍵的功能見類型A。(c)兩個部分均應(yīng)具有中性性質(zhì)，以中和分子類型A的帶正電的分子之間的大的電荷密度和排斥力。該效果導(dǎo)致體系穩(wěn)定。分子類型B因此是輔助分子。合適的分子例如是磷脂酰乙醇胺類和磷脂酰膽堿類，例如1，2- 二油?；?sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺(DOPE)、1，2- 二棕櫚?；?sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺(DPPE)、I, 2- 二肉豆蘧?；?Dimiristoyl) -sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺(DMPE)、I, 2-反油酸?；?Dielaidoyl) -sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺(DEPE)、1，2- 二植烷醇sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺、1，2- 二亞油酰基sn-甘油基-3 - 二氧磷基乙醇胺或1，2- 二油?；鵶n-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DOPC)。
[0027]所用的多酚是含有至少兩個直接連在芳環(huán)上的羥基并屬于次級植物化學(xué)物的分子。對于本發(fā)明的混合物和脂質(zhì)體，優(yōu)選以給定的比例選擇多列如白藜蘆醇、姜黃素、羥基黃酮和金雀異黃酮。
[0028]下面，借助實施例和兩張附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，并不應(yīng)該因此認(rèn)為限制本發(fā)明。[0029]其中:
圖1:優(yōu)選的多酚的結(jié)構(gòu):1.白藜蘆醇.11.姜黃素.1I1.羥基黃酮.1V.金雀異黃酮.圖2:白藜蘆醇結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體中以及其在細(xì)胞中的體外證明。
[0030]在圖1中顯示的結(jié)構(gòu)式僅示例性地顯示了幾種特別重要的和易于獲得的多酚。但是，其它沒有顯示的多酚也應(yīng)該明確包含在有效的權(quán)利要求保護(hù)中。當(dāng)然也可以考慮將不同于所示的其它多酚用于本發(fā)明的混合物和脂質(zhì)體的制備和用途中。
[0031]1.實施例-對細(xì)胞的體外研究:將作為分子類型A的帶正電的脂質(zhì)的1，2_二油?；?3-三甲基銨-丙烷、氯化物鹽(DOTAP)以及作為分子類型B的中性的脂質(zhì)1，2-二油酸基-sn-甘油基 _3_ 二氧憐基乙醇胺(DOPE) (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster,AL, USA)和作為熒光標(biāo)記物脂質(zhì)的N-(4，4- 二氟-5，7- 二甲基-4-硼雜(bora)_3a，4a- 二氮雜-對稱引達(dá)省(s-1ndacene)-3-丙酰基)_1，2_ 二-十六燒?；鵢sn_甘油基_3_ 二氧磷基乙醇胺(三乙銨鹽)(相當(dāng)于 BODIPY? FL-DHPE) (Invitrogen, Eugene, OR, USA)以摩爾比例 DOTAP/DOPE/BODIPY? FL-DHPE = 1/1/0.005 mol/mol 以約為 I mg/ml 的總的脂質(zhì)濃度溶解在氯仿/乙醇(10/1體積/體積)的溶劑混合物中，并將其混合。
[0032]其中，B0DIPY? FL-DHPE僅僅是用于證明脂質(zhì)體和質(zhì)膜之間成功的膜融合。這種染料料明確不是本發(fā)明混合物或本發(fā)明脂質(zhì)體的主題。
[0033]首先將白藜蘆醇(Sigma-Aldrich,St.Louis, MO, USA)以 I mg/ml 的濃度溶于作為有機(jī)溶劑的乙醇中并且均化。
[0034]然后將由分子類型A和B和B0DIPY? FL-DHPE形成的脂質(zhì)組分以下列摩爾比例由于有機(jī)溶劑混合物的緣故與白藜蘆醇相互混合(表1)。
[0035]表1:組分A、B和多酚C以及溶劑的量和體積的數(shù)據(jù)(MW=分子量；stock=原液)。
【權(quán)利要求】
1.分子混合物，其包含兩親性的在親水部分具有正的總電荷的分子類型A和兩親性的在親水部分呈中性的分子類型B和多酚C，其中所述分子類型A和B和所述多酚C以..1(±0.2):1(±0.2):0.5-5 mol/mol 的 A:B:C 的摩爾比存在。
2.根據(jù)前述權(quán)利要求的混合物， 其特征在于， I,2- 二油酰基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)、N-(2.3- 二油基氧基丙基)-N，N, N-三甲基氯化銨(DOTMA)、二甲基-二 -十八烷基溴化銨(DDAB)或(1_[2_(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥基乙基)氯化咪唑啉鎗(DOTIM)或其混合物作為分子類型A。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的混合物， 其特征在于， 磷脂酰乙醇胺類和磷脂酰膽堿類，例如1，2- 二油?；?sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺、1，2- 二棕櫚?；?sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺、1，2- 二肉豆蘧?；鵢sn-甘油基_3_ 二氧憐基乙醇胺、1，2-反油酸酸基-sn_甘油基-3- 二氧憐基乙醇胺、1，2- 二植燒醇sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺、1，2- 二亞油?；鵶n-甘油基_3 - 二氧磷基乙醇胺或.1，2- 二油?；鵶n-甘油基-3-磷脂酰膽堿或其混合物作為分子類型B。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的混合物， 其特征在于， 白藜蘆醇、姜黃素、羥基黃酮和/或金雀異黃酮或其混合物作為多酚。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的混合物， 其特征在于， 所述分子類型A和B和所述多酚C以1(±0.2):1(±0.2):0.5-2.5 mol/mol的A:B:C的摩爾比，特別是以1(±0.2):1(±0.2):0.62-2.5 mol/mol的A:B:C的摩爾比和特別是以.1(±0.2):1(±0.2):1.25-2.5 mol/mol 的 A:B:C 的摩爾比存在。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之一的混合物， 其特征在于， 其作為脂質(zhì)體在水性環(huán)境中存在。
7.制備根據(jù)前述權(quán)利要求1-5之一的混合物的方法， 其特征在于下列步驟: a)將所述分子類型A和B溶于有機(jī)溶劑中， b)將所述多酚C與分子類型A和B分開地溶于有機(jī)溶劑中并混合，或與分子類型A和B一起溶于同一有機(jī)溶劑中并混合， c)如果在步驟b)中所述多酚C在所述有機(jī)溶液中的溶解與分子類型A和B的溶解分開進(jìn)行，則將含有分子類型A和B的溶劑和含有多酚C的溶劑相互混合并均化，其中在每種情況中在步驟b)和c)中選擇I (±0.2):1 (±0.2):0.5-5 mol/mol的A:B:C的摩爾比， d)除去所述一種或多種溶劑。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法， 其特征在于， 選擇甲醇或乙醇作為所述多酚C的溶劑，并通過選擇氯仿、乙醇和/或甲醇作為所述分子類型A和B的溶劑。
9.根據(jù)前述兩項權(quán)利要求之一的方法， 其特征在于， 在步驟 b)和 c)中選擇 1( + 0.2):1(±0.2):0.62-2.5 mol/mol 的 A:B:C 的摩爾比和特別是 1(±0.2):1(±0.2):1.25-2.5 mol/mol 的 A:B:C 的摩爾比。
10.根據(jù)用于制備根據(jù)權(quán)利要求6的脂質(zhì)體的前述三項權(quán)利要求之一的方法， 其特征在于， 將所述分子混合物轉(zhuǎn)移到生理水溶液中。
11.藥劑，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求1-6之一的混合物。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求1-6之一的混合物 在制備用于治療由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞疾病的藥劑中的用途。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求1-6之一的混合物或根據(jù)權(quán)利要求10的藥劑用于治療由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞疾病的用途。
14.用根據(jù)前述權(quán)利要求1-6之一的混合物或根據(jù)權(quán)利要求10的藥劑治療由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞疾病的方法。
15.融合方法，在所述方法中根據(jù)權(quán)利要求6的加載有多酚C的脂質(zhì)體由于帶正電的脂質(zhì)和植物多酚的離域電子之間的相互作用通過簡單的表面接觸經(jīng)幾分鐘高效地與動物細(xì)胞的質(zhì)膜融合。
【文檔編號】A61K9/127GK103957889SQ201280049046
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年10月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月6日
【發(fā)明者】A.克西斯扎爾, C.克洛伊施, B.霍夫曼, R.默克爾 申請人:于利奇研究中心有限公司