含蛋白或多肽的疏水溶液、其制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物學(xué)和制藥學(xué)領(lǐng)域，涉及含蛋白或多肽的疏水溶液、其制備方法及用途。本發(fā)明中，使用水溶性助溶劑作為蛋白和/或多肽的分散介質(zhì)，制備過(guò)程不需要水或水溶液參與，所得的含蛋白和/或多肽的分散介質(zhì)，可以直接與疏水相混合，由此獲得單相、透明穩(wěn)定的液體溶液，有效地解決了這類分子脂溶性低的問(wèn)題。采用該方法制成的蛋白和/或多肽的疏水溶液，蛋白和/或多肽的脂溶性及跨膜能力得到顯著改善，并且生物活性在室溫下能夠保持長(zhǎng)久地穩(wěn)定性，沒(méi)有發(fā)生降解或生物活性丟失的現(xiàn)象。本發(fā)明的產(chǎn)品，制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】含蛋白或多肽的疏水溶液、其制備方法及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物學(xué)和制藥學(xué)領(lǐng)域，涉及含蛋白或多肽的疏水溶液、其制備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]一些有著重要應(yīng)用的蛋白質(zhì)多肽如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰島素、甲狀旁腺激素等，都是親水性的，其疏水化有著許多重要的應(yīng)用，例如:能夠提高親水物質(zhì)的穩(wěn)定性，能夠提高蛋白多肽類藥物的脂溶性，增加藥物穿越生物膜屏障的能力；能夠延長(zhǎng)蛋白或多肽藥物分子的作用時(shí)間，實(shí)現(xiàn)緩控釋給藥；對(duì)蛋白酶進(jìn)行疏水化固定，能夠極大地提高產(chǎn)率，并有利于產(chǎn)物的分離和蛋白酶的回收。
[0003]張海州等人通過(guò)油包醇體系，制備出了維生素C的非水溶液，能夠大大提高維生素C的穩(wěn)定性。但油包醇體系不穩(wěn)定，因此，張海州等人以鯨蠟基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷(ABIL EM90，黏度400-2000CS)作乳化劑，制備出膏霜制劑，能夠避免油醇分離(張海州，等，用于穩(wěn)定化妝品中維生素C的油包多元醇體系的研究，2009《日用化學(xué)工業(yè)》39 (4):249-252 ;專利 CN200810100726.7)。美國(guó)專利 US2011/0147259A1 通過(guò)加入高熔點(diǎn)的輔料三羥基硬脂酸(熔點(diǎn)110~140C)和12-羥基硬脂酸(熔點(diǎn)80C)以增加體系黏度(黏度值介于2，OOOcp - 3，000，OOOcp)，進(jìn)而增加油包醇的穩(wěn)定性。上述技術(shù)方案，均是通過(guò)增加黏度以克服不同密度的輔料分層，提高油包醇制劑的穩(wěn)定性，膏霜制劑或2，000cp -3,000,OOOcp的油包醇體系，本領(lǐng)域技術(shù)人員都熟知，這些體系并不是真正意義上的透明均勻的溶液，所用的乳化劑ABIL EM90，按產(chǎn)品說(shuō)明僅限于在化妝品中應(yīng)用，并不能藥用，并且12-羥基硬脂酸被美國(guó)FDA 列為間接食品添加劑(用于食品容器和包裝材料)，并不能直接做為藥物輔料使用。另外，CN200810100726.7中含有大量的多元醇(40 — 80wt%,)，難以顯著的提高維生素C的脂溶性。
[0004]專利CN98126744.0和CN200910027809.2均是通過(guò)基因突變的方式，對(duì)蛋白酶進(jìn)行改造，生產(chǎn)出可以穩(wěn)定存在于非水介質(zhì)中的蛋白酶變異體。M.Hashimoto將棕櫚酸以共價(jià)結(jié)合的方式連接到胰島素分子上，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)修飾后的胰島素，脂溶性及跨膜能力顯著增加(M.Hashimoto, etal.(1992) J.Pharm.Pharmacol.44:555-559)。但是，這些技術(shù)手段的共性是產(chǎn)業(yè)化成本高，并且伴有藥物結(jié)構(gòu)的改變，這有可能改變藥物分子的毒理、藥理。相對(duì)而言，通過(guò)制劑的手段，增加親水分子的脂溶性，具有安全高效的特點(diǎn)。
[0005]通過(guò)脂質(zhì)體技術(shù)，或形成藥物與磷脂等物質(zhì)的復(fù)合物，能夠?qū)⒂H水物質(zhì)包裹于疏水介質(zhì)中，從而提高藥物分子的脂溶性及穩(wěn)定性。相關(guān)研究請(qǐng)見(jiàn)JP Colletier, etal.(2002)BMC Biotechnol.2:9-16;CN1421246A,張磊，等，2009,《藥學(xué)與臨床研究》17:81-84 ；F.D.Cui, et a 1.(2006) J CONTROL RELEASE.114:242 — 250 ;D.Y.Lee, etal.(2007) J CONTROL RELEASE.123:39-45。然而在這些研究中，蛋白質(zhì)、低分子量肝素等親水性物質(zhì)，并沒(méi)有真正溶解在疏水相中，并且整個(gè)體系也以固態(tài)呈現(xiàn)，而非是一種單相、穩(wěn)定、澄清的液體溶液。另外，就工藝流程而言，上述技術(shù)方案均需要通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥等手段除去溶劑，因而增加了設(shè)備成本和生產(chǎn)成本。
[0006]專利US5719039獲得了一種含有蛋白酶的非水溶液，其是在合適的pH條件下，將含有蛋白酶的水溶液和含有Aerosol OT的異辛烷溶液混合，待形成蛋白酶與表面活性劑的離子復(fù)合物后，通過(guò)萃取的方法除去水相，溶解在有機(jī)相中的蛋白酶與表面活性劑離子復(fù)合物經(jīng)過(guò)干燥后，可以溶解在丙酮等有機(jī)溶劑中形成穩(wěn)定的單相溶液。但是在醫(yī)藥領(lǐng)域，有機(jī)溶劑有著嚴(yán)格的殘留量限制。
[0007]專利CN01115327.X所公開(kāi)的技術(shù)方案，系將含有胰島素的水溶液與雙親物質(zhì)混合，最終獲得含有胰島素的油相溶液。類似的AmaniElsayed將含有胰島素-殼聚糖復(fù)合物的水溶液，與雙親物質(zhì)混合，最終獲得含有胰島素的油相溶液。Amani Elsayed, etal.(2009)EUR.J.PHARM.B10PHARM.73:269 - 279。由于以水相作為親水性物質(zhì)(如胰島素)的分散介質(zhì)，并且上述制劑并沒(méi)有去除水分的步驟，可見(jiàn)這些制劑并不屬于親水分子的疏水制劑，而是油包水(W/0)型乳劑。[0008]R.R.C.紐在專利 CN97193180.1、CN97196069.0 所公開(kāi)的技術(shù)方案，以及 C.L.Li的研究(C.L.Li, et al.(2004) J.Pharma.Pharmaco 1.56:1101-1107)，其疏水性溶液得以實(shí)現(xiàn)有兩個(gè)必不可少的步驟:以水相為分散介質(zhì)，將親水性物質(zhì)溶解在水相中；水相與含有雙親介質(zhì)的疏水相混合后，以及通過(guò)冷凍干燥方法等干燥手段除去水分。從這些制備步驟來(lái)看，上述疏水溶液的制備方法，均是將W/0型制劑中的水分，借助冷凍干燥等手段去除水分，這與本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的凍干乳制劑的制備方法并無(wú)二異。另一方面，在去除水分過(guò)程中，冷凍干燥法高能耗且生產(chǎn)效率低，而其它諸如噴霧干燥法等干燥手段，又會(huì)對(duì)穩(wěn)定性差的藥物(如蛋白質(zhì))造成影響。
[0009]一種理想的親水性分子疏水制劑，是制備工藝簡(jiǎn)單、無(wú)需特殊設(shè)備、成本低廉，且所使用的輔料是不會(huì)帶來(lái)安全隱患的物質(zhì)。更重要的是，親水性分子不以水或水溶液為分散介質(zhì)，疏水制劑中親水性分子的活性不僅不會(huì)丟失，而且能夠在較長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)保持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，得到了一種含有蛋白和/或多肽的疏水溶液，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該疏水溶液能夠有效地解決蛋白和/或多肽脂溶性低的問(wèn)題。本發(fā)明的制備過(guò)程不需要水或水溶液參與，所得的含蛋白和/或多肽的分散介質(zhì)，可以直接與疏水相混合，由此獲得單相、透明穩(wěn)定的液體溶液。本發(fā)明人還驚奇地發(fā)現(xiàn)，蛋白和/或多肽在由此獲得的疏水溶液中，脂溶性及跨膜能力得到顯著改善，并且生物活性在室溫下能夠保持長(zhǎng)久地穩(wěn)定性，沒(méi)有發(fā)生降解或生物活性丟失的現(xiàn)象。由此提供了下述發(fā)明:
[0011]本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種含蛋白或多肽的疏水溶液，包括作為主藥的蛋白和/或多肽、水溶性助溶劑、乳化劑以及油相。
[0012]優(yōu)選地，所述蛋白和/或多肽為親水性的蛋白和/或多肽(即在水溶液中能夠維持穩(wěn)定構(gòu)象，并保持生物學(xué)功能)。
[0013]所述蛋白和/或多肽可以從生物機(jī)體中分離獲得，也可以通過(guò)基因工程手段或有機(jī)合成方式獲得。
[0014]根據(jù)本發(fā)明任一項(xiàng)所述的疏水溶液，其中，所述蛋白和/或多肽的分子量為I 一200kDa ;優(yōu)選為2 — IOOkDa ;更優(yōu)選為3 — 60kDa，特別優(yōu)選為4 — 55kDa。[0015]為了更好地說(shuō)明，本發(fā)明實(shí)施例中以胰島素、PTH1-34、GLP-1為多肽代表，其分子量小于6kDa;以胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、尿激酶等作為大分子蛋白質(zhì)代表，其中尿激酶的分子量最大，約為54kDa。它們的具體分子量如下面的表1所示。
[0016]表1:部分蛋白或多肽的分子量和等電點(diǎn)
【權(quán)利要求】
1.一種含蛋白或多肽的疏水溶液，包括作為主藥的蛋白和/或多肽、水溶性助溶劑、乳化劑以及油相。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疏水溶液，其特征在于如下的(I)一(17)項(xiàng)中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng): (1)所述蛋白和/或多肽為親水性蛋白和/或多肽； (2)所述蛋白和/或多肽的分子量為I一 200kDa ;優(yōu)選為2 — IOOkDa ;更優(yōu)選為3 —60kDa，特別優(yōu)選為4 - 55kDa ； (3)所述蛋白和/或多肽選自降鈣素、胰島素、GLP-1(胰高血糖素樣肽-1)、甲狀腺素、甲狀旁腺激素、生長(zhǎng)激素、干擾素、尿激酶、蚓激酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、沙雷肽酶、溶葡萄球菌酶、溶菌酶和過(guò)氧化物酶中的任一種或多種；具體地，所述降鈣素選自鮭魚降鈣素、鰻魚降鈣素和人降鈣素中的任意一種或多種；具體地，所述胰島素選自豬胰島素、牛胰島素和人胰島素中的任意一種或多種；具體地，所述甲狀旁腺激素選自人體甲狀旁腺激素1-84和人甲狀旁腺激素1-34中的任意一種或多種；具體地，所述生長(zhǎng)激素選自豬生長(zhǎng)激素、牛生長(zhǎng)激素和人生長(zhǎng)激素中的任意一種或多種； (4)所述蛋白和/或多肽的含量為0.001 - 5% (w/w);優(yōu)選為`0.01 — 2% (w/w)或`0.05 — 2% (w/w);更優(yōu)選為 0.05 — I % (w/w)>0.1 — I % (w/w)或 0.15 — I % (w/w)；進(jìn)一步優(yōu)選為 0.1 — 0.8% (w/w)或 0.15 — 0.8% (w/w)； (5)所述水溶性助溶劑選自乙醇、1,2-丙二醇、甘油、二甲基亞砜、PEG200、PEG300和PEG400中的任意一種或多種； (6)所述水溶性助溶劑的含量為0.1 - 15% (w/w);優(yōu)選為3 - 12% (w/w);更優(yōu)選為 5 — 12% (w/w)； (7)所述乳化劑為一種或多種的HLB大于或等于4并且小于或等于9的乳化劑，或者為一種或多種的HLB大于或等于12的乳化劑；優(yōu)選地，所述乳化劑為一種或多種的HLB大于或等于4并且小于或等于9的乳化劑；更優(yōu)選地，所述乳化劑為一種或多種的HLB大于或等于6并且小于或等于9的乳化劑；特別優(yōu)選地，所述乳化劑為兩種或兩種以上的HLB大于或等于6并且小于或等于9的乳化劑； (8)所述乳化劑選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、司盤20、司盤60、司盤80、吐溫20、吐溫`80、聚甘油-6- 二油酸酯、聚甘油油酸酯、聚乙二醇-6-甘油單油酸酯、聚乙二醇-6-甘油亞油酸酯、聚乙二醇十二羥基硬脂酸酯、聚氧乙烯醚(35)蓖麻油、聚氧乙烯醚(40)氫化蓖麻油、生育酚聚乙二醇琥珀酸酯、聚乙二醇辛酸/癸酸甘油酯和月桂酸聚乙二醇甘油酯中的任意一種或多種； (9)所述乳化劑包含乳化劑I和乳化劑2，其中，乳化劑I為大豆卵磷脂和/或蛋黃卵磷月旨，乳化劑2選自聚甘油-6- 二油酸酯、聚甘油油酸酯`、聚乙二醇-6-甘油單油酸酯、聚乙二醇十二羥基硬脂酸酯和聚乙二醇辛酸/癸酸甘油酯中的任意一種或多種；優(yōu)選地，乳化劑I的含量為7.5 — 10% (w/w)，乳化劑2的含量為2.5 — 5% (w/w)； (10)所述乳化劑的含量為O— 40% (w/w);優(yōu)選為I 一 25% (w/w);更優(yōu)選為5 —25% (w/w);進(jìn)一步優(yōu)選為 5 — 20% (w/w)或 5 — 18% (w/w)； (11)所述油相選自所述油相選自中鏈脂肪酸酯、大豆油、玉米油、花生油、紅花油、橄欖油、油酸、維生素E、維生素A和油凝膠中的任意一種或多種；(12)所述油相的含量為45- 95% (w/w);優(yōu)選為65 — 90% (w/w);更優(yōu)選為70 —90% (w/w)或 80 — 90% (w/w)； (13)其還包含pH調(diào)節(jié)劑，所述pH值調(diào)節(jié)劑選自鹽酸、硫酸、乳酸、醋酸、枸櫞酸、磷酸、三乙胺、氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉中的一種或多種；(14)所述疏水溶液不含水，或者水的含量低于1.0% (w/w)，優(yōu)選低于0.5% (w/w)； (15)所述疏水溶液的制備過(guò)程中不使用水或含水溶液； (16)所述疏水溶液的制備過(guò)程不包含除去或者降低水分的步驟(例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、噴霧干燥或冷凍干燥); (17)所述疏水溶液為單相溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疏水溶液，其組分和含量如下面的I) 一 7)組中的任意一組所示:
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的疏水溶液，其組分和含量如下面的(I) - (7)組中的任意一組所示:
(!)重組人贐島素M毫克二甲基亞砜I克I摩爾*酸30微克 中健脂翁酸甘_三酯(Croda_l GTCC)8克 聚乙二醇辛酸/癸酸甘油睛0.2克大豆卵磷鷹0.8克聚甘油油酸酯0.2克；(2)PTH1-3460 亳克丙二醇I見(jiàn)太豆油I4克 大豆卵磚脂(Epikuron 170?Degussa) 0.S 克聚甘油油酸酯0.3克； (3)GLP-120 亳克雨二醇O, 3克 辛酸癸酸甘油酯(Miglyol 812, SASOL)5克 太豆卵鱗脂《Bpikuron 17(1,Degussa) 0.5 克 聚乙二醇十二鋒基璦I旨酸_0.2克；(4)龜?shù)鞍酌?0亳克甘油I免 辛酸癸酸甘油酯(Miglyol 812, SASOL)14克聚甘油油酸酯1.5克大I卵磷廳0.5克；(5)
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的疏水溶液的制備方法，包括下述步驟: 1)在4一 25°C，將蛋白和/或多肽加入水溶性助溶劑，在400 - 1500rpm條件下，攪拌至形成透明清亮溶液； 2)在20- 80°C條件下，將油相與乳化劑相混合，并在200 - 8000rpm攪拌條件下持續(xù)攪拌，直至整個(gè)體系呈透明清亮狀； 3)在4一 37°C條件下，將步驟I)產(chǎn)物，加入步驟2)產(chǎn)物中，并在200 — 800rpm條件下繼續(xù)攪拌，直至形成單相、透明清亮的均勻制劑，最終獲得含蛋白和/或多肽的疏水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其中，所述制備方法不包含使用水或含水溶液的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其中，所述制備方法不包含除去或者降低水分的步驟(例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、噴霧干燥或冷凍干燥)。
8.—種藥物制劑，其包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的疏水溶液，或者由權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的疏水溶液制得；具體地，所述藥物制劑為口服液、注射液、軟膠囊、乳劑、納米顆?；蚣{米膠囊。
9.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的疏水溶液在制備以蛋白或多肽為有效成分的藥物、化妝品或保健食品中的用途。`
【文檔編號(hào)】A61K38/26GK103861090SQ201210550294
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
【發(fā)明者】馬二利, 鄭昌學(xué) 申請(qǐng)人:美迪思生物科技(北京)有限公司