專利名稱：miR-214在制備預(yù)防或治療老年癡呆癥產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種miR-214在制備預(yù)防或治療老年癡呆癥產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
老年性癡呆(Alzheimer，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，起病隱襲，病程呈慢性進行性，是老年期癡呆最常見的一種類型。主要表現(xiàn)為漸進性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀，嚴(yán)重影響社交、職業(yè)與生活功能。AD的病因及發(fā)病機制尚未闡明。老年癡呆癥作為退化疾病，必須在尸檢時才能發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供miR-214的新用途。本發(fā)明提供了 miR-214在制備如下I)和/或2)產(chǎn)品中的應(yīng)用I)預(yù)防和/或治療老年癡呆癥的產(chǎn)品；2)降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡數(shù)量的產(chǎn)品；所述miR-214的核苷酸序列為序列表中的序列I。上述應(yīng)用中， 所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡為由異氟醚誘導(dǎo)引起。上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為藥物；所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞為離體細胞。本發(fā)明的另一個目的是提供一種產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，為miR-214或miR-214類似物；所述產(chǎn)品為如下I)和/或2) :1)預(yù)防和/或治療老年癡呆癥；2)降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡數(shù)量；所述miR-214的核苷酸序列為序列表中的序列I。上述miR-214 類似物為 Syn-mmu-miR-214_3p miScript miRNA Mimic (QIAGENMSY0000661)。上述產(chǎn)品中，所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡為由異氟醚誘導(dǎo)弓I起。上述廣品中，所述廣品為藥物；所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞為離體細胞。提高miR-214表達的物質(zhì)在制備如下I)和/或2)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍I)預(yù)防和/或治療老年癡呆癥；2)降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡數(shù)量；所述miR-214的核苷酸序列為序列表中的序列I。上述提高miR-214表達的物質(zhì)為miR-214或miR-214類似物。上述miR-214 類似物為 Syn-mmu-miR-214_3p miScript miRNA Mimic (QIAGENMSY0000661);上述miR-214的核苷酸序列為序列表中的序列I。
上述應(yīng)用中，所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡為由異氟醚誘導(dǎo)引起；所述產(chǎn)品為藥物；所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞為離體細胞。本發(fā)明的實驗證明，與m1-214抑制劑、Scramble相比，miR-214和mi_214類似物可以降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞的死亡率，說明miR-214具有預(yù)防和/或治療老年癡呆癥的作用；在異氟醚的傷害處理下，老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞的死亡率增加，但是在miR-214和m1-214類似物租用下仍然可以降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞的死亡率，說明即使在異氟醚的傷害處理下，miR-214仍具有預(yù)防和/或治療老年癡呆癥的作用。


圖1為在大鼠神經(jīng)元中顯微注射miR-214或者mimic miR-214 (M_miR-214)抵消了培養(yǎng)基中外源性的Αβ 1-42預(yù)處理情況下異氟醚引起的細胞死亡圖2為在大鼠神經(jīng)元中顯微注射miR-214或者mimic miR-214 (M_miR-214)抵消了細胞內(nèi)Aβ 1-42毒性作用下異氟醚引起的細胞死亡
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、miR-214在預(yù)防或治療老年癡呆癥中的應(yīng)用一、老年癡呆癥神經(jīng)元細胞模型的建立對分離培養(yǎng)的神經(jīng)元進行淀粉樣蛋白beta的處理可以很好地模擬老年癡呆癥，具體如下1、分離培養(yǎng)獲得神經(jīng)元細胞I)、包被培養(yǎng)前晚上將培養(yǎng)瓶(板)用多聚賴氨酸包被lOmin，吸除，無菌操作臺上15min自然晾干,置于培養(yǎng)箱中備用；2)、取腦選取新生24h的SD大鼠(維通立華，名稱SD大鼠24小時乳鼠)數(shù)只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，斷頭處死，無菌條件下分層剪開頭皮、顱骨，用彎鑷?yán)_腦區(qū)視野，小心取出全腦，D-hanks液洗數(shù)次；(預(yù)先準(zhǔn)備至少4把眼科剪刀，分別用于斷頭、剪頭皮和剪顱骨及第3步的剪組織這4個操作)3)、分離以腦中線為起點，小心撥開大腦顳葉皮層，暴露出新月狀海馬回，小心夾出海馬組織，置于冰浴的D-hanks液中，仔細剔除微血管，充分剪碎組織；4)、消化加入同體積O. 125%的胰蛋白酶，瓶口用錫箔紙蓋上，37°C培養(yǎng)箱內(nèi)消化20min左右，期間輕搖數(shù)次；5)過濾加入數(shù)滴胎牛血清終止消化，用尖頭吸管輕輕吹打細胞數(shù)分鐘，至液體成米糊狀即停止吹打，動作要輕柔，用150目網(wǎng)篩過濾，收集細胞懸液；6)、接種以IlOOrpm離心5min，傾去上清，用DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細胞，輕輕吹打，臺盼藍染色快速計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，調(diào)整細胞終濃度為100000個/ml，加入終濃度為10%胎牛血清后接種于培養(yǎng)瓶(板)中，置于37°C、含5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12小時內(nèi)禁止晃動
7)、換液接種后24h將培養(yǎng)液全量換成無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，第48h時加入終濃度為10 μ mol/L的阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細胞的過度生長，隨后每3d半量換無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，得到離體神經(jīng)元細胞。2、淀粉樣蛋白beta的處理神經(jīng)元細胞得到老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞模型θΑβ 1-42的處理直接向培養(yǎng)離體神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)液中加入終濃度為I μ m的Αβ 1-42 (BACHEM Η-1368)，培養(yǎng)I天，得到θΑβ 1-42處理老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞，即為老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞模型。 Αβ 1-42的處理通過顯微注射的方法向離體神經(jīng)元細胞內(nèi)注射濃度為IOnmA β 1-42水溶液(25Fl/cell)，培養(yǎng)I天，得到iA β 1_42處理老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞，即為老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞模型。二、miR-214在預(yù)防或治療老年癡呆癥中的應(yīng)用異氟醚，是一種帶乙醚樣氣味的無色澄明液體，用于各種手術(shù)全身、半身麻醉。miR-214的核苷酸序列為ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU (序列I);注射前溶于生理鹽水(O. 9%氯化鈉水溶液)中，得到IOnM的miR-214溶液。Syn-mmu-miR-214~3p miScript miRNA Mimic (QIAGEN MSY0000661 ；又稱為 m1-214 類似物或 M-m1-214)、Ant1-mmu-miR-214_3p miScript miRNA Inhibitor(QIAGEN MIN0000661 ;又稱為 m1-214 抑制劑或1-m1-214). Scramble 均購自 QIAGEN 公司購買 https://www. qiagen. com/geneglobe/searchresults. aspx hits=10&usedlinktype=link。注射前M-m1-214(mi_214 類似物)、1-m1-214(mi_214 抑制劑)、Scramble 分別溶于生理鹽水(0. 9%氯化鈉水溶液)中，得到IOnM的M-m1-214 (m1-214類似物)溶液、1-m1-214(m1-214抑制劑)溶液、Scramble溶液。1、miR-214對θΑβ 1-42處理老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞模型的影響1)方法分為異氟醚處理組和對照處理組Α、異氟醚處理組(isof Iurane):將eA β 1-42處理老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞中加入終濃度為0.5% (異氟醚占細胞培養(yǎng)液的體積百分含量)異氟醚(GuoyaoGroup, Beijing, China)后，在5%C02、37度培養(yǎng)3h得到異氟醚處理組細胞；將異氟醚處理組細胞再進行如下5個小組處理無RNA處理小組不經(jīng)過任何處理的異氟醚處理組細胞37度5%C02培養(yǎng)；miR-214小組將終濃度IOnM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50個異氟醚處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；為提高miR-214表達小組；M-m1-214 (m1-214 類似物)小組將終濃度 IOnM 的 M-m1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50個異氟醚處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；為提高miR-214表達小組；1-m1-214 (m1-214 抑制劑)小組將終濃度 IOnM 的 Ii1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50個異氟醚處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；為抑制miR-214表達小組；Scramble小組將終濃度IOnM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50個異氟醚處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；B、對照處理組(Ctrl):將θΑβ 1-42處理老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞在5%C02，37度培養(yǎng)3h得到對照處理組細胞；再將對照處理組細胞進行如下5個小組處理 無RNA處理小組不經(jīng)過任何處理的對照處理組細胞在37度5%C02培養(yǎng)；miR-214小組將終濃度IOnM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50個對照處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；為提高miR-214表達小組；M-m1-214 (m1-214 類似物)小組將終濃度 IOnM 的 M-m1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50個對照處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；為提高miR-214表達小組；1-m1-214 (m1-214 抑制劑)小組將終濃度 IOnM 的 Ii1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50個對照處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；為抑制miR-214表達小組；Scramble小組將終濃度IOnM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50個對照處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；2)細胞死亡率檢測(I)上述各小組培養(yǎng)24h時間后，取培養(yǎng)在玻片上的細胞，4%多聚甲醛固定25min，PBS浸洗二次，每次5min ；(2)將吸附細胞的載玻片在O. 2%的Triton X-100中處理15min，PBS浸洗二次，每次5min ；(3)制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50 μ I TdT+450 μ I熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50 μ I熒光素標(biāo)記的dUTP液。(4)玻片干后，加50 μ I TUNEL反應(yīng)混合液(陰性對照組僅加50 μ I熒光素標(biāo)記的dUTP液)于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37°C X lh, PBS漂洗3次。(5)玻片干后加50μ1 converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37 V X30min, PBS漂洗3次。在培養(yǎng)了細胞的玻片上加50-100 μ IDAB底物，反應(yīng)15-250C X lOmin, PBS 漂洗 3 次。(6)封片，將已經(jīng)處理好的玻片倒扣在滴有甘油PBS混合液的載玻片上，用指甲油封片，放在顯微鏡下觀察，有凋亡情況的細胞被染色。統(tǒng)計各小組死亡細胞數(shù)量，計算細胞死亡率結(jié)果如圖1所示。圖1的左邊柱形圖組為對照處理組(ctrl)，右邊柱形圖組為異氟醚處理組(isof Iurane),具體結(jié)果如下對照處理組中的無RNA處理小組、miR-214小組、M-m1-214 (m1-214類似物)小組、1-m1-214 (m1-214抑制劑)小組、Scramble小組中的細胞死亡率分別為52%、27%、30%、86%、54% ;可以看出，與m1-214抑制劑、Scramble和無RNA處理相比，miR-214和m1-214類似物可以降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞(外源性θΑβ 1-42處理)的死亡率，說明miR-214具有預(yù)防和/或治療老年癡呆癥的作用。異氟醚處理組中的無RNA處理小組、miR-214小組、M-m1-214 (m1-214類似物)小組、1-m1-214 (m1-214抑制劑)小組、Scramble小組中的細胞死亡率分別為75%、24%、25%、91%,76% ;可以看出，異氟醚處理組中的無RNA處理細胞死亡率高于對照處理組中的無RNA處理小組，說明異氟醚可以促進老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡；而miR-214和m1-214類似物仍然可以降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞(外源性eA β 1-42處理)的死亡率，說明即使在異氟醚的傷害處理下，miR-214仍具有預(yù)防 和/或治療老年癡呆癥的作用。因此，在大鼠神經(jīng)元中顯微注射miR-214或者mimic miR-214 (M_mi R-214)抵消了外源性的θΑβ 1-42處理得到老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞模型在異氟醚處理引起的細胞死亡。2、iA β 1-42處理老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞模型進行異氟醚處理I)方法分為異氟醚處理組和對照處理組Α、異氟醚處理組(isofIurane):將 Αβ 1-42處理老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞中加入終濃度為0.5% (異氟醚占細胞培養(yǎng)液的體積百分含量)異氟醚(GuoyaoGroup, Beijing, China)后，在5%C02、37度培養(yǎng)3h得到異氟醚處理組細胞；將異氟醚處理組細胞再進行如下5個小組處理無RNA處理小組不經(jīng)過任何處理的異氟醚處理組細胞37度5%C02培養(yǎng)；miR-214小組將終濃度10nM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50個異氟醚處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；M-m1-214 (m1-214 類似物)小組將終濃度 10nM 的 M-m1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50個異氟醚處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；1-m1-214 (m1-214 抑制劑)小組將終濃度 10nM 的 Ii1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50個異氟醚處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；Scramble小組將終濃度10nM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50個異氟醚處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；B、對照處理組將eA β 1_42處理老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞5%C02，37度培養(yǎng)3h得到對照處理組細胞；再將對照處理組細胞進行如下5個小組處理無RNA處理小組不經(jīng)過任何處理的對照處理組細胞在37度5%C02培養(yǎng)；miR-214小組將終濃度10nM的miR-214溶液按照25fL/cell注射到50個對照處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；M-m1-214 (m1-214 類似物)小組將終濃度 10nM 的 M-m1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50個對照處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；1-m1-214 (m1-214 抑制劑)小組將終濃度 IOnM 的1-m1-214 溶液按照 25fL/cell注射到50個對照處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；Scramble小組將終濃度IOnM的Scramble溶液按照25fL/cell注射到50個對照處理組細胞中，37度5%C02培養(yǎng)；2)細胞死亡率檢測(I)上述各小組培養(yǎng)24h時間后，取培養(yǎng)在玻片上的細胞，4%多聚甲醛固定25min，PBS浸洗二次，每次5min ；(2)將吸附細胞的載玻片在0.2%的Triton X-100中處理15min，PBS浸洗二次，每次5min ；(3)制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50 μ I TdT+450 μ I熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50 μ I熒光素標(biāo)記的dUTP液。(4)玻片干后，加50 μ I TUNEL反應(yīng)混合液(陰性對照組僅加50 μ I熒光素標(biāo)記的dUTP液)于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37°C X lh, PBS漂洗3次。(5)玻片干后加50μ1 converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37 V X30min, PBS漂洗3次。在培養(yǎng)了細胞的玻片上加50-100 μ IDAB底物，反應(yīng)15-250C X lOmin, PBS 漂洗 3 次。(6)封片，將已經(jīng)處理好的玻片倒扣在滴有甘油PBS混合液的載玻片上，用指甲油封片，放在顯微鏡下觀察，有凋亡情況的細胞被染色。統(tǒng)計各小組死亡細胞數(shù)量，計算細胞死亡率結(jié)果如圖2所示。圖2的左邊柱形圖組為對照處理組(ctrl)，右邊柱形圖組為異氟醚處理組(isofIurane),具體結(jié)果如下對照處理組中的無RNA處理小組、miR-214小組、M-m1-214 (m1-214類似物)小組、1-m1-214 (m1-214抑制劑)小組、Scramble小組中的細胞死亡率分別為51%、22%、36%、89%、51% ;可以看出，與m1-214抑制劑、Scramble和無RNA處理相比，miR-214和m1-214類似物可以降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞(內(nèi)源性 Αβ 1-42處理)的死亡率，且miR-214更好的降低細胞死亡率，說明miR-214具有預(yù)防和/或治療老年癡呆癥的作用。異氟醚處理組中的無RNA處理小組、miR-214小組、M-m1-214 (m1-214類似物)小組、1-m1-214 (m1-214抑制劑)小組、Scramble小組中的細胞死亡率分別為80%、24%、34%、90%,74% ;可以看出，異氟醚處理組中的無RNA處理細胞死亡率高于對照處理組中的無RNA處理小組，說明異氟醚可以促進老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡；而miR-214和m1-214類似物仍然可以降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞(內(nèi)源性iAi3 1-42處理)的死亡率，說明即使在異氟醚的傷害處理下，miR-214仍具有預(yù)防和/或治療老年癡呆癥的作用。

因此，在大鼠神經(jīng)元中顯微注射miR-214或者mimic miR-214(M_miR-214)抵消了內(nèi)源性的 Αβ 1-42處理得到老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞模型在異氟醚處理引起的細胞死亡。
權(quán)利要求
1.miR-214在制備如下I)和/或2)產(chǎn)品中的應(yīng)用 1)預(yù)防和/或治療老年癡呆癥的產(chǎn)品； 2)降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡數(shù)量的產(chǎn)品； 所述miR-214的核苷酸序列為序列表中的序列I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于 所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡為由異氟醚誘導(dǎo)引起。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)品為藥物； 所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞為離體細胞。
4.ー種產(chǎn)品，為miR-214 ; 所述產(chǎn)品為如下I)和/或2) :1)預(yù)防和/或治療老年癡呆癥；2)降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡數(shù)量； 所述miR-214的核苷酸序列為序列表中的序列I。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)品，其特征在干 所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡為由異氟醚誘導(dǎo)引起。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的產(chǎn)品，其特征在于 所述產(chǎn)品為藥物； 所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞為離體細胞。
7.提高miR-214表達的物質(zhì)在制備如下I)和/或2)產(chǎn)品中的應(yīng)用 1)預(yù)防和/或治療老年癡呆癥； 2)降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡數(shù)量； 所述miR-214的核苷酸序列為序列表中的序列I。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述提高miR-214表達的物質(zhì)為miR-214或miR-214類似物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于 所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡為由異氟醚誘導(dǎo)引起； 所述產(chǎn)品為藥物； 所述老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞為離體細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種miR-214在制備預(yù)防或治療老年癡呆癥產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了miR-214在制備如下1)和/或2)產(chǎn)品中的應(yīng)用1)預(yù)防和/或治療老年癡呆癥；2)降低老年癡呆癥的神經(jīng)元細胞死亡數(shù)量；所述miR-214的核苷酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的實驗證明，提高miR-214表達的物質(zhì)可以預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆癥。而在早期的臨床診斷中，miR-214也可以作為診斷神經(jīng)退行性疾病的生物指標(biāo)，通過檢測病人中miR-214水平的檢測，結(jié)合其他有效指標(biāo)，醫(yī)生可以對病人進行及時的神經(jīng)退行性疾病早期診斷，進而對神經(jīng)退行性疾病和認(rèn)知水平的損失進行有效的控制。
文檔編號A61P25/28GK103028122SQ20121058631
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者張研 申請人:北京大學(xué)