專利名稱：一種兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅納米藥物載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及一種多功能醫(yī)藥納米載體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
經(jīng)過半個多世紀(jì)的探索與發(fā)展，智能藥物控制釋放系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域充分展示了其潛在的應(yīng)用價值。控釋給藥也逐漸成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一個重要分支，其橫跨了工程技術(shù)、組織工程、生物材料與臨床醫(yī)學(xué)等多類交叉學(xué)科。Robert Langer等開創(chuàng)的微機(jī)電給藥系統(tǒng)，利用外界遠(yuǎn)程信號實現(xiàn)系統(tǒng)的體內(nèi)控制釋放。然而，系統(tǒng)釋放出來的藥物分子不能特異性的識別靶細(xì)胞，藥物分子大部分分布于正常組織并被正常細(xì)胞所攝??；而病變組織中的藥物分布較少，造成藥物遞送效力較低，增加了藥物在體內(nèi)的毒副作用。因此，研究人員都在尋找特定的生物材料作為藥物載體，設(shè)計更加新型的藥物控制釋放系統(tǒng)，提高功能藥物被病變細(xì)胞攝入的效率。納米技術(shù)的迅速發(fā)展為制備并設(shè)計新型的智能藥物釋放系統(tǒng)提供了可能性。納米粒子和納米膠囊是指粒徑分布在10-100納米之間的固態(tài)膠體粒子，可通過細(xì)胞吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)。因此，研究人員通過整合藥物化學(xué)和納米技術(shù)，設(shè)計新型的納米控制釋放系統(tǒng)，努力提高活性藥物分子被細(xì)胞攝入的效率。藥物分子可以通過物理作用(擴(kuò)散作用、吸附作用)或化學(xué)作用(親疏水性作用、化學(xué)交聯(lián)作用)粘附在納米顆粒的表面，形成藥物分子/納米顆粒的復(fù)合系統(tǒng)。這類納米藥物控釋系統(tǒng)可實現(xiàn)藥物的緩釋，并提高藥物的細(xì)胞攝入率。納米藥物控制釋放系統(tǒng)的研究是傳統(tǒng)藥物制劑的進(jìn)一步深化和發(fā)展，屬于當(dāng)今最前沿的研究領(lǐng)域之一。其具有較好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景，尤其在抗腫瘤領(lǐng)域已獲得了較好的臨床效果，該學(xué)科已促進(jìn)了藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料、化學(xué)、生物、等領(lǐng)域多學(xué)科的交叉與融合。為了促使納米控制釋放系統(tǒng)具有更好的療效，并減少毒副作用；相關(guān)材料科學(xué)家、生物學(xué)家及臨床醫(yī)生都在共同努力設(shè)計一種新型的智能控釋系統(tǒng)，使其不僅能特異性識別靶位組織，還能針對病變細(xì)胞實行特定信號的定向“爆破”。具體來說，就是其能在特定的時亥IJ，以合適的速率，將所需劑量的藥物導(dǎo)入人體所需要的部位，即藥物定點、定時、定量地釋放，充分的利用了藥物的療效，避免藥物積累中毒，減輕藥物的毒副作用，達(dá)到治愈的目的。介孔硅納米材料是一種孔徑在2_50nm范圍內(nèi)的材料，其比表面積大(通常為900g/cm_3)、表面特性活潑(豐富的-0H)，是一種很好的生物相容性藥物載體。但是，采用介孔硅納米材料制備兼具還原響應(yīng)性和靶向性的藥物載體時，需要通過多個工藝步驟來進(jìn)行表面修飾。目前，在制備介孔硅納米材料藥物載體的領(lǐng)域中，由于工藝的原因，往往還原響應(yīng)性和靶向性難以兼顧，而且轉(zhuǎn)化率較低，藥物的性能不盡人意。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明旨在構(gòu)建一種兼具細(xì)胞特異性靶向性和還原性物質(zhì)/酶響應(yīng)性的介孔硅/膠原一乳糖酸多功能復(fù)合型控釋系統(tǒng)。該方法具有操作簡單、成本低廉、通用性強(qiáng)，不需要特殊設(shè)備。利用該方法制備的多功能性介孔硅/膠原分子納米復(fù)合材料具有較好的細(xì)胞相性；其能被肝癌細(xì)胞所特異性識別，并能在細(xì)胞內(nèi)還原響應(yīng)性酶(谷胱甘肽)的作用下實現(xiàn)定向“爆破”，在抗癌治療領(lǐng)域具有廣闊的臨床應(yīng)用價值。為實現(xiàn)本發(fā)明目的而采用的技術(shù)方案是這樣的，一種兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅納米藥物載體的方法，其特征在于，包括以下步驟
a.制備介孔娃納米顆粒；
b.采用3-氨基丙基硅烷偶聯(lián)劑修飾步驟a所得的介孔硅納米顆粒，獲得氨基化介孔娃納米顆粒；
c.配置丁二酸酐和丙酮的混合液，所述丁二酸酐和丙酮的混合液中丁二酸酐的濃度為I 2 mol/L ;將步驟b中獲得的氨基化的介孔硅納米復(fù)合材料按重量體積比O. 0075 O. 015g/mL加入到丙酮中，室溫下攪拌3 6 h后，逐滴加入過量的所述丁二酸酐和丙酮的混合液，攪拌18 36 h，洗滌、離心分離、烘干后獲得白色粉末狀的羧基化的介孔硅納米材 料；
d.采用胱胺分子功能化步驟c所得的羧基化介孔硅納米顆粒，制備出二硫鍵修飾的介孔娃納米顆粒；
e.將藥物負(fù)載到步驟d所獲得的二硫鍵修飾的介孔硅納米顆粒內(nèi)，再采用膠原分子封堵所述二硫鍵修飾的介孔硅納米顆粒，制備出介孔硅/膠原分子還原響應(yīng)性納米復(fù)合系統(tǒng)；
f.采用乳糖酸分子功能化步驟e所得的介孔硅/膠原分子納米復(fù)合系統(tǒng)，制備出兼具細(xì)胞特異性靶向性和還原響應(yīng)性的介孔硅/膠原-乳糖酸多功能復(fù)合型納米藥物載體系統(tǒng)。制備介孔硅納米顆粒在本領(lǐng)域中具有多種方法，但是，所采用的工藝方法對介孔的孔徑、表面活性等有重要影響。本發(fā)明公開一種制備介孔硅納米顆粒的詳細(xì)工藝，即所述步驟a中，所述制備介孔硅納米顆粒是將十六烷基三甲基溴化銨與氫氧化鈉均勻分散至二蒸水中獲得混合溶液，對混合溶液攪拌并加熱至70 90°C后，采用勻速加樣器將正硅酸四乙酯逐滴加入至所述混合溶液中，并劇烈攪拌2 h，獲得白色懸濁液。將所述白色懸濁液均勻分散于甲醇和鹽酸的混合液之中，劇烈攪拌后，于水浴鍋中回流48h，獲得介孔二氧化硅納米顆粒。本步驟中，所述十六烷基三甲基溴化銨、氫氧化鈉與正硅酸四乙酯的重量比為I O. I O. 3 3 6。作為優(yōu)選步驟b中選用3-氨丙基三甲氧基硅烷來實現(xiàn)介孔硅納米顆粒的氨基化，即所述制備氨基化介孔硅納米顆粒是將步驟a中所獲得的介孔二氧化硅納米顆粒按重量體積比O. 01 O. 3g/mL均勻分散在甲苯中，攪拌24h后,加入3-氨丙基三甲氧基娃燒,于55 65°C的水浴鍋中回流36 h，離心即得到氨基化的介孔硅納米復(fù)合材料。本步驟中，所述甲苯與3-氨丙基三甲氧基硅烷的體積比為70 100 O. 75 I. 5。本發(fā)明中,將介孔娃納米材料羧基化是進(jìn)一步獲得二硫鍵修飾的介孔娃納米顆粒的必經(jīng)環(huán)節(jié)。然而，將介孔硅納米材料羧基化較為困難，且轉(zhuǎn)化率較低。本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%的將介孔硅納米材料羧基化的方法。即所述步驟c是將O. 15g O. 3g的氨基化的介孔硅納米材料均勻分散在丙酮溶液中，并于室溫下攪拌3 6 h。然后，逐滴加入過量的I 2 mol/L的丁二酸酐和丙酮混合液，并在室溫下繼續(xù)攪拌18 36 h后離心獲得白色粉末。最后，用雙蒸水和無水乙醇分別洗滌離心得到白色粉末，除去殘留溶劑，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅納米材料。作為優(yōu)選，所述步驟c是將O. 2 g氨基化的介孔硅納米材料均勻分散在20 mL的丙酮溶液中，并于室溫下攪拌4 h。然后，逐滴加入10 mL 丁二酸酐濃度為1.5 mol/L的丁二酸酐和丙酮混合液，并在室溫下繼續(xù)攪拌24 h后離心獲得白色粉末。最后，用雙蒸水和無水乙醇分別洗滌離心得到白色粉末，除去殘留溶劑，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔娃納米材料。采用丁二酸酐處理后所獲得的羧基化的介孔硅納米材料中，羧基的活性較低。因此，為了提高轉(zhuǎn)化率，步驟d中，需要先將步驟c所得的羧基化的介孔硅納米材料、I-乙基-3- [3- 二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸化物和N-羥基琥珀酰亞胺共同溶解在pH=5 6的PBS緩沖液中，攪拌3 h，以活化所述羧基化的介孔硅納米材料的羧基。再將過量的胱 胺鹽酸鹽加入到活化后的所述羧基化的介孔硅納米材料溶液中，室溫下攪拌36 48h后離心。最后，用雙蒸水和無水乙醇洗滌所述離心操作所獲得的產(chǎn)物，在高度真空中干燥后即得到所述二硫鍵功能化介孔娃納米材料。制備出二硫鍵功能化介孔硅納米材料即完成了載體的制備，在進(jìn)行封堵前，需要將藥物負(fù)載到載體上。本發(fā)明的載體可以負(fù)載多種類型的藥物。問了驗證效果，本發(fā)明以異硫氰酸熒光素(FITC)作為標(biāo)記“藥物”，先將O. 514 mM的FITC溶解于30 mL的pH =6.0的PBS緩沖溶液中，再加入步驟d所獲得的二硫鍵修飾的介孔硅納米顆粒，使得FITC負(fù)載到所述二硫鍵修飾的介孔硅納米顆粒內(nèi)。之后將膠原、I-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸化物、N-羥基琥珀酰亞胺和負(fù)載了 FITC的二硫鍵修飾的介孔硅納米顆粒在溶液中混合，室溫攪拌24 h，離心得到的產(chǎn)物即為還原響應(yīng)性介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)。本步驟中，所述二硫鍵修飾的介孔硅納米顆粒、膠原、I-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸化物和N-羥基琥珀酰亞胺的重量比為60 90 15 25 8 12 3 6。步驟f中，是先將50 70 mg的乳糖酸、25 35 mg的I-乙基_3-[3_ 二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸化物和10 20 mg的N-輕基琥拍酰亞胺共同溶解于3 5 mL的pH=5. 5 6. 5的PBS溶液中獲得混合物，室溫攪拌4 6 h，以活化所述乳糖酸的羧基。之后，將本步驟中所述混合物加至步驟e所獲得的介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)溶液中，攪拌18 24 h后，離心并使用pH=7. O 7. 4的PBS緩沖溶液充分洗滌，即得到乳糖酸功能化的還原響應(yīng)性細(xì)胞靶向介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)。本發(fā)明還包括采用上述方法獲得的兼具還原響應(yīng)性和靶向性的多功能復(fù)合型介孔娃納米藥物載體。本發(fā)明的有益效果在于該方法具有操作簡單、成本低廉、通用性強(qiáng)，不需要特殊設(shè)備。利用該方法制備的多功能性介孔硅/膠原分子納米復(fù)合材料具有較好的細(xì)胞相容性。其能被肝癌細(xì)胞所特異性識別，并能在細(xì)胞內(nèi)還原響應(yīng)性酶(谷胱甘肽)的作用下實現(xiàn)定向“爆破”，在抗癌治療領(lǐng)域具有廣闊的臨床應(yīng)用價值。


圖I為介孔硅納米顆粒和介孔硅/膠原一乳糖酸納米復(fù)合顆粒的特征圖A和B分別為介孔硅納米顆粒和介孔硅/膠原一乳糖酸納米復(fù)合顆粒的透射電鏡形貌圖；C和D分別是修飾后介孔硅納米顆粒的吸附等壓線相對壓力變化和孔徑變化的特征 圖2為介孔硅/膠原一乳糖酸納米復(fù)合系統(tǒng)的還原響應(yīng)性釋放特性圖A是系統(tǒng)的還原響應(yīng)性釋放特性圖(DTT刺激)；B是還原響應(yīng)性脈沖式釋放特性(DTT刺激)；C是系統(tǒng)的長時間還原響應(yīng)性釋放特性；
圖3為共聚焦監(jiān)控對照組(無納米顆粒，al_a3)、介孔硅納米顆粒(bl_b3)和介孔硅/膠原一乳糖酸納米復(fù)合顆粒(cl-c3)被細(xì)胞吞噬后的胞內(nèi)分布狀況；
圖4為細(xì)胞流式儀監(jiān)控肝癌細(xì)胞與納米顆粒間的相互作用特性A為肝癌細(xì)胞吞噬FITC熒光分子、MSNsiFITC納米顆粒和LA-Col-Iinker_MSNs@FITC納米復(fù)合顆粒后的熒光 定量分析為肝癌細(xì)胞(IfepG2)和內(nèi)皮細(xì)胞(EC)吞噬LA-Col-Iinker-MSNs@FITC納米復(fù)合顆粒后的熒光定量分析。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不應(yīng)該理解為本發(fā)明上述主題范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段，作出各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明采用溶膠凝膠和模板法制備單分散的具有規(guī)則孔道結(jié)構(gòu)的介孔硅納米材料；而后利用化學(xué)修飾方法，在介孔硅納米材料表面構(gòu)建出具有多生物功能的介孔硅/膠原-乳糖酸復(fù)合納米顆粒。在制備過程中，諸多因素可以影響介孔硅納米材料顆粒的合成，例如反應(yīng)溶液(水)的體積、水解主體(正硅酸四乙酯)和表面活性劑(十六烷基三甲基溴化銨)的濃度以及反應(yīng)溫度和PH條件等，不同的制備方法可得到具有不同形貌特征的介孔硅納米材料。本發(fā)明對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行了考察，包括不同比例的反應(yīng)物(正硅酸四乙酯和正硅酸四乙酯在水溶液中的濃度)和反應(yīng)條件等。結(jié)果顯示，當(dāng)十六烷基溴化銨/正硅酸四乙酯/水之間的質(zhì)量比小于I :10 :480或小于5 :10 :480的時候，制備的納米顆粒不具有規(guī)則的介孔硅結(jié)構(gòu)；當(dāng)反應(yīng)體系的溫度低于60°C或pH小于9. 5的時候，納米顆粒的制備過程比較緩慢；而當(dāng)將十六烷基溴化銨/正硅酸四乙酯/水之間的質(zhì)量比控制在I :5: 480的時，反應(yīng)溫度置于80°C，pH條件置于11的條件時候，可以制備出具有規(guī)則孔道結(jié)構(gòu)的介孔硅納米材料；因此，本發(fā)明的反應(yīng)主體優(yōu)選十六烷基三級基溴化銨/正硅酸四乙酯/水的質(zhì)量比為I :5: 480,反應(yīng)溫度置于80°C, pH條件置于11。實施例I
本實施例主要包括以下步驟
a.利用溶膠凝膠和模板法制備出單分散的介孔硅納米顆粒；
b.采用3-氨基丙基硅烷偶聯(lián)劑修飾步驟a所得的介孔硅納米顆粒，制備氨基化的介孔娃納米顆粒；
c.采用琥珀酸酐與步驟b所得的氨基化介孔硅納米顆粒反應(yīng)，制備出羧基化的介孔硅納米顆粒；
d.采用胱胺分子(富含二硫鍵)功能化步驟C所得的羧基化介孔硅納米顆粒，制備出二硫鍵修飾的介孔娃納米顆粒；
e.采用膠原分子封堵步驟d所得的二硫鍵功能化介孔硅納米顆粒，制備出介孔硅/膠原分子還原響應(yīng)性納米復(fù)合系統(tǒng)；f.采用乳糖酸分子功能化e所得的介孔硅/膠原分子納米復(fù)合系統(tǒng)，制備出兼具細(xì)胞特異性靶向性和還原響應(yīng)性的介孔硅/膠原-乳糖酸多功能復(fù)合型納米藥物載體系統(tǒng)。優(yōu)選的，所述步驟a是將20(T800 mL的水溶液作為反應(yīng)溶劑，O. 5^2g的雙親性表面活性劑(十六烷基三甲基溴化銨，CTAB)作為模板劑，堿性條件(pH=lf 13)和反應(yīng)溫度作為反應(yīng)控制條件(75°C 85°C)，通過正硅酸四乙酯的水解而合成。而后，將上述制備的帶有表面活性劑介孔硅納米材料(CTAB@MSNs)均勻分散于10(Tl50 mL的甲醇/鹽酸(V V=9 1)混合液中。劇烈攪拌后，將上述溶液置于65 80°C的水浴鍋中回流36 48h，即可有效地抽取表面活性劑(CTAB)，得到規(guī)則孔道結(jié)構(gòu)的介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs)。更優(yōu)選的是，所述步驟a是將Ig十六烷基三甲基溴化銨與O. 28 g氫氧化鈉均勻分散至480 mL 二蒸水中，劇烈攪拌并加熱至80°C。用勻速加樣器逐滴加入5 g正硅酸四乙酯至上述溶液中，并劇烈攪拌2 h，直至混合液成為白色懸濁液。而后，制備的帶有表面活性 劑的介孔硅納米材料(CTAB^SNs)均勻分散于150 mL的甲醇/鹽酸(135 mL 15 mL)混合液中。劇烈攪拌后，將上述溶液置于80°C的水浴鍋中回流48h，即可有效地抽取表面活性劑(CTAB)，得到規(guī)則孔道結(jié)構(gòu)的介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs)。優(yōu)選的，所述步驟b是利用3-氨基丙基硅烷偶聯(lián)劑功能化步驟a得的介孔硅納米顆粒；簡單來說就是將I. (Γ2. Og的帶有表面活性劑的介孔硅納米材料(CTAB麵SNs)均勻分散在70 mL^lOO mL的甲苯混合液中。劇烈攪拌24 h后，加入O. 75 I. 5 mL的的3-氨丙基三甲氧基硅烷，并置于55-65°C的水浴鍋中回流36 48 h，離心即得到氨基化的介孔硅納米復(fù)合材料(CTAB@MSNs-APTS)。更為優(yōu)選的，所述步驟b是利用3-氨基丙基硅烷偶聯(lián)劑功能化步驟a得的介孔硅納米顆粒；簡單來說將I. 5g的帶有表面活性劑的介孔硅納米材料(CTAB麵SNs)均勻分散在85 mL的甲苯混合液中。劇烈攪拌24 h后，加入I mL的的3-氨丙基三甲氧基硅烷，并置于60°C的水浴鍋中回流36 h，離心即得到氨基化的介孔硅納米復(fù)合材料(CTAB0MSNs-APTS)。優(yōu)選的，所述步驟c是將O. 15g^0. 3g的氨基化的介孔硅納米材料(APTS-MSN)均勻分散在丙酮溶液中，并于室溫下攪拌:Γ6 h。然后，逐滴加入過量的廣2 mol/L的琥珀酸酐/丙酮混合液，并在室溫下繼續(xù)攪拌18 36 h。最后，分別用雙蒸水和無水乙醇充分洗滌離心得到白色粉末，除去殘留溶劑，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅納米材料(COOH-MSNs)。更為優(yōu)選的，所述步驟c是將O. 2 g氨基化的介孔硅納米材料(APTS-MSNs)均勻分散在20 mL的丙酮溶液中，并于室溫下攪拌4 h。然后，逐滴加入10 mL 1.5 mol/L琥珀酸酐/丙酮混合液，并在室溫下繼續(xù)攪拌24 h。最后，分別用雙蒸水和無水乙醇充分洗滌離心得到白色粉末，除去殘留溶劑，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅納米材料(COOH-MSNs)。優(yōu)選的，所述步驟d是將0. lg^O. 15g羧基化介孔納米材料(C00H-MSNs)，
0.015^0. 02mol的I-乙基_3_[3-二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸化物(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)共同溶解在20 30 mL的PBS緩沖液中(pH=5 6)，并攪拌3 h，活化介孔硅納米材料的羧基。其次，將過量的I. (Γ2. O g胱胺鹽酸鹽加入上述溶液，并在室溫下攪拌36 48h。最后，用雙蒸水和無水乙醇洗滌上述溶液的離心產(chǎn)物，并在高度真空(< 1000 Pa)中干燥，除去介孔內(nèi)殘留的溶劑，即得到二硫鍵功能化介孔硅納米材料。更為優(yōu)選的，所述步驟d是將O. Ig羧基化介孔納米材料(COOH-MSNs)，O. 015 mol的I-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸化物(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)共同溶解在20 mL的PBS緩沖液中(pH=5)，并攪拌3 h，活化介孔硅納米材料的羧基。其次，將I g胱胺鹽酸鹽加入上述溶液，并在室溫下攪拌36 h。最后，用雙蒸水和無水乙醇洗滌上述溶液的離心產(chǎn)物，并在高度真空(< 1000 Pa)中干燥，除去介孔內(nèi)殘留的溶劑，即得到二硫鍵功能化介孔娃納米材料。優(yōu)選的，所述步驟e是將O. 5 O. 6 mM的FITC溶解于25 40mL PBS (pH=5. 5 6· 5)緩沖溶液中。加入7(T90 mg 二硫鍵功能化的介孔硅納米材料，攪拌18 24h。最后，將18 25mg膠原，8-12 mg EDC和4 6 mg NHS共同加入到上述混合緩沖液中，室溫攪拌18 24 h。離 心得到的產(chǎn)物即為還原響應(yīng)性介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)，記為Col-Iinker-MSNs。更為優(yōu)選的，所述步驟e是將O. 514 mM的FITC溶解于30 mL PBS (pH 6. O)緩沖溶液中。而后，加入80 mg 二硫鍵功能化的介孔娃納米材料,攪拌24h。最后,將20 mg膠原，10 mg EDC和5 mg NHS共同加入到上述混合緩沖液中，室溫攪拌24 h。離心得到的產(chǎn)物即為還原響應(yīng)性介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)，記為Col-Iinker-MSNs。優(yōu)選的，所述步驟f是將50 70 mg乳糖酸、25-35 mg EDC以及10-20 mg NHS共同溶解于3 5 mL PBS溶液中(pH=5. 5飛.5)，室溫攪拌4飛h，活化乳糖酸的羧基。而后，將上述混合液加至介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)溶液中。攪拌18 24 h后，離心并使用PBS緩沖溶液(ρΗ=7. (Γ7. 4)洗滌多次，即得到乳糖酸功能化的還原響應(yīng)性細(xì)胞靶向介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)。標(biāo)記為 LA-Col-Iinker-MSNs。更為優(yōu)選的，所述步驟f是將60 mg乳糖酸、30mg EDC以及15mg NHS共同溶解于4 mL PBS溶液中(pH=6.0)，室溫攪拌4 h，活化乳糖酸的羧基。而后，將4 mL上述混合液加至介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)溶液中。攪拌24 h后，離心，PBS緩沖溶液(pH 7. O)洗滌10次，即得到乳糖酸功能化的還原響應(yīng)性細(xì)胞靶向介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)。標(biāo)記為LA-Col-Iinker-MSNs。實施例2
本實施例制備兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅/膠原-乳糖酸多功能納米復(fù)合顆粒的制備。包括以下步驟a.介孔硅納米顆粒的合成首先，將Ig十六烷基三甲基溴化銨與
O.28 g氫氧化鈉均勻分散至480 mL 二蒸水中，劇烈攪拌并加熱至80°C。用勻速加樣器逐滴加入5 g正硅酸四乙酯至上述溶液中，并劇烈攪拌2 h，直至混合液成為白色懸濁液。而后，制備的帶有表面活性劑的介孔硅納米材料(CTAB麵SNs)均勻分散于150 mL的甲醇/鹽酸(135 mL 15 mL)混合液中。劇烈攪拌后，將上述溶液置于80°C的水浴鍋中回流48h，即可有效地抽取表面活性劑(CTAB)，得到規(guī)則孔道結(jié)構(gòu)的介孔二氧化硅納米顆粒(MSNs)。b.氨基功能化介孔娃納米顆粒的合成首先,將a步驟所得的I. 5g納米顆粒(CTABi MSNs)均勻分散在85 mL的甲苯混合液中。劇烈攪拌24 h后，加入I mL的的3-氨丙基三甲氧基硅烷，并置于60°C的水浴鍋中回流36 h，離心即得到氨基化的介孔硅納米復(fù)合材料(MSNs-APTS)。c :羧基功能化介孔娃納米顆粒的制備首先，將b步驟所得的O. 2g納米材料(APTS-MSNs)均勻分散在20 mL的丙酮溶液中，并于室溫下攪拌4 h。然后，逐滴加入10 mL1.5 mol/L琥珀酸酐/丙酮混合液，并在室溫下繼續(xù)攪拌24 h。最后，分別用雙蒸水和無水乙醇充分洗滌離心得到白色粉末，除去殘留溶劑，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅納米材料(COOH-MSNs )。d. 二硫鍵功能化介孔娃納米顆粒的制備首先，將c步驟所得的O. Ig納米材料(C00H-MSN)、0. 015 mol的I-乙基_3_ [3-二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸化物(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)共同溶解在20 mL的PBS緩沖液中(pH=5)，并攪拌3 h，活化介孔硅納米材料的羧基。其次，將I g胱胺鹽酸鹽加入上述溶液，并在室溫下攪拌36 h。最后，用雙蒸水和無水乙醇洗滌上述溶液的離心產(chǎn)物，并在高度真空(< 1000 Pa)中干燥，除去介孔內(nèi)殘留的溶劑，即得到二硫鍵功能化介孔硅納米材料。e.還原響應(yīng)性介孔硅/膠原納米復(fù)合系統(tǒng)的制備首先，將O. 514 mM的FITC溶解
于30 mL PBS (pH 6. O)緩沖溶液中。而后,加入d步驟所得的80 mg的功能性納米材料,攪拌24h。最后，將20 mg膠原，10 mg EDC和5 mg NHS共同加入到上述混合緩沖液中，室溫攪拌24 h。離心得到的產(chǎn)物即為還原響應(yīng)性介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)，記為Col-Iinker-MSNs。f :兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅/膠原-乳糖酸多功能納米復(fù)合顆粒的制備首先，將60 mg乳糖酸、30mg EDC以及15mg NHS共同溶解于4 mL PBS溶液中(ρΗ=6· 0)，室溫攪拌4 h，活化乳糖酸的羧基。而后，將4 mL上述混合液加至e所得的納米顆?；旌鸵褐小嚢?4 h后，離心，PBS緩沖溶液(pH 7. O)洗滌10次，即得到乳糖酸功能化的還原響應(yīng)性細(xì)胞靶向介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)。標(biāo)記為LA-Col-Iinker-MSNs。上述a步驟和f步驟處理后的介孔硅納米材料和介孔硅/膠原一乳糖酸納米復(fù)合顆粒的透射電鏡圖分別間圖I. A和圖I. B;可見本發(fā)明制備的介孔硅納米顆粒具有規(guī)則有序的孔道結(jié)構(gòu)，而經(jīng)過膠原一乳糖酸分子修飾的介孔硅納米材料的孔道比較模糊；該結(jié)果表明介孔硅膠原分子已經(jīng)成功修飾至介孔硅納米材料表面。實例a-f各個步驟處理后納米材料的納米孔道孔徑和比表面積的特征分別間圖I. C和圖I. D ;從圖中可看出，介孔硅納米顆粒的孔徑和比表面積分別為U nm和184 m2/g ;而經(jīng)過氨基、二硫鍵和膠原分子修時候，其孔徑分別降低至3. 3 nm、2.7 nm和消失；而比表面積會分別降低至774 m2/g、474 m2/g、109 m2/g ;上述結(jié)果進(jìn)一步證明本發(fā)明所述的各個反應(yīng)過程是成功可控的。
實施例3
本實施例作為本發(fā)明的第一個實驗例，研究介孔硅/膠原一乳糖酸多功能納米復(fù)合顆粒的還原響應(yīng)性行為。本研究以FITC作為模型藥物，考察了介孔硅/膠原一乳糖酸復(fù)合系統(tǒng)的還原性響應(yīng)性釋放特性。首先，本發(fā)明考察蘇硫二糖醇(DTT)對納米復(fù)合系統(tǒng)釋放行為的影響。具體實驗過程如下將兩組3. 3 mg FITC標(biāo)記的介孔娃/膠原一乳糖酸顆粒和3. 3 mg膠原吸附的介孔娃納米顆粒分別溶解于3 mL的PBS中，并分別加載30 mg、0 mg和30 mg的DTT,制成三組混合液。而后，將上述混合液液全部轉(zhuǎn)移到透析袋(分子量大于14000)中，并置于含有9mL PBS的容器中，37°C旋轉(zhuǎn)孵育24 h。在設(shè)定時間點取出培養(yǎng)液，熒光外分光光度計檢測520 nm處的熒光值。如圖2. A所示在DTT的刺激下，F(xiàn)ITC標(biāo)記的介孔硅/膠原一乳糖酸顆粒在2h內(nèi)約80%的FITC熒光分子從納米復(fù)合顆粒中“爆釋”出來；而當(dāng)其不具有DTT刺激信號時，約僅6. 5%的FITC熒光分子從納米復(fù)合顆粒中“泄露”出來；從而證實該系統(tǒng)對DTT具有快速的響應(yīng)性。而后，本發(fā)明繼續(xù)考察FITC標(biāo)記介孔硅/膠原一乳糖酸復(fù)合系統(tǒng)的“脈沖式”刺激響應(yīng)。具體實驗過程如下首先，將3. 3 mg的納米復(fù)合系統(tǒng)溶解于3 mL的PBS中。并將該混合液液全部轉(zhuǎn)移到透析袋(分子量大于14000)中，置于含有9 mL PBS的容器中，37°C旋轉(zhuǎn)孵育3 h。而后，再加入40 mg DTT，考察FITC標(biāo)記介孔硅/膠原一乳糖酸對DTT的“爆發(fā)式”刺激響應(yīng)。最后，在設(shè)定時間點取出培養(yǎng)液，用熒光光度計檢測FITC熒光強(qiáng)度，并繪制FITC的累積釋放曲線。如圖2. B所示在不加載外界刺激信號時，2h內(nèi)僅有7%的FITC分子從納米復(fù)合顆粒候總釋放出來；而當(dāng)加載30mg的DTT并培育3h后，高達(dá)80%的FITC分子從納米復(fù)合顆粒中釋放出來；上述結(jié)果表明介孔硅/膠原一乳糖酸納米復(fù)合系統(tǒng)在生理條件下，能有效地封裝功能藥物；當(dāng)暴露于還原性環(huán)境中時具有快速的響應(yīng)性，突發(fā)式的釋放功能藥物。最后，本發(fā)明考察FITC標(biāo)記介孔硅/膠原一乳糖酸復(fù)合系統(tǒng)長時間暴露生理環(huán)境 后，蘇硫二糖醇的刺激性響應(yīng)行為。具體實驗過程如下首先，將3. 3 mg的FITC標(biāo)記納米復(fù)合顆粒溶解于3 mL的PBS中。而后，將該混合液液全部轉(zhuǎn)移到透析袋(分子量大于14000)中，并置于含有9 mL的PBS容器中。37°C旋轉(zhuǎn)孵育7天后，加入40mg DTT，考察納米復(fù)合顆粒經(jīng)過長時間的自然釋放后，其對蘇硫二糖醇的刺激響應(yīng)性行為。最后，在設(shè)定時間點取出培養(yǎng)液，并用熒光分光光度計檢測FITC的釋放量。如圖2. C所示當(dāng)FITC標(biāo)記介孔硅/膠原一乳糖酸在PBS緩沖液中體外培育144 h后，約35%的FITC熒光分子泄露至緩沖液中。而當(dāng)加入45 mg的DTT后，約50%的FITC熒光分子立即“爆釋”至溶液中；該結(jié)果表明制備的介孔硅/膠原一乳糖酸納米復(fù)合系統(tǒng)具有長時間的還原響應(yīng)性，并能長時間的有效封裝功能性藥物。實施例4
本實施例作為本發(fā)明的第二個實驗例，研究介孔硅/膠原一乳糖酸多功能納米復(fù)合顆粒在肝癌細(xì)胞內(nèi)的分布狀況。選取實施例2制備而得到的FITC標(biāo)記的介孔硅/膠原一乳糖酸多功能納米復(fù)合顆粒，并利用激光共聚焦掃描顯微鏡監(jiān)控肝癌細(xì)胞(HepG2)內(nèi)吞納米復(fù)合顆粒后的胞內(nèi)分布狀況。如圖3所示當(dāng)使用FITC模型藥物與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)不同的時間后，肝癌細(xì)胞內(nèi)部均不具有熒光分子(圖3. al-a3);而當(dāng)利用MSNsOFITC納米顆粒與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)2h后，肝癌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)熒光分子(圖3. b2);培養(yǎng)4h和24h后，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(圖3. b2-b3);當(dāng)利用LA-Col-Linker-MSNs@FITC顆粒與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)2h后，HepaG2細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)了大量熒光顆粒(圖3. a);當(dāng)培養(yǎng)4h和24h后，胞漿內(nèi)的熒光強(qiáng)度(圖3.b2-b3)明顯強(qiáng)于其他實驗組。該結(jié)果表明LA-Col-Linker-MSN@FITC納米顆粒能與!fepaG2細(xì)胞持續(xù)的發(fā)生特異性作用，并被不斷地被細(xì)胞攝入和環(huán)繞著細(xì)胞核分布，不損壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和損失細(xì)胞的功能。實施例5
本實施例作為本發(fā)明的第三個實驗例，研究介孔硅/膠原一乳糖酸多功能納米復(fù)合顆粒與肝癌細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用。選取實施例2制備而得到的LA-Col-Linker-MSN@FITC多功能納米復(fù)合顆粒，并利用流式分析儀檢測細(xì)胞吞噬納米復(fù)合顆粒的效率。如圖4. A所示當(dāng)利用MSN@FTIC和LA-Col-Linker-MSNiFITC納米顆粒與!fepaG2細(xì)胞分別培養(yǎng)2 h及4 h后，攝入LA-Col-Linker-MSNiFITC顆粒的!fepaG2細(xì)胞數(shù)量分別為MSNsOFITC納米顆粒的3倍及2倍。上述結(jié)果證實LA-Col-Linker-MSN@FITC比MSNOFITC更易被!fepaG2細(xì)胞所吞噬。其機(jī)理在于介孔硅納米顆粒呈現(xiàn)負(fù)電荷特性，與細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷相互排斥。而膠原/介孔硅納米復(fù)合離子呈現(xiàn)中性電荷特征，易與細(xì)胞膜結(jié)合；同時膠原屬于細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，容易與細(xì)胞膜發(fā)生作用。此外，肝細(xì)胞膜上存在無唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)，而乳糖酸是ASGP-R的一種特異配體，能與肝細(xì)胞膜上的ASGP-R發(fā)生特異性識別作用。為了進(jìn)一步考察LA-Col-Linker-MSNs納米復(fù)合顆粒與HepaG2細(xì)胞的靶向特異性識別作用機(jī)制，本發(fā)明選取細(xì)胞流式儀檢測不同類細(xì)胞吞噬LA-Col-Linker-MSNsOFITC納米復(fù)合顆粒的效率。由于HUVEC細(xì)胞株與HepaG2細(xì)胞具有相似的形態(tài)特征與生長模式，因此本發(fā)明選用其作為對照組。如圖4. b所示當(dāng)LA-Col-Linker-MSN@FITC納米復(fù)合顆粒與HUVEC細(xì)胞株和HepaG2細(xì)胞分別培養(yǎng)2 h后，HepaG2細(xì)胞攝入納米復(fù)合顆粒的量是HUVEC 細(xì)胞攝入納米復(fù)合顆粒的2倍；當(dāng)培養(yǎng)4h后，HepaG2細(xì)胞攝入納米復(fù)合顆粒的量是HUVEC細(xì)胞的2. 2倍。結(jié)果表明LA-Col-Linker-MSN@FITC納米顆粒能與H印aG2細(xì)胞發(fā)生特異性識別作用。其機(jī)理在于肝細(xì)胞膜上存在無唾液酸糖蛋白受體(ASGP-R)，而乳糖酸是ASGP-R的一種特異配體，能與肝細(xì)胞膜上的ASGP-R發(fā)生特異性識別作用。
權(quán)利要求
1.一種兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅納米藥物載體的方法，其特征在于，包括以下步驟 a.制備介孔娃納米顆粒； b.采用3-氨基丙基硅烷偶聯(lián)劑修飾步驟a所得的介孔硅納米顆粒，獲得氨基化介孔娃納米顆粒； c.配置丁二酸酐和丙酮的混合液，所述丁二酸酐和丙酮的混合液中丁二酸酐的濃度為I 2 mol/L ;將步驟b中獲得的氨基化的介孔硅納米復(fù)合材料按重量體積比0. 0075 0.015g/mL加入到丙酮中，室溫下攪拌3 6 h后，逐滴加入過量的所述丁二酸酐和丙酮的混合液，攪拌18 36 h，洗滌、離心分離、烘干后獲得白色粉末狀的羧基化的介孔硅納米 材料； d.采用胱胺分子功能化步驟c所得的羧基化介孔硅納米顆粒，制備出二硫鍵修飾的介孔娃納米顆粒； e.將藥物負(fù)載到步驟d所獲得的二硫鍵修飾的介孔硅納米顆粒內(nèi)，再采用膠原分子封堵所述二硫鍵修飾的介孔硅納米顆粒，制備出介孔硅/膠原分子還原響應(yīng)性納米復(fù)合系統(tǒng)； f.采用乳糖酸分子功能化步驟e所得的介孔硅/膠原分子納米復(fù)合系統(tǒng)，制備出兼具細(xì)胞特異性靶向性和還原響應(yīng)性的介孔硅/膠原-乳糖酸多功能復(fù)合型納米藥物載體系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅納米藥物載體的方法，其特征在于步驟a中，所述制備介孔硅納米顆粒是將十六烷基三甲基溴化銨與氫氧化鈉均勻分散至二蒸水中獲得混合溶液，對混合溶液攪拌并加熱至70 90°C后，采用勻速加樣器將正硅酸四乙酯逐滴加入至所述混合溶液中，并劇烈攪拌2 h，獲得白色懸濁液；將所述白色懸濁液均勻分散于甲醇和鹽酸的混合液之中，劇烈攪拌后，于水浴鍋中回流48h，獲得介孔二氧化硅納米顆粒；本步驟中，所述十六烷基三甲基溴化銨、氫氧化鈉與正硅酸四乙酯的重量比為I : 0.1 0.3 3 6。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅納米藥物載體的方法，其特征在于步驟b中，所述制備氨基化介孔硅納米顆粒是將步驟a中所獲得的介孔二氧化硅納米顆粒按重量體積比0. 01 0. 3g/mL均勻分散在甲苯中，攪拌24h后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，于55 65°C的水浴鍋中回流36 h，離心即得到氨基化的介孔硅納米復(fù)合材料；本步驟中，所述甲苯與3-氨丙基三甲氧基硅烷的體積比為70 100 0. 75 I. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅納米藥物載體的方法，其特征在于所述步驟c是將0. 15g 0. 3g的氨基化的介孔硅納米材料均勻分散在丙酮溶液中，并于室溫下攪拌3 6 h ;然后，逐滴加入過量的I 2 mol/L的丁二酸酐和丙酮混合液，并在室溫下繼續(xù)攪拌18 36 h后離心獲得白色粉末；最后，用雙蒸水和無水乙醇分別洗滌離心得到白色粉末，除去殘留溶劑，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔硅納米材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅納米藥物載體的方法，其特征在于所述步驟c是將0.2 g氨基化的介孔硅納米材料均勻分散在20 mL的丙酮溶液中，并于室溫下攪拌4 h;然后,逐滴加入10 mL 丁二酸酐濃度為1.5 mol/L的丁二酸酐和丙酮混合液，并在室溫下繼續(xù)攪拌24 h后離心獲得白色粉末；最后，用雙蒸水和無水乙醇分別洗滌離心得到白色粉末，除去殘留溶劑，并置于真空烘箱中干燥，即得到羧基化的介孔娃納米材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅納米藥物載體的方法，其特征在于步驟d中，首先將步驟c所得的羧基化的介孔硅納米材料、I-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸化物和N-羥基琥珀酰亞胺共同溶解在pH=5 6的PBS緩沖液中，攪拌3 h，以活化所述羧基化的介孔硅納米材料的羧基；再將過量的胱胺鹽酸鹽加入到活化后的所述羧基化的介孔硅納米材料溶液中，室溫下攪拌36 48h后離心；最后，用雙蒸水和無水乙醇洗滌所述離心操作所獲得的產(chǎn)物，在高度真空中干燥后即得到所述二硫鍵功能化介孔娃納米材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅納米藥物載體的方法，其特征在于步驟e中，藥物負(fù)載到二硫鍵修飾的介孔硅納米顆粒內(nèi)后，將膠原、I-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸化物、N-羥基琥珀酰亞胺和負(fù)載了藥物的 二硫鍵修飾的介孔硅納米顆粒在溶液中混合，室溫攪拌24 h，離心得到的產(chǎn)物即為還原響應(yīng)性介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)；本步驟中，所述二硫鍵修飾的介孔硅納米顆粒、膠原、I-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸化物和N-羥基琥珀酰亞胺的重量比為60 90 : 15 25 : 8 12 : 3 6。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅納米藥物載體的方法，其特征在于步驟f中，是先將50 70 mg的乳糖酸、25 35 mg的1_乙基_3-[3_ 二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸化物和10 20 mg的N-輕基琥拍酰亞胺共同溶解于3 5 mL的pH=5. 5 6. 5的PBS溶液中獲得混合物，室溫攪拌4 6 h，以活化所述乳糖酸的羧基；之后，將本步驟中所述混合物加至步驟e所獲得的介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)溶液中，攪拌18 24h后，離心并使用pH=7. 0 7. 4的PBS緩沖溶液充分洗滌，即得到乳糖酸功能化的還原響應(yīng)性細(xì)胞靶向介孔硅/膠原復(fù)合系統(tǒng)。
9.采用I 8任一權(quán)利要求所獲得的兼具還原響應(yīng)性和靶向性的多功能復(fù)合型介孔硅納米藥物載體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種兼具還原響應(yīng)性和靶向性的介孔硅納米藥物載體及其制備方法。首先通過溶解凝膠法制備出介孔硅納米顆粒，并將其開發(fā)成為藥物分子的納米儲存器；而后，利用簡單的化學(xué)修飾方法在介孔硅納米儲存器的表面引入二硫鍵，并將其作為連接紐帶；其次，創(chuàng)新地采用生物相容性的天然細(xì)胞外基質(zhì)—膠原分子固定至介孔硅納米儲存器表面，并將其開發(fā)成為介孔硅納米儲存器的納米封裝器；最后，將乳糖酸分子修飾至介孔硅/膠原納米復(fù)合系統(tǒng)表面，并將其作為肝癌細(xì)胞膜表面受體(ASGP-R)的特異性受體，從而構(gòu)建出一種兼具細(xì)胞特異性靶向性和還原性物質(zhì)/酶響應(yīng)性的介孔硅/膠原—乳糖酸多功能復(fù)合型納米藥物載體系統(tǒng)。
文檔編號A61P35/00GK102949728SQ20121053421
公開日2013年3月6日 申請日期2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月12日
發(fā)明者蔡開勇, 羅忠, 胡燕, 張蓓露 申請人:重慶大學(xué)