用于抑制masp-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化的組合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及抗MASP-2抑制性抗體和包括該抗體的組合物，用于抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化的不良效果。在一方面，本發(fā)明提供了分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合人MASP-2，所述抗體包括：（i）包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列的重鏈可變區(qū)；和（ii）包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列的輕鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)CDR-H3序列包括設(shè)置與B因子形成額外的替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶（C3bBb）的氨基酸序列。替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶通過(guò)結(jié)合備解素被穩(wěn)定化。備解素使替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶的半衰期延長(zhǎng)六到十倍。向替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶添加C3b導(dǎo)致替代途徑C5轉(zhuǎn)化酶的形成。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化的組合物
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及抗MASP-2抑制性抗體和包括該抗體的組合物，用于抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化的不良效果。
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[0004]發(fā)明背景
補(bǔ)體系統(tǒng)為在人和其它脊椎動(dòng)物中啟動(dòng)、增強(qiáng)并協(xié)調(diào)對(duì)微生物感染和其它急性損傷的免疫應(yīng)答提供了早期的作用機(jī)制(M.K.Liszewski和J.P.Atkinson, 1993,載于Fundamental Immunology，第三版，ff.E.Paul 編輯，Raven Press, Ltd., New York)。盡管補(bǔ)體活化提供了重要的針對(duì)潛在病原體的第一線(xiàn)防御，但是促進(jìn)保護(hù)性免疫應(yīng)答的補(bǔ)體活性也可以表現(xiàn)出對(duì)宿主的潛在威脅(K.R.Kalli等，Springer Semin.1mmunopathol.15:417-431，1994 ；B.P.Morgan, Bur.J.Clinical Inves tig.24:219-228，1994)。例如，C3和C5蛋白水解產(chǎn)物募集并活化嗜中性粒細(xì)胞。盡管對(duì)于宿主防御是必不可少的，但是活化的嗜中性粒細(xì)胞在它們破壞性酶的釋放中是不加選擇的，并可以導(dǎo)致器官損傷。此外，補(bǔ)體活化可以導(dǎo)致溶胞的補(bǔ)體成分沉積在附近的宿主細(xì)胞以及微生物靶上，導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解。
[0005]補(bǔ)體系統(tǒng)已經(jīng)與許多急性和慢性疾病狀態(tài)的發(fā)病機(jī)制有牽連，所述疾病包括:心肌梗塞、中風(fēng)、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、再灌注損傷、敗血癥性休克、熱燒傷之后的毛細(xì)血管滲漏、心肺分流術(shù)后炎癥、移植排斥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力和阿爾茨海默病。在幾乎所有的這些狀況中，補(bǔ)體都不是病因，而是發(fā)病機(jī)制所涉及的若干因素之一。盡管如此，補(bǔ)體活化可以是重要的病理機(jī)制，并對(duì)許多這類(lèi)疾病狀態(tài)中的臨床控制表現(xiàn)出有效之處。
[0006]對(duì)各種疾病狀態(tài)中補(bǔ)體介導(dǎo)的組織損傷的重要性的逐漸增加的認(rèn)識(shí)加強(qiáng)了對(duì)有效補(bǔ)體抑制藥物的需求。到目前，依庫(kù)麗單抗(Soliris?),針對(duì)C5的抗體,是僅有的已被批準(zhǔn)用于人使用的補(bǔ)體靶向藥物。然而，C5是位于補(bǔ)體系統(tǒng)“下游”的幾個(gè)效應(yīng)物分子之一，并且阻斷C5不抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的活化。因此，補(bǔ)體活化的起始步驟的抑制劑將具有相對(duì)“下游”補(bǔ)體抑制劑的顯著優(yōu)勢(shì)。
[0007]目前，普遍接受補(bǔ)體系統(tǒng)可通過(guò)三種截然不同的途徑被活化:經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑。經(jīng)典途徑通常是由宿主抗體結(jié)合外源顆粒(即抗原)組成的復(fù)合物觸發(fā)的，并且因此需要預(yù)先暴露于該抗原來(lái)產(chǎn)生特異性抗體應(yīng)答。因?yàn)榻?jīng)典途徑的活化取決于先前的宿主的獲得性免疫應(yīng)答，所以經(jīng)典途徑是獲得性免疫系統(tǒng)的一部分。相反，凝集素途徑和替代途徑兩者不依賴(lài)于獲得性免疫，并且是先天性免疫系統(tǒng)的一部分。
[0008]補(bǔ)體系統(tǒng)的活化導(dǎo)致絲氨酸蛋白酶酶原的順序活化。經(jīng)典途徑活化的第一步是特異性識(shí)別分子Clq與結(jié)合了抗原的IgG和IgM復(fù)合物的結(jié)合。Clq與Clr和Cls絲氨酸蛋白酶酶原結(jié)合成稱(chēng)為Cl的復(fù)合物。當(dāng)Clq與免疫復(fù)合物結(jié)合時(shí)，Clr的Arg-1le位點(diǎn)進(jìn)行自我蛋白水解切割，隨后是Clr介導(dǎo)的Cls切割和活化，其從而獲得切割C4和C2的能力。C4切割成兩個(gè)片段，稱(chēng)為C4a和C4b，并且，類(lèi)似地，C2切割成C2a和C2b。C4b片段能夠與鄰近的羥基或氨基形成共價(jià)鍵，并且通過(guò)與活化C2的C2a片段進(jìn)行非共價(jià)相互作用而生成C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2b)。C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2b)通過(guò)蛋白水解切割成C3a和C3b亞成分而活化C3，導(dǎo)致C5轉(zhuǎn)化酶(C4b2a3b)的生成，其通過(guò)切割C5導(dǎo)致可以破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞裂解的膜攻擊復(fù)合物(C5b組合C6、C7、C8和C9，也稱(chēng)為“MAC” )的生成。C3和C4的活化形式(C3b和C4b)共價(jià)沉積在外源靶表面上，其被多種吞噬細(xì)胞上的補(bǔ)體受體所識(shí)別。
[0009]獨(dú)立地，補(bǔ)體系統(tǒng)通過(guò)凝集素途徑活化的第一步也是特異性識(shí)別分子的結(jié)合，其隨后是所結(jié)合的絲氨酸蛋白酶原的活化。然而，凝集素途徑中的識(shí)別分子包括一組統(tǒng)稱(chēng)為凝集素的糖結(jié)合蛋白(甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)、H-纖維膠凝蛋白(H-ficolin)、M-纖維膠凝蛋白、L-纖維膠凝蛋白和C型凝集素CL-1 I)，而不是通過(guò)Clq來(lái)結(jié)合免疫復(fù)合物。參見(jiàn) J.Lu 等，Biochim.Biophys.Acta 757J?: 387-400，2002; Holmskov 等，Annu.Rev.1mmunol.21:547-578 (2003) ; Teh 等，Immunology 101 _.225-2?>2 (2000))。還參見(jiàn) J.Luet 等，Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002) ; Holmskov 等，Annu RevImmunol 21:547-578 (2003) ; Teh 等，Immunology 101:225-232 (2000) ; Hansen S.等，J.1mmunol 185(10):6096-6104 (2010)。
[0010]Ikeda等人首先證明，與Clq類(lèi)似，MBL在與酵母甘露聚糖包被的紅細(xì)胞結(jié)合后可以以依賴(lài)C4的方式使補(bǔ)體系統(tǒng)活化(K.1keda等，7； Biol.Chem.262:7451-7454，1987)。MBL是膠原凝集素蛋白家族的成員，是鈣依賴(lài)的凝集素，其與具有定位于吡喃糖環(huán)赤道面上的3-羥基和4-羥基的糖類(lèi)結(jié)合。因此MBL的重要配體是D-甘露糖和N-乙酰-D-葡糖胺，而不符合這種空間要求的糖類(lèi)則對(duì)MBL沒(méi)有可檢測(cè)的親和性(Weis, W.1.等，Nature360:127-134,1992)。MBL和單價(jià)糖之間的相互作用是相當(dāng)微弱的，解離常數(shù)通常在個(gè)位數(shù)豪摩爾的范圍內(nèi)。MBL通過(guò)親和力，即通過(guò)同時(shí)與位置彼此緊密相鄰的多個(gè)單糖殘基相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)聚糖配體特異性地緊密結(jié)合(Lee, R.T.等，ArcAiK Biochem.Biophys.299:129-136，1992)。MBL識(shí)別通常修飾微生物如細(xì)菌、酵母、寄生蟲(chóng)和某些病毒的糖模式。相反，MBL不識(shí)別D-半乳糖和唾液酸，即倒數(shù)第二位的糖和倒`數(shù)第一位的糖，它們一般修飾哺乳動(dòng)物血漿和細(xì)胞表面糖蛋白上存在的“成熟”復(fù)合糖綴合物。認(rèn)為這種結(jié)合特異性促進(jìn)“外源”表面的識(shí)別和有助于保護(hù)免于自身活化。然而，MBL確實(shí)以高親和力結(jié)合高甘露糖“前體”聚糖簇，這些簇位于被隔離在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)的N-連接的糖蛋白和糖脂上(Maynard, I 等，J.Biol.Chem.257:3788-3794，1982)。因此，受損細(xì)胞是經(jīng)由MBL結(jié)合的凝集素途徑活化的潛在目標(biāo)。
[0011]纖維膠凝蛋白具有與MBL不同類(lèi)型的的凝集素結(jié)構(gòu)域，稱(chēng)為纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。纖維膠凝蛋白以不依賴(lài)Ca++的方式來(lái)結(jié)合糖殘基。在人中，已經(jīng)鑒定出纖維膠凝蛋白的三種類(lèi)型(L-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白和H-纖維膠凝蛋白)。L-纖維膠凝蛋白和H-纖維膠凝蛋白這兩種血清纖維膠凝蛋白共同對(duì)N-乙酰-D-葡糖胺具有特異性；然而，H-纖維膠凝蛋白還結(jié)合N-乙酰-D-半乳糖胺。L-纖維膠凝蛋白、H-纖維膠凝蛋白、CL-1I和MBL的糖特異性的差異意味著不同的凝集素可是互補(bǔ)的，盡管有重疊，但是可靶向不同的糖綴合物。這個(gè)觀點(diǎn)得到了最近報(bào)道的支持，即在凝集素途徑的已知凝集素中，只有L-纖維膠凝蛋白與脂磷壁酸特異性結(jié)合，所述脂磷壁酸是一種在所有革蘭氏陽(yáng)性菌上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞壁糖綴合物(Lynch，N.J.等，J.1mmunol.172:1198-1202，2004)。膠原凝集素(即 MBL)和纖維膠凝蛋白在氨基酸序列上沒(méi)有顯著的相似性。然而，兩組蛋白質(zhì)具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)域組構(gòu)，且與Clq類(lèi)似，裝配成寡聚結(jié)構(gòu)，這樣就使得多位點(diǎn)結(jié)合的可能性最大化。 [0012]MBL的血清濃度在健康人群中是高度可變的，這在遺傳上是由MBL基因的啟動(dòng)子和編碼區(qū)二者的多態(tài)性/突變所控制的。作為急性期蛋白，MBL的表達(dá)在炎癥期間進(jìn)一步上調(diào)。L-纖維膠凝蛋白在血清中存在的濃度與MBL的濃度類(lèi)似。因此，凝集素途徑的L-纖維膠凝蛋白分支途徑在強(qiáng)度上可能與MBL分支不相上下。MBL和纖維膠凝蛋白也可能作為調(diào)理素起作用，其允許吞曬細(xì)胞祀向MBL和纖維膠凝蛋白修飾的表面(參見(jiàn)Jack等，J LeukocBiol., 77 (3):328-36 (2004); Matsushita和Fujita, Immunobiology，205 (4-5):490-7(2002) ; Aoyagi 等，J Iwmunol 174(1):418-25 (2005))。此調(diào)理素作用需要這些蛋白與吞卩遼細(xì)胞受體相互作用(Kuhlman, M.等，J.Exp.Med.169:1733,1989 ；Matsushita,M.等,J.Biol.Chem.271:2448-54，1996)，這些吞噬細(xì)胞受體的身份還未得到確定。。
[0013]人MBL通過(guò)其膠原樣結(jié)構(gòu)域與獨(dú)特的Clr/Cls樣絲氨酸蛋白酶形成特異性、高親和性的相互作用，稱(chēng)為MBL相關(guān)的絲氨酸蛋白酶(MASP)。迄今為止已經(jīng)描述了三種MASP。首先，鑒定出單一的酶“MASP”，并且其特征是作為負(fù)責(zé)啟動(dòng)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)(即切割C2和C4)的酶(Matsushita M 和 Fujita T., J Exp Med 176(6):1497-1502 (1992)，Ji, Y.H.等,J.1mmunol.150:571-578，1993)。隨后，確定MASP活性實(shí)際上是兩種蛋白酶MASP-1和MASP-2的混合物(Thiel, S.等，Nature 386:506-510,1997)。然而，證明 MBL-MASP-2 復(fù)合物單獨(dú)就足以使補(bǔ)體活化(Vorup-Jensen, T.等，J.1mmunol.165:2093-2100, 2000) ? 此外，只有 MASP-2 以高速切割 C2 和 C4 (Ambrus, G.等，J.1mmunol.170:1374-1382，2003)。因此，MASP-2是負(fù)責(zé)活化C4和C2以產(chǎn)生C3轉(zhuǎn)化酶C4b2a的蛋白酶。這是不同于經(jīng)典途徑中Cl復(fù)合物的顯著差異，其中兩種特異性絲氨酸蛋白酶(Clr和Cls)協(xié)同作用導(dǎo)致了補(bǔ)體系統(tǒng)的活化。另外，已經(jīng)分離出第三種新的蛋白酶MASP-3 (Dahl, M.R.等，I_unity15:127-35,2001)。MASP-1和MASP-3是同一基因的可變剪接產(chǎn)物。
[0014]MASP與Cl復(fù)合物的酶成分Clr和Cls共享相同的結(jié)構(gòu)域組構(gòu)(Sim，R.B.等，Biochem.Soc.Trans.28:545，2000)。這些結(jié)構(gòu)域包括 N 末端 Clr/Cls/ 海膽 VEGF/ 骨形成蛋白(CUB)結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域、第二 CUB結(jié)構(gòu)域、串聯(lián)的補(bǔ)體調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)域和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。與在Cl蛋白酶中一樣，MASP-2的活化通過(guò)絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域附近的Arg-1le鍵裂解而發(fā)生，其將酶分成二硫鍵連接的A鏈和B鏈，后者由絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。最近，描述了 MASP-2的遺傳確定的缺陷(Stengaard-Pedersen, K.等,NewEng.J.Med.349:554-560，2003)。單個(gè)核苷酸的突變導(dǎo)致CUB I結(jié)構(gòu)域中的Asp-Gly交換，并使得MASP-2不能與MBL結(jié)合。
[0015]MBL還與MASP-2的可變剪接形式，稱(chēng)為19 kDa MBL相關(guān)蛋白(MApl9) (Stover,
C.M., Immunol.162:3481-90，1999)或者小 MBL 相關(guān)蛋白(sMAP) (Takahashi，M?等，Int.1mmunol.11:859_863，1999)締合，所述蛋白缺乏MASP-2的催化活性。MApl9包括MASP-2的前兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其后接4個(gè)獨(dú)特氨基酸的額外序列。MASP 7和姻5P 基因分別位于人 3 號(hào)和 I 號(hào)染色體上(Schwaeble, W.等，Immunobiology 205:455-466, 2002)。
[0016]若干證據(jù)表明存在不同的MBL-MASP復(fù)合物，且血清中的各種MASP的大部分不與MBL 復(fù)合(Thiel，S.等,J.1mmunol.165:878-887，2000)。H-纖維膠凝蛋白和 L-纖維膠凝蛋白都與各種MASP結(jié)合，并且活化凝集素補(bǔ)體途徑，如MBL所為(Dahl，M.R.^dmmnity15:127-35,2001; Matsushita, M.等，J.1mmunol.168:3502-3506，2002)。凝集素途徑和經(jīng)典途徑都形成共同的C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2a)，并且這兩條途徑在這一步會(huì)合。
[0017]普遍認(rèn)為凝集素途徑在幼稚宿主中宿主抵抗感染的防御中具有重要作用。MBL參與宿主防御的強(qiáng)有力證據(jù)來(lái)自于對(duì)功能性MBL血清水平降低的患者的分析(Kilpatrick,
D.C.,Biochim.Biophys.Acta 1572:401-413, 2002)。這些患者表現(xiàn)出復(fù)發(fā)性細(xì)菌和真菌感染的易感性。這些癥狀通常在生命早期在易損表觀窗期間是明顯的，因?yàn)閺哪阁w獲得的抗體效價(jià)降低，但處于完整的抗體應(yīng)答庫(kù)發(fā)育之前。這種癥狀經(jīng)常是由于MBL膠原部分的數(shù)個(gè)位點(diǎn)突變引起的，其妨礙了 MBL寡聚體的正確形成。然而，由于MBL可以作為不依賴(lài)于補(bǔ)體的調(diào)理素起作用，所以還不知道對(duì)感染的易感性增加在多大程度上是由于受損的補(bǔ)體活化所致。
[0018]與經(jīng)典途徑和凝集素途徑相反，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)替代途徑中完成識(shí)別功能的起始因子(initiator)，而在其它兩種途徑中是Clq和凝集素來(lái)完成識(shí)別功能的。目前普遍接受的是，替代途徑自發(fā)經(jīng)歷低水平的周轉(zhuǎn)活化(turnover activation),其可以容易在外來(lái)表面或其它異常表面(細(xì)菌、酵母、病毒感染的細(xì)胞或者受損組織)上放大，其獨(dú)立保持自發(fā)活化受控的適當(dāng)?shù)姆肿釉?。有四種血漿蛋白直接參與了替代途徑的活化:C3、B因子、D因子和備解素。盡管大量證據(jù)表明在非感染性人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制中，經(jīng)典補(bǔ)體途徑和替代補(bǔ)體途徑兩者都存在，但是對(duì)凝集`素途徑作用的評(píng)價(jià)才剛剛開(kāi)始。最近研究提供的證據(jù)表明，凝集素途徑的活化可能是造成缺血/再灌注損傷中補(bǔ)體活化和相關(guān)炎癥的原因。Collard等人(2000)報(bào)告受到氧化應(yīng)激的培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合MBL，且在暴露于人血清時(shí)顯示出C3沉積(Collard, C.D?等，辦?.J.Pathol.156:1549-1556，2000)。此外，用封閉性抗MBL 單克隆抗體處理人血清抑制了 MBL結(jié)合和補(bǔ)體活化。將這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展到心肌缺血-再灌注大鼠模型上，其中比起用對(duì)照抗體處理的大鼠，用針對(duì)大鼠MBL的封閉性抗體處理的大鼠在冠狀動(dòng)脈閉塞時(shí)顯示心肌損傷顯著較輕(Jordan, J.E.等，Circulation 104:1413-1418,2001)。尚不清楚氧化應(yīng)激后MBL與血管內(nèi)皮結(jié)合的分子機(jī)制；最近的研究表明，氧化應(yīng)激后凝集素途徑的活化可能是由MBL與血管內(nèi)皮細(xì)胞角蛋白結(jié)合而介導(dǎo)的，而不是與糖綴合物結(jié)合(Collard, C.D.等，辦?.J.Pathol.159:1045-1054，2001)。其它研究已表明出缺血/再灌注損傷發(fā)病機(jī)制中的經(jīng)典途徑和替代途徑以及凝集素途徑在這種疾病中的作用仍然存在爭(zhēng)議(Riedermann, N.C?等，Aa J.Pathol.162:363-367，2003)。
[0019]近期的研究顯示需要MASP-1 (并且還可能是MASP-3)將替代途徑活化酶D因子從其酶原形式轉(zhuǎn)化成其酶活性形式(參見(jiàn)Takahashi M.et al.，J Exp Med 207(1):29-37(2010))。此過(guò)程的生理重要性通過(guò)在MASP-1/3缺陷小鼠的血漿中不存在替代途徑功能活性而得以強(qiáng)調(diào)。對(duì)于替代途徑，需要由天然C3蛋白水解生成的C3b發(fā)揮作用。由于替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)含有C3b作為必需亞基，關(guān)于經(jīng)由替代途徑的第一個(gè)C3b來(lái)源的問(wèn)題已提出了令人困擾的問(wèn)題，且促使了相當(dāng)多的研究工作。
[0020]C3屬于含有極少的被稱(chēng)為硫酯鍵的翻譯后修飾的蛋白質(zhì)家族(與C4和a -2巨球蛋白一起)。硫酯基團(tuán)由谷氨酰胺組成，其末端羰基基團(tuán)與三個(gè)氨基酸距離的半胱氨酸的巰基基團(tuán)形成共價(jià)硫酯連接。該鍵不穩(wěn)定，且親電子的谷氨酰硫酯可與親核部分例如羥基或氨基基團(tuán)反應(yīng)并從而與其它分子形成共價(jià)鍵。當(dāng)被隔離在完整C3的疏水口袋內(nèi)部時(shí)，硫酯鍵是相當(dāng)穩(wěn)定的。然而，C3被蛋白水解切割成C3a和C3b，導(dǎo)致C3b上高反應(yīng)性的硫酯鍵暴露出來(lái)，并隨著通過(guò)包括羥基或氨基基團(tuán)的鄰近部分的親核攻擊，C3b與靶共價(jià)結(jié)合。除了有大量文件證明C3b與補(bǔ)體靶共價(jià)結(jié)合的作用外，還有研究認(rèn)為C3硫酯具有觸發(fā)替代途徑的關(guān)鍵作用。根據(jù)普遍接受的“慢轉(zhuǎn)理論(tick-over theory)”，替代途徑是由液相轉(zhuǎn)化酶iC3Bb的生成所啟動(dòng)的，iC3Bb是由C3與水解硫酯(iC3; C3 (H2O))和B因子形成的(Lachmann, P.J.等，Springer Semin.1nmunopathol.7:143-162,1984)。C3b 樣 C3 (H2O)由天然C3經(jīng)蛋白質(zhì)中內(nèi)部硫酯的緩慢自發(fā)水解而產(chǎn)生(Pangburn, M.K.等,7； Exp.Med.154:856-867，1981)。通過(guò)C3 (H2O)Bb轉(zhuǎn)化酶的活性，C3b分子沉積在靶表面，從而啟動(dòng)替代途徑。
[0021]對(duì)替代途徑活化的起始因子的了解甚少。認(rèn)為活化因子包括酵母細(xì)胞壁(酵母聚糖)、許多純的多糖、兔紅細(xì)胞、某些免疫球蛋白、病毒、真菌、細(xì)菌、動(dòng)物腫瘤細(xì)胞、寄生蟲(chóng)和受損細(xì)胞。這些活化因子所共有的唯一特征是糖類(lèi)的存在，但是糖類(lèi)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性使得難以確定共享的分子決定子，這是被承認(rèn)的。廣泛接受的是替代途徑活化通過(guò)此途徑的抑制性調(diào)節(jié)成分之間的精細(xì)平衡控制，例如H因子、I因子、DAF、CRl和備解素，其是替代途徑僅有的陽(yáng)性調(diào)節(jié)因子。參見(jiàn)Schwaeble ff.J.和Reid K.B., Immunol Today20(1):17-21 (1999))。
[0022]除了上文所述的明顯的未調(diào)節(jié)的活化機(jī)制，替代途徑還可以為凝集素/經(jīng)典途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C4b2a)提供強(qiáng)力的放大環(huán)，因?yàn)槿魏紊傻腃3b都可以與B因子參與形成額外的替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶(C3bBb)。替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶通過(guò)結(jié)合備解素被穩(wěn)定化。備解素使替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶的半衰期延長(zhǎng)六到十倍。向替代途徑C3轉(zhuǎn)化酶添加C3b導(dǎo)致替代途徑C5轉(zhuǎn)化酶的形成。
[0023] 一直以來(lái)認(rèn)為所有三種途徑(即經(jīng)典、凝集素和替代途徑)會(huì)合于C5，它被切割形成具有多種促炎作用的產(chǎn)物。會(huì)合后的途徑被稱(chēng)為末端補(bǔ)體途徑。C5a是最有效的過(guò)敏毒素，引起平滑肌和血管緊張度以及血管通透性的改變。它也是嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞兩者的強(qiáng)有力的趨化因子和活化因子。C5a介導(dǎo)的細(xì)胞活化能夠通過(guò)誘導(dǎo)釋放多種另外的炎癥介質(zhì)來(lái)顯著放大炎癥反應(yīng)，另外的炎癥介質(zhì)包括細(xì)胞因子、水解酶、花生四烯酸代謝物和活性氧類(lèi)別。C5裂解導(dǎo)致了 C5b-9的形成，它也被稱(chēng)為膜攻擊復(fù)合物(MAC)。目前強(qiáng)有力的證據(jù)表明，亞裂解的MAC沉積除了起裂解成孔復(fù)合物的作用外，還可能還在炎癥中發(fā)揮重要作用。
[0024]除了其在免疫防御中的重要作用，補(bǔ)體系統(tǒng)在很多臨床狀況中導(dǎo)致組織損傷。因此，對(duì)開(kāi)發(fā)治療有效的補(bǔ)體抑制劑以防止這些不良效果存在緊迫的需要。
[0025]發(fā)明概述
提供本概述，從而以簡(jiǎn)化形式引入概念的選擇，其在以下發(fā)明詳述中進(jìn)一步描述。本概述既不欲鑒定請(qǐng)求保護(hù)的主題的關(guān)鍵特征，也不欲用于協(xié)助確定請(qǐng)求保護(hù)的主題的范圍。[0026]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合人MASP-2，包括(i)包括CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3序列的重鏈可變區(qū)；和(11)包括CDR-Ll、⑶R-L2和⑶R-L3的輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)⑶R-H3序列包括描述為SEQ ID NO: 38或SEQ ID N0:90的氨基酸序列，和其保守序列修飾，其中輕鏈可變區(qū)⑶R-L3序列包括描述為SEQ ID N0:51或SEQ ID N0:94的氨基酸序列，和其保守序列修飾，并且其中所述分離的抗體抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化。
[0027]在另一方面，本發(fā)明提供結(jié)合人MASP-2的人抗體，其中所述抗體包括:I) a)重鏈可變區(qū)，其包括i)包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列31-35的重鏈⑶R-Hl ;和ii)包括SEQID N0:21的氨基酸序列50-65的重鏈CDR-H2 ;和iii)包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列95-102的重鏈CDR-H3 ;和b)輕鏈可變區(qū)，其包括i)包括SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的氨基酸序列24-34的輕鏈CDR-Ll ;和ii)包括SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的氨基酸序列50-56的輕鏈CDR-L2 ;和iii)包括SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的氨基酸序列89-97的輕鏈CDR-L3 ;或II)與所述可變結(jié)構(gòu)域在其它方面相同的其變體，除了在所述重鏈可變區(qū)的所述CDR區(qū)內(nèi)至多組合的總共10個(gè)氨基酸取代和在所述輕鏈可變區(qū)的所述CDR區(qū)內(nèi)至多組合的總共10個(gè)氨基酸取代，其中所述抗體或其變體抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化。
[0028]在另一方面，本發(fā)明提供結(jié)合人MASP-2的分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體包括:I)a)重鏈可變區(qū)，其包括i)包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列31-35的重鏈CDR-Hl ;和ii)包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列50-65的重鏈CDR-H2 ;和iii)包括SEQ ID N0:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列95-102的重鏈CDR-H3 ;和b)輕鏈可變區(qū)，其包括i)包括SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列24-34的輕鏈CDR-Ll ;和ii)包括SEQ ID N0:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列50-56的輕鏈CDR-L2 ;和iii)包括SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列89-97的輕鏈CDR-L3 ;或II)與所述可變結(jié)構(gòu)域在其它方面相同 的其變體，除了在所述重鏈的所述CDR區(qū)內(nèi)至多組合的總共10個(gè)氨基酸取代和在所述輕鏈可變區(qū)的所述CDR區(qū)內(nèi)至多組合的總共10個(gè)氨基酸取代，其中所述抗體或其變體抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化。
[0029]在另一方面，本發(fā)明提供結(jié)合人MASP-2的分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 18, SEQ ID N0:20或SEQ ID N0:21中描述的任一氨基酸序列。
[0030]在另一方面，本發(fā)明提供結(jié)合人MASP-2的分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO:27中描述的任一氨基酸序列。
[0031]在另一方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的抗MASP-2抗體或其片段的氨基酸序列的核酸分子，例如表2中描述的那些。
[0032]在另一方面，本發(fā)明提供至少包括編碼本發(fā)明的抗MASP-2抗體或其片段的氨基酸序列的核酸分子，例如表2中描述的那些的核酸分子之一的細(xì)胞。
[0033]在另一方面，本發(fā)明提供了生成分離的MASP-2抗體的方法，包括在允許編碼本發(fā)明的抗MASP-2抗體的核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)至少包括編碼本發(fā)明的抗MASP-2抗體的氨基酸序列的核酸分子之一細(xì)胞，和分離所述抗MASP-2抗體。[0034]在另一方面，本發(fā)明提供分離的全人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其以如通過(guò)表面等離子體共振確定的IOnM或更低的Kd從人MASP-2解離，并在甘露聚糖包被的基質(zhì)上在1%血清中以IOnM或更低的IC5tl抑制C4活化。在一些實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異性識(shí)別至少部分的由參照抗體所識(shí)別的表位，其中所述參照抗體包括如在SEQID NO:20中描述的重鏈可變區(qū)和如在SEQ ID NO:24中描述的輕鏈可變區(qū)。
[0035]在另一方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的全人單克隆抗MASP-2抗體和藥學(xué)可接受的賦形劑的組合物。
[0036]在另一方面，本發(fā)明提供在人受試者中抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化的方法，包括以在所述人受試者中足夠抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化的量施用本發(fā)明的人單克隆抗體。
[0037]在另一方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的人單克隆MASP-2抗體的單位劑量的制品，適合用于對(duì)人受試者的治療施用，其中所述單位劑量是Img-1OOOmg的范圍。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0038]通過(guò)參考下面的詳細(xì)描述連同附圖，本發(fā)明前述的方面以及許多附帶的優(yōu)點(diǎn)將更容易領(lǐng)會(huì)，同樣也更好理解，其中:
圖1A是圖解闡釋人MASP-2基因組結(jié)構(gòu)的圖；
圖1B是圖解闡釋人MASP-2蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的圖；
圖2圖解闡釋如實(shí)施例2所述的在多克隆群體上進(jìn)行的ELISA測(cè)定的結(jié)果，所述多克隆群體選自針對(duì)各種MASP-2抗原淘選(panned)的scFcv曬菌體文庫(kù)； 圖3A和3B顯示如實(shí)施例3中所述的在補(bǔ)體測(cè)定中針對(duì)功能活性的45個(gè)候選scFv克隆的測(cè)試結(jié)果；
圖4圖解闡釋如實(shí)施例4所述進(jìn)行以比較三種血清(人、大鼠和NHP)中C3c水平的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；
圖5A是如實(shí)施例4所述的揭示分別屬于VH2和VH6基因家族的兩個(gè)不同組的最有活性的克隆的重鏈區(qū)(殘基1-120)的氨基酸序列比對(duì)；
圖5B是如實(shí)施例4所述的scFv克隆17D20、17N16、18L16和4D9的氨基酸序列比對(duì)；圖6圖解闡釋如實(shí)施例5中所述的使用90%人血漿的C3b沉積測(cè)定中IgG4轉(zhuǎn)化的母克隆(mother clone)的制備物的抑制活性。
圖7A圖解闡釋如實(shí)施例6所述的17N16母克隆相對(duì)子克隆(daughter clone)對(duì)人MASP-2A滴定的ELISA測(cè)定的結(jié)果；
圖7B圖解闡釋如實(shí)施例6所述的17D20母克隆相對(duì)子克隆對(duì)人MASP-2A滴定的ELISA測(cè)定的結(jié)果；
圖8是如實(shí)施例6中所述的母克隆17N16和17N9子克隆的蛋白序列比對(duì)，顯示輕鏈(從SYE起始)在兩克隆之間具有17個(gè)氨基酸殘基的不同；
圖9是如實(shí)施例7中所述的來(lái)自相比17D20母克隆的突變的克隆#35、#59和#90的序列的⑶R-H3區(qū)的蛋白序列比對(duì)；
圖1OA是如實(shí)施例7在所述的17D20母克隆的CDR3區(qū)與鏈重排克隆17D20md21Nll和組合17D20md21Nll的VL的圖9中顯示的突變克隆#35CDR_H3克隆(VH35-VL21N11)的蛋白序列比對(duì)；圖1OB是如實(shí)施例7中所述的17D20母克隆和子克隆17D20md21Nll的VL和VH區(qū)的蛋白序列比對(duì)；
圖1lA圖解闡釋如實(shí)施例8中所述的對(duì)衍生自人抗MASP-2單克隆抗體母克隆17N16的子克隆同種型變體(MoAb#l-3)進(jìn)行的C3b沉積測(cè)定的結(jié)果；
圖1lB圖解闡釋如實(shí)施例8中所述的對(duì)衍生自人抗MASP-2單克隆抗體母克隆17D20的子克隆同種型變體(MoAb#4-6)進(jìn)行的C3b沉積測(cè)定的結(jié)果；
圖12A和12B圖解闡釋如實(shí)施例8中所述的在C3b沉積測(cè)定中在95%血清中的母克隆和MoAb#l-6的測(cè)試；
圖13圖解闡釋如實(shí)施例8中所述在95%正常人血清中C4b沉積的抑制；
圖14圖解闡釋如實(shí)施例8中所述在95%非洲綠猴血清中C3b沉積的抑制；
圖15圖解闡釋如實(shí)施例8中所述通過(guò)MoAb#2-6的預(yù)組裝的MBL-MASP-2復(fù)合物的C4切割活性的抑制；
圖16圖解闡釋如實(shí)施例8中所述MoAb#6相比Cls對(duì)人MASP-2的優(yōu)先結(jié)合；
圖17圖解闡釋如實(shí)施例10中所述的在向非洲綠猴靜脈內(nèi)施用抗人MoAb#0MS646后凝集素途徑被完全抑制；
圖18A是卡普蘭一邁耶存活曲線(xiàn)(Kaplan-Meier survival plot ),顯示如實(shí)施例11中所述在對(duì)照小鼠和用抗鼠MASP-2抗體(11^匕1111)或抗人嫩5?-2抗體(mAbOMS646)處理的小鼠中暴露于7.0Gy福射后隨時(shí)間的百分比存活；
圖18B是卡普蘭一邁耶存 活曲線(xiàn)，顯示如實(shí)施例11中所述在對(duì)照小鼠和用抗鼠MASP-2抗體(mAbMlI)或抗人MASP-2抗體(mAbOMS646)處理的小鼠中暴露于6.5Gy輻射后隨時(shí)間的百分比存活；
圖18C是卡普蘭一邁耶存活曲線(xiàn)，顯示如實(shí)施例11中所述在對(duì)照小鼠和用抗人MASP-2抗體(mAbOMS646)處理的小鼠中暴露于8.0Gy輻射后隨時(shí)間的百分比存活；
圖19圖解闡釋如實(shí)施例12中所述在抗MASP-2抗體0MS646(應(yīng)答單位(結(jié)合)相對(duì)時(shí)間(以秒計(jì)))上表面等離子共振(Biacore)分析的結(jié)果，顯示固定化的0MS646以約llxK^S—1的Ktjff率和約1.6-3x1 OVS^1的Km率結(jié)合重組MASP-2 ；
圖20圖解闡釋如實(shí)施例12中所述的確定抗MASP-2抗體0MS646對(duì)固定化的人MASP-2的結(jié)合親和力的ELISA測(cè)定的結(jié)果，顯示0MS646以約IOOpM的Kd結(jié)合固定化重組人MASP-2 ；
圖21A圖解闡釋如實(shí)施例12中所述的在甘露聚糖包被的表面上在存在或不存在抗MASP-2抗體(0MS646)的情況下C4活化水平，證明0MS646在甘露聚糖包被的表面上在1%人血清中以約0.5nM的IC5tl抑制C4活化；
圖21B圖解闡釋如實(shí)施例12中所述在IgG包被的表面上在存在或不存在抗MASP-2抗體(0MS646)的情況下C4活化水平，顯示0MS646不抑制經(jīng)典途徑依賴(lài)的補(bǔ)體成分C4的活化；
圖22A圖解闡釋如實(shí)施例12中所述在凝集素途徑特異性測(cè)定條件下，在存在或不存在抗MASP-2抗體(0MS646)的情況下MAC沉積的水平，證明0MS646以約InM的IC5tl值抑制凝集素介導(dǎo)的MAC沉積；
圖22B圖解闡釋如實(shí)施例12中所述在經(jīng)典途徑特異性測(cè)定條件下，在存在或不存在抗MASP-2抗體(0MS646)的情況下MAC沉積的水平，證明0MS646不抑制經(jīng)典途徑介導(dǎo)的MAC沉積；
圖22C圖解闡釋如實(shí)施例12中所述在替代途徑特異性測(cè)定條件下，在存在或不存在抗MASP-2抗體(0MS646)的情況下MAC沉積的水平，證明0MS646不抑制替代途徑介導(dǎo)的MAC沉積；
圖23A圖解闡釋如實(shí)施例12中所述在凝集素途徑特異性條件下，在存在或不存在一系列濃度的抗MASP-2抗體(0MS646)的情況下在90%人血清中C3沉積的水平，證明0MS646在生理?xiàng)l件下阻斷C3沉積；
圖23B圖解闡釋如實(shí)施例12中所述在凝集素途徑特異性條件下，在存在或不存在一系列濃度的抗MASP-2抗體(0MS646)的情況下在90%人血清中C4沉積的水平，證明0MS646在生理?xiàng)l件下阻斷C4沉積；
圖24A圖解闡釋如實(shí)施例12中所述在凝集素途徑特異性條件下，在存在或不存在抗MASP-2抗體(0MS646)的情況下在90%Cynomuglus猴血清中C4沉積的水平,證明0MS646在Cynomuglus猴血清中以劑量反應(yīng)性方式抑制C4沉積，具有30_50nM范圍的IC5tl值；和圖24B圖解闡釋如實(shí)施例12中所述在凝集素途徑特異性條件下，在存在或不存在抗MASP-2抗體(0MS646)的情況下在90%非洲綠猴血清中C4沉積的水平，證明0MS646在非洲綠猴血清中以劑量反應(yīng)性方式抑制C4沉積，具有15-30nM范圍的IC5tl值。
[0039]序列表的說(shuō)明
SEQ ID NO:1 人 MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:2 人 MASP-2 蛋白(具有前導(dǎo)肽(leader))
SEQ ID NO: 3人MASP-2蛋白(成`熟的)
SEQ ID NO:4 大鼠 MASP-2 cDNA
SEQ ID NO:5大鼠MASP-2蛋白(具有前導(dǎo)肽(leader))
SEQ ID NO:6大鼠MASP-2蛋白(成熟的)
抗原(關(guān)于人MASP-2成熟蛋白)
SEQ ID NO: 7 人 MASP-2 的 CUBI 結(jié)構(gòu)域(氨基酸 1-121)
SEQ ID NO:8 人 MASP-2 的 CUBI/EGF 結(jié)構(gòu)域(氨基酸 1-166)
SEQ ID NO:9 人 MASP-2 的 CUBI/EGF/CUB`II 結(jié)構(gòu)域(氨基酸 1-277)
SEQ ID NO: 10 人 MASP-2 的 EGF 結(jié)構(gòu)域(氨基酸 122-166)
SEQ ID NO: 11 人 MASP-2 的 CCPI/CCP11/SP 結(jié)構(gòu)域(氨基酸 278-671)
SEQ ID NO: 12 人 MASP-2 的 CCPI/CCP11 結(jié)構(gòu)域(氨基酸 278-429)
SEQ ID NO: 13 人 MASP-2 的 CCPI 結(jié)構(gòu)域(氨基酸 278-347)
SEQ ID NO: 14 人 MASP-2 的 CCPII/SP 結(jié)構(gòu)域(氨基酸 348-671)
SEQ ID NO: 15 人 MASP-2 的 CCPII 結(jié)構(gòu)域(氨基酸 348-429)
SEQ ID NO: 16 人 MASP-2 的 SP 結(jié)構(gòu)域(氨基酸 429-671)
SEQ ID NO: 17:絲氨酸蛋白酶失活的突變體(具有突變的Ser618的氨基酸610-625)
抗MASP-2單克隆抗體VH鏈
SEQ ID NO: 18 17D20mc重鏈可變區(qū)(VH)多肽
SEQ ID NO: 19 編碼 17D20_dc35VH21NllVL (0MS646)重鏈可變區(qū)(VH)的 DNA(無(wú)信號(hào)肽)SEQ ID NO:20 17D20_dc35VH21NllVL (0MS646)重鏈可變區(qū)(VH)多肽
SEQ ID NO:21 17N16mc重鏈可變區(qū)(VH)多肽
抗MASP-2單克隆抗體VL鏈
SEQ ID NO:22 17D20mc輕鏈可變區(qū)(VL)多肽
SEQ ID NO:23 編碼 17D20_dc21NllVL (0MS644)輕鏈可變區(qū)(VL)的 DNA(無(wú)信號(hào)肽)SEQ ID NO:24 17D20_dc21NllVL (0MS644)輕鏈可變區(qū)(VL)多肽SEQ ID NO:25 17D16mc輕鏈可變區(qū)(VL)多肽
SEQ ID NO:26 編碼 17N16_dcl7N9 (0MS641)輕鏈可變區(qū)(VL)的 DNA(無(wú)信號(hào)肽)
SEQ ID NO:27 17N16_dcl7N9 (0MS641)輕鏈可變區(qū)(VL)多肽
抗MASP-2單克隆抗體重鏈CDR
SEQ ID NOS:28-3I CDR-Hl
SEQ ID NOS:32-35 CDR-H2
SEQ ID NOS:36-40 CDR-H3
抗MASP-2單克隆抗體輕鏈CDR
SEQ ID NOS:41-45 CDR-Ll
SEQ ID NOS:46-50 CDR-L2
SEQ ID NOS:51-54 CDR-L3
MASP-2抗體序列
SEQ ID NO:55: scFv母克隆17D20全長(zhǎng)多肽
SEQ ID NO:56: scFv母克隆18L16全長(zhǎng)多肽
SEQ ID NO:57: scFv母克隆4D9全長(zhǎng)多肽
SEQ ID NO:58: scFv母克隆17L20全長(zhǎng)多肽
SEQ ID NO:59: scFv母克隆17N16全長(zhǎng)多肽
SEQ ID NO:60: scFv母克隆3F22全長(zhǎng)多肽
SEQ ID NO:61: scFv母克隆9P13全長(zhǎng)多肽
SEQ ID NO:62:編碼野生型IgG4重鏈恒定區(qū)的DNA
SEQ ID NO:63:野生型IgG4重鏈恒定區(qū)多肽
SEQ ID NO:64:編碼具有突變S228P的IgG4重鏈恒定區(qū)的DNA
SEQ ID NO:65:具有突變S228P的IgG4重鏈恒定區(qū)多肽
SEQ ID NO:66: scFv 子克隆 17N16m_dl7N9 全長(zhǎng)多肽
SEQ ID NO:67: scFv 子克隆 17D20m_d21Nll 全長(zhǎng)多肽
SEQ ID NO:68: scFv 子克隆 17D20m_d3521Nll 全長(zhǎng)多肽
SEQ ID NO:69:編碼野生型IgG2重鏈恒定區(qū)的DNA
SEQ ID NO:70:野生型IgG2重鏈恒定區(qū)多肽
SEQ ID N0:71:17N16m_dl7N9輕鏈基因序列(具有由核苷酸1-57編碼的信號(hào)肽)
SEQ ID N0:72:17N16m_dl7N9輕鏈蛋白序列(具有信號(hào)肽氨基酸1-19)
SEQ ID N0:73:17N16m_dl7N9 IgG2重鏈基因序列(具有由核苷酸1-57編碼的信號(hào)肽)SEQ ID N0:74:17N16m_dl7N9 IgG2重鏈蛋白序列(具有信號(hào)肽氨基酸1-19)SEQ ID N0:75:17N16m_dl7N9 IgG4重鏈基因序列(具有由核苷酸1-57編碼的信號(hào)肽) SEQ ID N0:76:17N16m_dl7N9 IgG4重鏈蛋白序列(具有信號(hào)肽氨基酸1-19)
SEQ ID N0:77:17N16m_dl7N9 IgG4突變的重鏈基因序列(具有由核苷酸1-57編碼的信號(hào)肽)
SEQ ID N0:78:17N16m_dl7N9 IgG4突變的重鏈蛋白序列(具有信號(hào)肽氨基酸1-19) SEQ ID N0:79:17D20_3521N11輕鏈基因序列(具有由核苷酸1_57編碼的信號(hào)肽) SEQ ID N0:80:17D20_3521N11輕鏈蛋白序列(具有信號(hào)肽氨基酸1-19)
SEQ ID N0:81:17D20_3521N11 IgG2重鏈基因序列(具有由核苷酸1-57編碼的信號(hào)
肽)
SEQ ID N0:82:17D20_3521N11 IgG2重鏈蛋白序列(具有信號(hào)肽氨基酸1_19)
SEQ ID N0:83:17D20_3521N11 IgG4重鏈基因序列(具有由核苷酸1_57編碼的信號(hào)
肽)
SEQ ID N0:84:17D20_3521N11 IgG4重鏈蛋白序列(具有信號(hào)肽氨基酸1_19)
SEQ ID N0:85:17D20_3521N11 IgG4突變的重鏈基因序列(具有由核苷酸1_57編碼的信號(hào)肽)
SEQ ID N0:86:17D20_3521N11 IgG4突變的重鏈蛋白序列(具有信號(hào)肽氨基酸1_19) SEQ ID NO:87: scFv`子克隆17N16m_dl7N9編碼全長(zhǎng)多肽的DNA (無(wú)信號(hào)肽)
SEQ ID NO:88: scFv子克隆17D20m_d21Nll編碼全長(zhǎng)多肽的DNA (無(wú)信號(hào)肽)
SEQ ID NO:89: scFv子克隆17D20m_d3521Nll編碼全長(zhǎng)多肽的DNA (無(wú)信號(hào)肽)
SEQ ID N0:90:17D20m 和 d3521Nll 的共有重鏈 CDR-H3
SEQ ID N0:91:17D20m 和 d3521Nll 的共有輕鏈 CDR-Ll
SEQ ID N0:92:17N16m 和 dl7N9 的共有輕鏈 CDR-Ll
SEQ ID N0:93:17D20m、d3521Nll、17N16m 和 dl7N9 的共有輕鏈 CDR-L2
SEQ ID N0:94:17N16m 和 dl7N9 的共有輕鏈 CDR-L3。
[0040]發(fā)明詳述
本發(fā)明提供結(jié)合人MASP-2并抑制凝集素介導(dǎo)的補(bǔ)體活化而同時(shí)保持免疫系統(tǒng)經(jīng)典(Clq依賴(lài)的)途徑成分的完整的全長(zhǎng)人抗體。人抗MASP-2抗體已通過(guò)噬菌體展示文庫(kù)篩選被鑒定，如實(shí)施例2-9中所述。如實(shí)施例10-12中所述，已鑒定高親和力MASP-2抗體具有抑制凝集素介導(dǎo)的補(bǔ)體活化的能力，如體外測(cè)定和體內(nèi)測(cè)定所證明。所述抗體的可變輕和重鏈片段已經(jīng)以scFv格式和全長(zhǎng)IgG格式兩者分離。人抗MASP-2抗體可用于抑制凝集素介導(dǎo)的補(bǔ)體途徑活化相關(guān)的細(xì)胞損傷，而同時(shí)保持免疫系統(tǒng)經(jīng)典(Clq依賴(lài)的)途徑成分的完整。
[0041]1.定義
除非本文明確規(guī)定，否則本文使用的所有術(shù)語(yǔ)都具有如本發(fā)明領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的相同含義。為了明確用于本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中描述本發(fā)明的有關(guān)術(shù)語(yǔ)，提供下列定義。
[0042]本文所用術(shù)語(yǔ)“MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化”包括凝集素途徑的MASP-2依賴(lài)的活化，其在生理?xiàng)l件下發(fā)生(即，在存在Ca++的情況下)，導(dǎo)致凝集素途徑C3轉(zhuǎn)化酶C4b2a的形成，并且在C3切割產(chǎn)物C3b的積累后導(dǎo)致C5轉(zhuǎn)化酶C42a (C3b) n。[0043]如本文所用術(shù)語(yǔ)“替代途徑”是指例如由酵母聚糖觸發(fā)的補(bǔ)體活化，所述酵母聚糖來(lái)自真菌和酵母細(xì)胞壁、革蘭氏陰性外膜的脂多糖(LPS)和兔紅細(xì)胞以及來(lái)自多種純的多糖、兔紅細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、動(dòng)物腫瘤細(xì)胞、寄生蟲(chóng)和受損細(xì)胞，并且其在傳統(tǒng)上一直被認(rèn)為是由來(lái)自補(bǔ)體因子C3自發(fā)蛋白水解生成的C3b而引起的。
[0044]如本文所用術(shù)語(yǔ)“凝集素途徑”是指經(jīng)由血清和非血清糖結(jié)合蛋白(包括甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)、CL-1l和纖維膠凝蛋白(H-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白或L-纖維膠凝蛋白))的特異性結(jié)合而發(fā)生的補(bǔ)體活化。
[0045]如本文所用術(shù)語(yǔ)“經(jīng)典途徑”是指由抗體與外源顆粒結(jié)合而觸發(fā)的并且需要結(jié)合識(shí)別分子Clq的補(bǔ)體活化。
[0046]如本文所用術(shù)語(yǔ)“MASP-2抑制性抗體”指任何抗MASP-2抗體或其MASP-2結(jié)合片段，其結(jié)合或直接與MASP-2相互作用并有效地抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化。用于本發(fā)明方法的MASP-2抑制性抗體可降低MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化大于20%，例如大于30%，或大于40%，或大于50%，或大于60%，或大于70%，或大于80%，或大于90%，或大于95%。[0047]如本文所用術(shù)語(yǔ)“MASP-2阻斷抗體”指MASP-2抑制性抗體，其降低MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化大于90%，例如大于95%或大于98%(即導(dǎo)致僅10%的MASP-2補(bǔ)體活化，例如僅9%，或僅8%，或僅7%，或僅6%，例如僅5%或更少，或僅4%，或僅4%，或僅3%，或僅2%或僅1%)。
[0048]術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”在本文中互換使用。這些術(shù)語(yǔ)是本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解的，并且指由一種或多種特異性結(jié)合抗原的多肽組成的蛋白。一種抗體形式構(gòu)成抗體的基本結(jié)構(gòu)單元。此形式是四聚體并由兩對(duì)相同的抗體鏈組成，每對(duì)具有一條輕和一條重鏈。每對(duì)中輕和重鏈可變區(qū)一起負(fù)責(zé)結(jié)合抗原，并且恒定區(qū)負(fù)責(zé)抗體效應(yīng)物功能。
[0049]如本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體”包括衍生自產(chǎn)生抗體的任何哺乳動(dòng)物(如小鼠、大鼠、兔和包括人在內(nèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)，或衍生自雜交瘤、噬菌體篩選、重組表達(dá)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(或其它產(chǎn)生抗體或抗體片段的方法)的抗體及其抗體片段，其與MASP-2多肽或其部分特異性結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“抗體”在抗體來(lái)源或其制造的方式(例如，通過(guò)雜交瘤、噬菌體篩選、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、肽合成等)方面意圖不是受限制的。示例性抗體包括多克隆、單克隆和重組抗體；多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)；人源化抗體；鼠抗體；嵌合鼠人、鼠靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物人單克隆抗體；和抗獨(dú)特型抗體，并且可以是任何完整分子或其片段。如本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體”包括不僅完整多克隆或單克隆抗體，還有其片段(例如dAb、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)，單鏈(scFv)，其合成變體，天然發(fā)生的變體，包括具有所需特異性的抗原結(jié)合片段的抗體部分的融合蛋白，人源化抗體，嵌合抗體和任何其它包括具有所需特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)或片段(表位識(shí)別位點(diǎn))的免疫球蛋白分子的修飾的構(gòu)型。
[0050]如本文所用術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合片段”指包含至少一個(gè)結(jié)合人MASP-2的免疫球蛋白重和/或輕鏈的CDR的多肽片段。就此而言，本文所述抗體的抗原結(jié)合片段可以包括來(lái)自結(jié)合MASP-2的抗體的本文描述的VH和VL序列的1、2、3、4、5或所有6個(gè)CDR。本文所述MASP-2特異性抗體的抗原結(jié)合片段能夠結(jié)合MASP-2。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合片段或包括抗原結(jié)合片段的抗體介導(dǎo)MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化的抑制。
[0051]如本文所用術(shù)語(yǔ)“抗MASP-2單克隆抗體”指同源抗體群，其中所述單克隆抗體由在選擇結(jié)合MASP-2上的表位中涉及的氨基酸組成。抗MASP-2單克隆抗體是對(duì)MASP-2靶抗原高度特異性的。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”不僅包括完整的單克隆抗體和全長(zhǎng)單克隆抗體，還有其片段(例如Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v)，單鏈(scFv)，其變體，包括抗原結(jié)合部分的融合蛋白，人源化單克隆抗體，嵌合單克隆抗體和任何其它包括具有所需特異性和結(jié)合表位的能力的抗原結(jié)合片段(表位識(shí)別位點(diǎn))的免疫球蛋白分子的修飾的構(gòu)型。
[0052]如本文所用，所述修飾詞“單克隆的”指示從基本上同源的抗體群獲得的抗體的特征，并且不意圖在抗體來(lái)源或其制造方式(例如通過(guò)雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等)方面受限制。該術(shù)語(yǔ)包括在上面的“抗體”定義下描述的整個(gè)免疫球蛋白，以及片段等。單克隆抗體可以使用任何技術(shù)獲得，所述技術(shù)提供用于通過(guò)培養(yǎng)基中的連續(xù)細(xì)胞系，例如Kohler, G.，等，Nature 256.Α張1975描述的雜交瘤法產(chǎn)生抗體分子，或者它們可以通過(guò)重組DNA法制造(參見(jiàn)，例如授予Cabilly的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567)。單克隆抗體還可以使用 Clackson, Τ.,等，Nature 624-628, 1991, and Marks, J.D.,等，JMol.Biol.^:581-597, 1991中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)分離。這些抗體可以是任何免疫球蛋白類(lèi)型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和任何其亞類(lèi)。
[0053]識(shí)別的免疫球蛋白多肽包括K和λ輕鏈，和a、y (IgGU IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ重鏈或其它物種中的等價(jià)物。全長(zhǎng)免疫球蛋白“輕鏈”(約25kDa或約214個(gè)氨基酸)包括在NH2末端約110個(gè)氨基酸的可變區(qū)和在COOH末端的K或λ恒定區(qū)。全長(zhǎng)免疫球蛋白“重鏈”(約50kDa或約446個(gè)氨基酸)類(lèi)似地包括可變區(qū)(約116個(gè)氨基酸)和上述重鏈恒定區(qū)之一，例如Y (約330個(gè)氨基酸)。
[0054]基本的四鏈抗體單元是異源四聚體糖蛋白，由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成。IgM抗體由5個(gè)基本異源四聚體單元和額外的多肽稱(chēng)為J鏈組成，并且從而包含10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。分泌的IgA抗體可以聚合形成多價(jià)集聚,包括2-5個(gè)基本4鏈單元連同J鏈。每個(gè)L鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵連接H鏈，而兩條H鏈通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二硫鍵連接彼此，取決于H鏈同種型。每條H和L鏈還具有規(guī)律間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。VH和VL的配對(duì)一起形成單個(gè)抗原 結(jié)合位點(diǎn)。
[0055]每條H鏈在N末端具有可變結(jié)構(gòu)域(VH)，然后對(duì)于每條α和Y鏈?zhǔn)侨齻€(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH)，對(duì)于μ和ε同種型則是四個(gè)CH結(jié)構(gòu)域(CH)。
[0056]每條L鏈在N末端具有可變結(jié)構(gòu)域(VL)，隨后在其另一端是恒定結(jié)構(gòu)域(CL)。VL與VH對(duì)齊，并且CL與重鏈的第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CHl)對(duì)齊。基于其恒定結(jié)構(gòu)域(CL)的氨基酸序列，來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的L鏈可以分配到兩個(gè)截然不同的類(lèi)型之一，稱(chēng)為卡帕(K )和拉姆達(dá)(λ )。
[0057]取決于它們重鏈(CH)的恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配到不同類(lèi)型或同種型。有5種類(lèi)型的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM具有分別稱(chēng)為阿爾法
(0)、德?tīng)査?6)、艾普斯龍(ε)、伽馬(Y)和謬(μ)的重鏈?；贑H序列中微小的差異和功能，Y和α類(lèi)型進(jìn)一步分成亞類(lèi)，例如人表達(dá)下列亞類(lèi)=IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2。
[0058]對(duì)于不同類(lèi)型的抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，參見(jiàn)，例如Basic and ClinicalImmunology, 8th Edition, Daniel P.Stites, Abba 1.Terr 和 Tristram G.Parslow編輯.Appleton and Lange, Norwalk, Conn., 1994,第 71 頁(yè)和第 6 章。
[0059]術(shù)語(yǔ)“可變”指某些V結(jié)構(gòu)域的區(qū)段在序列方面在抗體間變化很大的事實(shí)。V結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合并限定特定抗體對(duì)其特定抗原的特異性。但是，可變性在可變結(jié)構(gòu)域的110個(gè)氨基酸跨度中不是平均分布的。更確切地說(shuō)，V區(qū)由被極度可變性的更短的區(qū)稱(chēng)為“高變區(qū)”(每個(gè)長(zhǎng)度9-12個(gè)氨基酸)隔開(kāi)的15-30個(gè)氨基酸的相對(duì)不變段稱(chēng)為框架區(qū)(FR)組成。天然重和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域每個(gè)包括四個(gè)FR，大部分采取β-折疊構(gòu)象，通過(guò)三個(gè)高變區(qū)連接，其形成環(huán)連接，并且在一些情況下形成部分η-折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈的高變區(qū)通過(guò)FR緊密接近保持在一起，并且與來(lái)自其它鏈的高變區(qū)促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見(jiàn) Kabat,等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991))。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是展示各種效應(yīng)物功能，例如抗體在抗體依賴(lài)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)中的參與。
[0060]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體氨基酸殘基。高變區(qū)通常包括來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(B卩，當(dāng)根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)時(shí)，來(lái)自輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中殘基大約24-34 (LI),50-56 (L2)和89-97 (L3)，和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中大約 31-35 (HO,50-65 (H2)和 95-102 (H3)，所述編號(hào)系統(tǒng)如在 Kabat,等，Sequencesof Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md (1991))中描述)；和/或那些來(lái)自“高變環(huán)”的殘基(即，當(dāng)根據(jù)Chothia編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)時(shí)，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中殘基24-34 (LI),50-56(L2)和 89-97 (L3)，和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中 26-32 (HI),52-56 (H2)和 95-101 (H3)，所述編號(hào)系統(tǒng)如在 Chothia 和 Lesk, J.MoL Biol.7^:901-917 (1987)中描述)；和 / 或那些來(lái)自“高變環(huán)”/⑶R的殘基(例如，當(dāng)根據(jù)MGT編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)時(shí)，VL中殘基27-38(LI),56-65 (L2)和 105-120 (L3)，和 VH 中 27-38 (HI),56-65 (H2)和 105-120 (H3)，所述編號(hào)系統(tǒng)如在 Lefranc, J.P.,等，Nucleic Acids Res 209-212; Ruiz, M.,等，Nucleic Acids Res 忽:219-221 (2000)中描述)。
[0061]如本文所用術(shù)語(yǔ)“抗體片段”指衍生自或涉及全長(zhǎng)抗MASP-2抗體的部分，通常包括其抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的闡釋性的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab) 2、F(ab’)2和Fv片段，scFv片段,雙抗體(diabodies),線(xiàn)性抗體,單鏈抗體分子,抗體片段形成的雙特異性抗體和多特異性抗體。
[0062]當(dāng)使用雙特異性抗體時(shí)，這些可以是常規(guī)的雙特異性抗體，其可以各種方法制造(Holliger, P.和 Winter G.Current Opinion Biotechnol.4, 446-449 (1993)),例如化學(xué)制備或來(lái)自雜交瘤，或可以是任何上文提及的雙特異性抗體片段。
[0063]如本文所用“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包括抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域以單條多肽鏈存在。通常，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包括在VH和VL結(jié)構(gòu)域間的多肽接頭，其使得scFv能夠形成所希望的結(jié)構(gòu)用于抗體結(jié)合。參見(jiàn)Pluckthun在Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, NewYork, pp.269-315 (1994)中?！癋v”是包含完整的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此片段由一條重和一條輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域以緊密的非共價(jià)連接的二聚體組成。從這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊發(fā)出六個(gè)高變環(huán)(分別來(lái)自H和L鏈的三個(gè)環(huán))，其貢獻(xiàn)用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基，并賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。但是，雖然比整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的親和力更低，但是即使單可變結(jié)構(gòu)域(或僅包括對(duì)抗原特異性的3個(gè)CDR的Fv的一半)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力。[0064]如本文所用術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”指抗體優(yōu)先結(jié)合存在于不同分析物的均勻混合物中的特定分析物的能力。在某些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合相互作用將辨別樣品中所希望的和不希望的分析物，在一些實(shí)施方案中，多于10-100倍或更多(例如多于1000或10000倍)。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)它們特異性結(jié)合在捕獲劑/分析物復(fù)合物中時(shí)，捕獲劑和分析物之間的親和力表征為少于約ΙΟΟηΜ，或少于約50nM，或少于約25nM，或少于約ΙΟηΜ，或少于約5nM，或少于約InM的Kd (解離常數(shù))。
[0065]如本文所用術(shù)語(yǔ)“變體”抗MASP-2抗體指通過(guò)在親本抗體序列中添加、缺失和/或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基使其在氨基酸序列方面與“親本”或參照抗體氨基酸序列不同的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，變體抗MASP-2抗體指包含與親本可變結(jié)構(gòu)域相同的可變區(qū)的分子，除了在重鏈可變區(qū)的⑶R區(qū)內(nèi)組合的總共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸取代，和/或至多在輕鏈可變區(qū)的所述⑶R區(qū)具有組合的總共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸取代是保守序列修飾。
[0066]如本文所用術(shù)語(yǔ)“親本抗體”指由用于變體制備的氨基酸序列編碼的抗體。優(yōu)選地，所述親本抗體具有人框架區(qū)和，如果存在，具有一個(gè)或多個(gè)人抗體恒定區(qū)。例如，所述親本抗體可以是人源化的或全人抗體。
[0067]如本文所用術(shù)語(yǔ)“分離的抗體”指從其天然環(huán)境的成分鑒定和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染的成分是將干擾抗體的診斷或治療用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體將被純化(I)到高于95重量％的抗體，如通過(guò)Lowry法確定，并且最優(yōu)選多于99重量％ ; (2)到足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)N末端殘基或內(nèi)部氨基酸序列的程度；或(3)到使用考馬斯亮藍(lán)或優(yōu)選銀染在還原或非還原條件下通過(guò)SDS-PAGE的同質(zhì)性。分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)原位的抗體，因?yàn)閷⒋嬖诳贵w的天然環(huán)境的至少一種成分。但是通常，分離的抗體將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備。
[0068]如本文所用術(shù)語(yǔ)“表位”指單克隆抗體特異性結(jié)合其上的抗原部分。表位決定簇通常由分子的化學(xué)活性表面組群組成，例如氨基酸或糖側(cè)鏈，并且通常具有具體的三維結(jié)構(gòu)特征，以及具體的電荷特征。更具體地，如本文所用術(shù)語(yǔ)“MASP-2表位”指如通過(guò)任何本領(lǐng)域熟知的方法(例如通過(guò)免疫測(cè)定)確定的，抗體免疫特異性結(jié)合的相應(yīng)多肽的部分。抗原性表位不必需是免疫原性的。這些表位可以實(shí)際上線(xiàn)性的，或可以是不連續(xù)的表位。因此，如本文所用術(shù)語(yǔ)“構(gòu)象表位”指通過(guò)抗原的氨基酸之間的空間關(guān)系而非一系列連續(xù)的氨基酸形成的不連續(xù)的表位。
[0069] 如本文所用術(shù)語(yǔ)“甘露聚糖結(jié)合凝集素”(“MBL”)等價(jià)于甘露聚糖結(jié)合蛋白(“MBP”)。
[0070]如本文所用“膜攻擊復(fù)合物”(“MAC”)指插入并破壞膜的5種末端補(bǔ)體成分(C5-C9)的復(fù)合物。亦稱(chēng)C5b-9。
[0071]如本文所用的“受試者”包括所有哺乳動(dòng)物，包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、狗、貓、馬、綿羊、山羊、牛、兔、豬和嚙齒動(dòng)物。
[0072]本文所用的氨基酸殘基的縮寫(xiě)如下:丙氨酸(Ala ；A)、天冬酰胺(Asn ；N)、天冬氨酸(Asp ；D)、精氨酸(Arg ；R)、半胱氨酸(Cys;C)、谷氨酸(Glu ；E)、谷胺酰胺(Gin ；Q)、甘氨酸(Gly ；G)、組氨酸(His ；H)、異亮氨酸(He ；1)、亮氨酸(Leu ；L)、賴(lài)氨酸(Lys ；K)、甲硫氨酸(Met ；M)、苯丙氨酸(Phe ；F)、脯氨酸(Pro ；P)、絲氨酸(Ser ；S)、蘇氨酸(Thr ；T)、色氨酸(Trp ；ff)、酪氨酸(Tyr ；Y)和丙氨酸(Val ；V)。
[0073]從最廣意義上看，天然存在的氨基酸可根據(jù)各個(gè)氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)特性來(lái)分組?！笆杷卑被崾侵竘ie、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或Pro?！坝H水”氨基酸是指Gly、Asn、Gin、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His。氨基酸的這種組別可進(jìn)一步細(xì)分如下?！安粠щ姾傻挠H水”氨基酸是指Ser、Thr、Asn或者Gin?！八嵝浴卑被崾侵窯lu或Asp?！皦A性”氨基酸是指Lys、Arg或者His。
[0074]本文所用術(shù)語(yǔ)“保守的氨基酸取代”通過(guò)下面每組中氨基酸之間的取代來(lái)說(shuō)明:
(I)甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)絲氨酸和蘇氨酸；(4)天冬氨酸和谷氨酸；(5)谷胺酰胺和天冬酰胺；(6)賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨 酸。
[0075]如本文所用術(shù)語(yǔ)“分離的核苷酸”指未整合進(jìn)生物體的基因組DNA的核酸分子(例如多核苷酸)。例如，編碼與細(xì)胞的基因組DNA分尚的生長(zhǎng)因子的DNA分子是分尚的DNA分子。分離的核苷酸的另一個(gè)實(shí)例是指未整合進(jìn)生物體的基因組的化學(xué)合成的核酸分子。分離自特定物種的核酸分子小于來(lái)自該物種的染色體的完整DNA分子。
[0076]如本文所用“核酸分子構(gòu)建物”是或者單或雙鏈的核酸分子，其通過(guò)人干預(yù)修飾以包含天然不存在的組合或并列安排的核酸區(qū)段。
[0077]如本文所用“表達(dá)載體”是編碼在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的核酸分子。典型地，表達(dá)載體包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、基因和轉(zhuǎn)錄終止子。基因表達(dá)通常置于啟動(dòng)子的控制下，并且該基因稱(chēng)為“可操作地連接到”啟動(dòng)子。類(lèi)似地，如果調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)核心啟動(dòng)子的活性，則調(diào)節(jié)元件和核心啟動(dòng)子是可操作地連接的。
[0078]如本文所用涉及數(shù)字的術(shù)語(yǔ)“近似”或“約”通常采用以包括落入該數(shù)字兩個(gè)方向(大于或小于)5%范圍的數(shù)字，除非另有說(shuō)明或從上下文另有證據(jù)(除了當(dāng)該數(shù)字將超過(guò)可能值的100%時(shí))。當(dāng)聲明范圍時(shí)，端點(diǎn)包括在范圍內(nèi)，除非另有說(shuō)明或從上下文另有證據(jù)。
[0079]如本文所用，單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)方面，除非上下文清楚地另外指示。因此，例如提及“一個(gè)細(xì)胞”包括單個(gè)細(xì)胞，以及兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，提及“一個(gè)試劑”包括一個(gè)試劑以及兩個(gè)或更多個(gè)試劑；提及“一個(gè)抗體”包括多個(gè)這些抗體和提及“一個(gè)框架區(qū)”包括提及一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等價(jià)物，等等。
[0080]本說(shuō)明書(shū)中每個(gè)實(shí)施方案將在細(xì)節(jié)上作必要的修改應(yīng)用于每個(gè)其它實(shí)施方案，除非另有說(shuō)明。
[0081]對(duì)于重組DNA、寡核苷酸合成和組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如，電轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。酶學(xué)反應(yīng)和純化技術(shù)可以根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行或者如本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)現(xiàn)的進(jìn)行，或如本文所述進(jìn)行。這些和相關(guān)的技術(shù)和方法通?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法進(jìn)行，和如在本說(shuō)明書(shū)通篇引用和討論的各種一般和更具體的引用中描述的進(jìn)行。參見(jiàn)，例如 Sambrook 等，2001，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols inMolecular Biology (Greene Pub 1.Assoc.1nc.& John Wiley & Sons, Inc.，NYj NY);Current Pro toco Is in Immunology (Edited by: John E.Coliganj Ada M.KruisbeekjDavid H.Marguliesj Ethan M.Shevachj Warren Strober 2001 John Wiley & Sons,NY, NY);或其它相關(guān)的Current Protocol發(fā)表物和其它類(lèi)似參考文獻(xiàn)。除非提供具體定義，本文描述的分子生物學(xué)，分析化學(xué)，合成有機(jī)化學(xué)和醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)的實(shí)驗(yàn)室方法和技術(shù)和所使用的相關(guān)命名法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并常規(guī)使用的。對(duì)于重組技術(shù)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、制劑和遞送和患者治療可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。[0082]關(guān)于本發(fā)明的任何方法、試劑盒、試劑或組合物，預(yù)期本說(shuō)明書(shū)中討論的任何實(shí)施方案都可以被實(shí)施，并且反之亦然。進(jìn)一步地，本發(fā)明的組合物可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。
[0083]I1.概述
凝集素(MBL、M-纖維膠凝蛋白、H-纖維膠凝蛋白、L-纖維膠凝蛋白和CL-11)是特異性識(shí)別分子，其觸發(fā)先天性補(bǔ)體系統(tǒng)并且該系統(tǒng)包括凝集素引發(fā)途徑和相關(guān)末端途徑放大環(huán)，其放大凝集素引發(fā)的末端補(bǔ)體效應(yīng)物分子的活化。Clq是特異性識(shí)別分子，其觸發(fā)獲得性補(bǔ)體系統(tǒng)并且該系統(tǒng)包括經(jīng)典引發(fā)途徑和相關(guān)末端途徑放大環(huán)，其放大Clq引發(fā)的末端補(bǔ)體效應(yīng)物分子的活化。我們將這兩種主要的補(bǔ)體活化系統(tǒng)分別稱(chēng)為凝集素依賴(lài)的補(bǔ)體系統(tǒng)和Clq依賴(lài)的補(bǔ)體系統(tǒng)。
[0084]除了其在免疫防御中的重要作用，補(bǔ)體系統(tǒng)在很多臨床狀況中導(dǎo)致組織損傷。因此，對(duì)開(kāi)發(fā)治療有效的補(bǔ)體抑制劑以防止這些不良效果存在緊迫的需要。
[0085]如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，919，094、共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)12/905,972 (公開(kāi)為US 2011/0091450)和共同未決的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)13/083，441 (公開(kāi)為US2011/0311549)(其每個(gè)都屬于Omeros Corporation,本申請(qǐng)的受讓人,并且其每個(gè)在此通過(guò)引用并入)中所述，通過(guò)使用MASP-2 -/-小鼠模型確定可以抑制凝集素介導(dǎo)的MASP-2途徑同時(shí)保持經(jīng)典途徑完整。基于可以抑制凝集素介導(dǎo)的MASP-2通路同時(shí)保持經(jīng)典途徑完整的認(rèn)可，則可以認(rèn)識(shí)到，特異性?xún)H抑制導(dǎo)致特定病理的補(bǔ)體活化而不完全關(guān)閉補(bǔ)體的免疫防御能力，其將是非常令人想要的。例如在其中補(bǔ)體活化主要通過(guò)凝集素依賴(lài)的補(bǔ)體系統(tǒng)介導(dǎo)的疾病狀態(tài)中，特異性?xún)H抑制此系統(tǒng)將是有利的。這將保持Clq依賴(lài)的補(bǔ)體活化系統(tǒng)的完整性以處理免疫復(fù)合物加工以及幫助宿主防御感染。
[0086]在特異性抑制凝集素依賴(lài)的補(bǔ)體系統(tǒng)的治療藥物的研發(fā)中，優(yōu)選的作為靶標(biāo)的蛋白成分是MASP-2。在凝集素依賴(lài)的補(bǔ)體系統(tǒng)的所有已知蛋白成分(MBL、H-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白、L-纖維膠凝蛋白、MASP-2、C2-C9、B因子、D因子和備解素)中，只有MASP-2是凝集素依賴(lài)的補(bǔ)體系統(tǒng)所獨(dú)有并且是這個(gè)系統(tǒng)起作用所必需的。凝集素(MBL、H-纖維膠凝蛋白、M-纖維膠凝蛋白和L-纖維膠凝蛋白和CL-11)也是凝集素依賴(lài)的補(bǔ)體系統(tǒng)中獨(dú)有的成分。然而，這些凝集素成分任一種的喪失并不一定抑制系統(tǒng)活化，這是由于凝集素冗余所致。為了保證抑制凝集素依賴(lài)的補(bǔ)體活化系統(tǒng)，抑制所有5種凝集素將是必要的。此外，由于還已知MBL和纖維膠凝蛋白具有不依賴(lài)于補(bǔ)體的調(diào)理活性，因此抑制凝集素功能將導(dǎo)致喪失這種有益的抗感染的宿主防御機(jī)制。相反，如果MASP-2是抑制靶標(biāo)的話(huà)，這種不依賴(lài)于補(bǔ)體的凝集素調(diào)理活性會(huì)保持完整。MASP-2作為抑制凝集素依賴(lài)的補(bǔ)體活化系統(tǒng)的治療靶的額外好處是，MASP-2的血漿濃度是所有補(bǔ)體蛋白中最低的(約500 ng/ml);因此，為得到完全抑制可能只需要相對(duì)低濃度的高親和性MASP-2抑制劑，如本文實(shí)施例中所證明的。
[0087]根據(jù)前述，如本文所述，本發(fā)明提供以高親和力結(jié)合人MASP-2并且能夠抑制凝集素介導(dǎo)的補(bǔ)體途徑活化的單克隆全人抗MASP-2抗體。
[0088]II1.MASP-2 抑制性抗體
在一方面，本發(fā)明提供單克隆全人抗MASP-2抗體，或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合人MASP-2并抑制或阻斷MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化。MASP-2抑制性抗體可以通過(guò)抑制或阻斷MASP-2的生物學(xué)功能，有效地抑制或有效地阻斷MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化系統(tǒng)。例如，抑制性抗體可以有效地抑制或阻斷MASP-2蛋白-蛋白相互作用，干擾MASP-2 二聚化或組裝，阻斷Ca2+結(jié)合，或干擾MASP-2絲氨酸蛋白酶活化位點(diǎn)。
[0089]MASP-2 表位
本發(fā)明提供特異性結(jié)合人MASP-2的全人抗體。MASP-2多肽展示類(lèi)似于MASP-1、MASP-3和Clr和Cls (Cl補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白酶)的分子結(jié)構(gòu)。SEQ ID NO:1中描述的cDNA分子編碼MASP-2代表性的實(shí)例(由SEQ ID NO: 2中描述的氨基酸序列組成)并提供具有前導(dǎo)序列(1-15個(gè)氨基酸)的人MASP-2多肽，所述前導(dǎo)序列在分泌后被切割產(chǎn)生成熟形式的人MASP-2CSEQ ID N0:3)。如圖1A所示，人HSd-之基因包括12個(gè)外顯子。人MASP_2cDNA由外顯子B、C、D、F、G、H、1、J、K和L編碼。SEQ ID N0:4中描述的cDNA分子編碼大鼠MASP-2(由SEQ ID NO:5中描述的氨基酸序列組成)并提供具有前導(dǎo)序列的大鼠MASP-2多肽，所述前導(dǎo)序列在分泌后被切割產(chǎn)生成熟形式的大鼠MASP-2 (SEQ ID N0:6)。
[0090]本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4中公開(kāi)的序列分別表示人和大鼠MASP-2的單個(gè)等位基因，并且預(yù)期發(fā)生等位基因變異和選擇性剪接。SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:4中顯示的核苷酸序列的等位基因變體，包括那些包含沉默突變和那些其中的突變導(dǎo)致氨基酸序列改變的變體，在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。MASP-2序列的等位基因變體可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)探針cDNA或基因組文庫(kù)從不同個(gè)體中克隆。
[0091]人MASP-2蛋白(S EQ ID NO: 3)的結(jié)構(gòu)域顯示于圖1B和下表1中，并且包括N末端Clr/Cls/海膽VEGF/骨形成蛋白(CUBI)結(jié)構(gòu)域、表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域、第二 CUB結(jié)構(gòu)域(CUBII)，以及串聯(lián)的補(bǔ)體調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)域CCPl和CCP2，和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。MASP-2基因的選擇性剪接產(chǎn)生MApl9。MAp19是包含MASP-2的N末端CUBl-EGF區(qū)和四個(gè)額外殘基(EQSL)的非酶蛋白。
[0092]已顯示多個(gè)蛋白通過(guò)蛋白-蛋白相互作用與MASP-2結(jié)合或相互作用。例如已知MASP-2結(jié)合并與凝集素蛋白MBL、H纖維膠凝蛋白和L纖維膠凝蛋白形成Ca2+依賴(lài)的復(fù)合物。已顯示每個(gè)MASP-2/凝集素復(fù)合物通過(guò)MASP-2依賴(lài)的蛋白C4和C2的切割活化補(bǔ)體(Ikeda, K.,等，J.Biol.Chem.之似:7451-7454，1987; Matsushita, Μ.,等，J.Exp.Med.176\ 1497-2284, 2000; Matsushita, M.,等，J.1mmunol.168\3502-3506,2002)。研究已經(jīng)顯示MASP-2的CUBl-EGF結(jié)構(gòu)域?qū)τ贛ASP-2與MBL的連接是必需的(Thielens, N.M., et al., J.1mmunol.7撕:5068, 2001)。還已經(jīng)顯示CUB1EGFCUBII 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)MASP-2的二聚化，其是形成有活性的MBL復(fù)合物所需要的(Wallis，R., et al.，J.Biol.Chem.30962-30969, 2000)。因此，可以鑒定與已知對(duì)于MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化重要的MASP-2靶區(qū)域結(jié)合或相互作用的MASP-2抑制性抗體。
[0093]表1:MASP_2多肽結(jié)構(gòu)域
【權(quán)利要求】
1.分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合人MASP-2，包括: (i)包括CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3序列的重鏈可變區(qū)；和 (ii)包括⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3的輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)⑶R-H3序列包括描述為SEQ ID N0:38或SEQ ID N0:90的氨基酸序列，和其保守序列修飾，其中輕鏈可變區(qū)⑶R-L3序列包括描述為SEQ ID N0:51或SEQ ID N0:94的氨基酸序列，和其保守序列修飾，并且其中所述分離的抗體抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)CDR-H2序列包括描述為SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列，和其保守序列修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)CDR-Hl序列包括描述為SEQ ID N0:28或SEQ ID NO:29的氨基酸序列，和其保守修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈可變區(qū)CDR-L2序列包括描述為SEQ ID NO:93的氨基酸序列，和其保守修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈可變區(qū)CDR-Ll序列包括描述為SEQ ID N0:91或SEQ ID N0:92的氨基酸序列，和其保守修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)的CDR-Hl包括SEQ ID NO:28。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)的CDR-H2包括SEQ ID NO:32。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈可變區(qū)的CDR-H3包括SEQ ID NO:90。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的分離的抗體，其中SEQID NO:90中描述的氨基酸序列在位置8包含R。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的分離的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)的⑶R-Ll包括SEQID NO:91。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的分離的抗體，其中SEQID NO:91中描述的氨基酸序列在位置2包含E。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的分離的抗體，其中SEQID NO:91中描述的氨基酸序列在位置8包含Y。
13.根據(jù)權(quán)利要求4的分離的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)的⑶R-L2包括SEQID NO:93,并且其中SEQ ID NO:93中描述的氨基酸序列在位置2包含K。
14.根據(jù)權(quán)利要求4的分離的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)的⑶R-L2包括SEQID NO:93,并且其中SEQ ID NO:93中描述的氨基酸序列在位置3包含Q。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)的⑶R-L3包括SEQID NO:51。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的抗體，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段選自Fab、Fab’片段、F(ab’)2片段和全抗體。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的抗體，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段選自單鏈抗體、ScFv和缺乏鉸鏈區(qū)的單價(jià)抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的抗體，其中所述抗體結(jié)合人MASP-2，具有IOnM或更低的KD0
19.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體在體外測(cè)定中在1%人血清中以IOnM或更低的IC50抑制C4活化。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體在90%人血清中以30nM或更低的IC5tl抑制C4活化。
21.分離的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合人MASP-2，其中所述抗體包括: I)a)重鏈可變區(qū)，其包括 i)包括SEQID NO:20的氨基酸序列31-35的重鏈CDR-Hl ;和 ii)包括SEQID NO:20的氨基酸序列50-65的重鏈CDR-H2 ;和 iii)包括SEQID NO:20的氨基酸序列95-102的重鏈CDR-H3 ;和 b)輕鏈可變區(qū)，其包括
i)包括SEQID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列24-34的輕鏈CDR-Ll ;和 ii)包括SEQID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列50-56的輕鏈CDR-L2 ;和 iii)包括SEQID NO:22或SEQ ID NO:24的氨基酸序列89-97的輕鏈CDR-L3 ;或 II)所述重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的變體，除了在所述重鏈可變區(qū)的所述CDR區(qū)內(nèi)至多組合的總共10個(gè)氨基酸取代和在所述輕鏈可變區(qū)的所述CDR區(qū)內(nèi)至多組合的總共10個(gè)氨基酸取代之外，該變體與所述可變結(jié)構(gòu)域在其它方面相同， 其中所述抗體或其變體抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述抗體結(jié)合人MASP-2，具有IOnM或更低的Kd。
23.權(quán)利要求21的抗體，其中所述抗體結(jié)合MASP-2的CCPl結(jié)構(gòu)域中的表位。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述抗體在體外測(cè)定中在1%人血清中以IOnM或更低的IC5tl抑制C3沉積。
25.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述抗體在90%人血清中以30nM或更低的IC5tl抑制C3b沉積。
26.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述抗體是選自Fv、Fab、Fab’、F(ab) 2和F (ab’)2的抗體片段。
27.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述抗體是單鏈分子。
28.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述抗體是IgG2分子。
29.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述抗體是IgGl分子。
30.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述抗體是IgG4分子。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的抗體，其中所述IgG4分子包括S228P突變。
32.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述抗體基本上不抑制經(jīng)典途徑。
33.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)包括SEQID N0:20，或其對(duì)SEQ IDNO:20包括至少80%同一性的變體。
34.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述重鏈可變區(qū)包括SEQID NO: 18，或其對(duì)SEQ IDNO: 18包括至少80%同一性的變體。
35.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)包括SEQID NO:24，或其對(duì)SEQ IDNO:24包括至少80%同一性的變體。
36.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述輕鏈可變區(qū)包括SEQID NO:22，或其對(duì)SEQ IDNO:22包括至少80%同一性的變體。
37.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中除了在所述重鏈可變區(qū)的所述CDR區(qū)內(nèi)至多組合的總共1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸取代之外，所述變體對(duì)所述重鏈可變區(qū)在其它方面相同。
38.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述變體在一個(gè)或多個(gè)選自下列的位置包括氨基酸取代:所述重鏈可變區(qū)的位置 31、32、33、34、35、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、95、96、97、98、99、100 或 102。
39.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中除了在所述輕鏈可變區(qū)的所述CDR區(qū)內(nèi)至多組合的總共1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸取代之外，所述變體對(duì)所述輕鏈可變區(qū)在其它方面相同。
40.根據(jù)權(quán)利要求21的抗體，其中所述變體在一個(gè)或多個(gè)選自下列的位置包括氨基酸取代:所述輕鏈可變區(qū)的位置 25、26、27、29、31、32、33、51、52、89、92、93、95、96 或 97。
41.分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合人MASP-2，包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 18,SEQ ID N0:20或SEQ ID NO:21中描述的任一氨基酸序列。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的分離的抗體，其進(jìn)一步包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括與 SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 25 或 SEQ ID NO: 27 中描述的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
43.分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合片段，其結(jié)合人MASP-2，包括輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括 SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 25 或 SEQ ID NO: 27 中描述的任一氨基酸序列。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的分離的抗體，其進(jìn)一步包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括與SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21中描述的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
45.編碼如權(quán)利要求1、21、41或43所述抗MASP-2抗體或其片段的氨基酸序列的核酸分子。
46.包括編碼根據(jù)權(quán)利要求45的本發(fā)明的抗MASP-2抗體的核酸分子的表達(dá)盒。
47.細(xì)胞，其至少包括編碼根據(jù)權(quán)利要求45或權(quán)利要求46的本發(fā)明的抗MASP-2抗體的核酸分子之一。
48.生成分離的抗MASP-2抗體的方法，其包括在允許編碼抗MASP-2抗體的核酸分子表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求47的細(xì)胞并分離所述抗MASP-2抗體。
49.分離的全人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其以如通過(guò)表面等離子體共振確定的IOnM或更低的Kd從人MASP-2解離，并在甘露聚糖包被的基質(zhì)上在1%血清中以IOnM或更低的IC5tl抑制C4活化。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的分離的人抗體，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異性識(shí)別至少部分的由參照抗體所識(shí)別的表位，其中所述參照抗體包括如在SEQ ID NO: 20中描述的重鏈可變區(qū)和如在SEQ ID NO:24中描述的輕鏈可變區(qū)。
51.組合物，其包括權(quán)利要求1、21、41、43或49的全人單克隆抗MASP-2抗體或其片段和藥學(xué)可接受賦形劑。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的組合物，其中所述組合物配制用于全身遞送。
53.權(quán)利要求52的組合物，其中所述組合物配制用于動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)、吸入、鼻內(nèi)或皮下施用。
54.根據(jù)權(quán)利要求52的組合物，其中所述組合物配制用于皮下施用。
55.在人受試者中抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化的方法，其包括以在所述人受試者中足夠抑制MASP-2依賴(lài)的補(bǔ)體活化的量施用權(quán)利要求1、21、41、43或49的人單克隆抗體。
56.制品，其包括適合用于對(duì)人受試者的治療施用的人單克隆MASP-2抗體的單位劑量，其中所述單位劑量是1mg-1OOOmg范圍。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103687620SQ201280032866
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月4日
【發(fā)明者】T.杜德勒, W.R.貢博茨, J.B.帕倫特, C.E.特德福德, A.卡夫利, U.B.黑格曼, H.里爾森, S.基普里賈諾夫 申請(qǐng)人:奧默羅斯公司