專利名稱：抑制GCF基因表達的SiRNA及其載體和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥基因工程領(lǐng)域。具體地涉及一種抑制GCF基因表達的SiRNA及其載體和應用。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference, RNAi )是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導的細胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，從而導致靶基因的表達沉默，產(chǎn)生相應的功能表型的缺失現(xiàn)象。RNAi是一種從低等生物到哺乳動物都有的保守的防御機制。雙鏈RNA在細胞內(nèi)被Dicer酶切成約19-22nt的小片段干擾RNA (SiRNA)進而形成SiRNA-蛋白復合物(siRNP)，SiRNA 通過識別、降解具有同源序列的mRNA最終導致特異性的基因表達沉默(gene silencing)(Liu JY 等,RNA1-gene silencing mediatedby dsRNAs, Section Genet Foreign MedSci，2004，27 (I) :4-10)。因此，RNA干擾技術(shù)近年來日益受到人們的重視。SiRNA技術(shù)正在逐步應用在研究基因功能、細胞信號轉(zhuǎn)導途徑分析、冗余基因的確定、藥物開發(fā)中靶標驗證、基因治療、病毒感染、癌癥和顯性遺傳病治療等。治療腫瘤的方法主要有三種，分別為外科手術(shù)、化療與放射治療，其中放射治療約占這些腫瘤治療的27%左右。細胞的輻射效應與細胞的輻射敏感性和臨床上腫瘤放射治療有關(guān)。在臨床上，輻射敏感性已成為提高腫瘤放療效果的一個重要因素，這種輻射敏感性與福射敏感基因有關(guān)。與福射有關(guān)的早期反應基因IER5 (Immediate Early Response5,簡稱為IER5，中文名稱為早期反應基因5)的過表達能夠抑制Hela細胞的分裂，而GCF (Homosapiens chromosome2open reading frame3 (C2orf3)基因為 IER5 的一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，GCF的結(jié)合位點在IER5啟動子-388 _382bp和-274 _270bp，它在Genebank中編號為NM_003203. 4，全長 4455bp。目前有關(guān)GCF的研究主要有GCF基因序列(Takimoto M, MaoP, Molecularanalysis of the GCF gene identifies revisions to the cDNA and aminoacid sequences (I), Biochim Biophys Acta, 1999，0ct6, 1447 (I) : 125-31)、基因和蛋白表達的情況，細胞分餾研究顯示GCF主要存在于細胞核中，GCF是一個穩(wěn)定的蛋白擁有相對比較長的半衰期，并且GCF是一個磷蛋白，它的磷酸化形式存在于細胞核內(nèi)，磷酸化發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸殘基上。GCF能夠被R田酸、佛波脂、周期AMP刺激，但是不能被釩刺激(Laura B, Hitoshi Y, Ira P and Alfred, Biochemical Characterization of HumanGCF Transcription Factor in Tumor Cells, The Joural Biological Chemistry, 1992，Vol. 267，No. 3，Issue of January25, pp. 1689-1694)，此外它在某些病變組織上也有一些表達，比如GCF mRNA的高水平表達出現(xiàn)在KATO III和AGS(胃癌)、FEM-X (黑素瘤)、和U266B1 (脊髓瘤)細胞中，克隆人類的一種成纖維細胞(W138)中沒有發(fā)現(xiàn)GCFmRNA的表達，在鼠的一個細胞系(NIH3T3)和猴的一個細胞系(CV-1)中用交叉雜交也沒有發(fā)現(xiàn)。原位雜交之后通過一個1. 9kb GCF cDNA的基因探針分析人類染色體，結(jié)果顯示GCF基因在 2pll. 1-11. 2(Alfred C. Johnson, Ryoichiro Kageyamat, Nicholas C. Popescuy, andIra Pastanj Expression and Chromosomal Localization of the Gene for theHuman Transcriptional Repressor GCFj Department of Molecular and CellularBiology, University of Arizona, Tucson, AZ85721，USA，Volume269,number2，288-291)。
因此弄清楚GCF對IER5基因的調(diào)控機理，以及GCF在基因沉默情況下對宮頸癌細胞Hela的增殖和輻射的敏感性的影響，有利于揭示輻射對一些腫瘤，特別是宮頸癌作用的機理研究，也有利于人們開展對該腫瘤輻射增敏藥物的開發(fā)以及我們更好地了解GCF和由它調(diào)控的IER5基因在醫(yī)療上應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種抑制GCF基因表達的SiRNA。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種包含編碼上述SiRNA的DNA的重組表達載體，該重組表達載體能穩(wěn)定表達上述SiRNA序列。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種包含上述SiRNA或上述重組表達載體的宿主細胞。本發(fā)明的第四個目的在于提供上述SiRNA、上述重組表達載體以及上述宿主細胞在制備治療宮頸癌藥物上的應用。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。抑制GCF基因表達的SiRNA的設計首先在NCBI網(wǎng)站的GeneBank中獲得人的GCF全mRNA序列，編號為ΝΜ_003203· 4,全長4455bp,其編碼區(qū)序列為(CDS, coding sequence)位于13廣2476。擇其編碼區(qū)(⑶S)作為SiRNA設計的靶序列，在相應的SiRNA設計網(wǎng)站(http://www. ambion. com/techlib/misc/SiRNA_finder. html)上進行初步設計與篩選，找出具有SiRNA功能的可能靶序列及其對應的SiRNA的編碼DNA序列，設計的SiRNA在GCF基因的mRNA的位置太靠前或太靠后都會影響其抑制效果，然后將所選定的正義鏈和反義鏈與GeneBank (http //www. Ncb1. nlm. nih. gov/blast/)中已知同物種的基因序列進行比較，排除那些和其它編碼序列或EST同源的序列，排除反義鏈的5'端連續(xù)8個堿基與其它基因配對的潛在編碼SiRNA的DNA序列。排除任何一段連續(xù)14個堿基與其它基因配對的潛在編碼SiRNA的DNA序列，最終確定4對SiRNA，編碼SiRNA的DNA的核苷酸序列(共2Int)如下GCF-S1RNA796 :其靶序列即作用部位為796_816bp。正義鏈5，-GCAAGATACTTGGGAACAACA-3’(SEQ ID No.1)反義鏈5’-TGTTGTTCCCAAGTATCTTGC-3’ (SEQ ID No. 2)GCF-SiRNA1405 :其靶序列即作用部位為 1405_1425bp。正義鏈5，-GGAAGGAACATCTAGTGATGA-3’(SEQ ID No. 3)反義鏈5’-TCATCACTAGATGTTCCTTCC-3’ (SEQ ID No. 4)GCF-SiRNA1696 :其靶序列即作用部位為 1696_1716bp。正義鏈5’-GCCATGGTTCAAATCTGTAGA-3’ (SEQ ID No. 5)反義鏈5，-TCTACAGATTTGAACCATGGC-3，(SEQID No. 6)GCF-SiRNA1738 :其靶序列即作用部位為 1738_1758bp。正義鏈5’-GGAAGATTCAAAGAAGGAAAG-3’ (SEQ ID No. 7)
反義鏈5，-CTTTCCTTCTTTGAATCTTCC-3’(SEQ ID No. 8)根據(jù)shRNA設計原則，將上述4對SiRNA設計成發(fā)夾shRNA插入片段以使其插入載體中從而穩(wěn)定表達SiRNA，編碼發(fā)夾shRNA的shDNA的核苷酸序列如下GCF-shRNA796 正義鏈5’ -CACCGCAAGATACTTGGGAACAACATTCAAGAGATGTTGTTCCCAAGTATCTTGCTTTTTTG-3’ ；(SEQ ID No. 9)反義鏈5’ -GATCCAAAAAAGCAAGATACTTGGGAACAACATCTCTTGAATGTTGTTCCCAAGTATCTTGC-3’ 。(SEQ ID No. 10) GCF-shRNA1405 正義鏈5’-CACCGGAAGGAACATCTAGTGATGATTCAAGAGATCATCACTAGATGTTCCTTCCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 11)反義鏈5' -GATCCAAAAAAGGAAGGAACATCTAGTGATGATCTCTTGAATCATCACTAGATGTTCCTTCC-3’。(SEQ ID No. 12)GCF-shRNAI696 正義鏈5’-CACCGCCATGGTTCAAATCTGTAGATTCAAGAGATCTACAGATTTGAACCATGGCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 13)反義鏈5’-GATCCAAAAAAGCCATGGTTCAAATCTGTAGATCTCTTGAATCTACAGATTTGAACCATGGC-3’ 。(SEQ ID No. 14)GCF-shRNA1738 正義鏈5’-CACCGGAAGATTCAAAGAAGGAAAGTTCAAGAGACTTTCCTTCTTTGAATCTTCCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 15)反義鏈5’-GATCCAAAAAAGGAAGATTCAAAGAAGGAAAGTCTCTTGAACTTTCCTTCTTTGAATCTTCC-3’ 。(SEQ ID No. 16)經(jīng)實驗證明，在這四對GCF-SiRNA中，抑制GCF基因表達效果最好的為GCF-SiRNA796，其次為 GCF_SiRNA1405 和 GCF_shRNA1696。本發(fā)明提供的含有編碼SiRNA的DNA序列的重組表達載體的構(gòu)建方法如下將編碼SiRNA的上述DNA序列設計成上述發(fā)夾shRNA插入片段以使其能夠插入到載體中，首先將其與載體連接，連接產(chǎn)物需要轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)(購于博大泰克公司)。經(jīng)由Amp抗性篩選含上述表達載體的克隆，然后提取質(zhì)粒并進行測序，以保證選用的質(zhì)粒其內(nèi)部插入的SiRNA片段無誤。從而構(gòu)建得到重組表載體，其中所述重組表達載體優(yōu)選基于pGPU6/GFP/Neo載體構(gòu)建而成，其重組表達載體命名為pGPU6/GFP/Neo_shRNA。
其中，載體pGPU6/GFP/Neo帶有人U6啟動子，可購于Ambion公司，上述編碼發(fā)夾shRNA的shDNA包含有21個堿基對的SiRNA作用片段；一個序列為TTCAAGAGA的loop環(huán)結(jié)構(gòu)以避免形成終止信號；shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)；正義鏈的5’端添加有CACC，與Bbs I酶切后形成的粘端互補；反義鏈5’端添加有GATC，與Bam H I酶切后形成的粘端互補。本發(fā)明提供的包含上述SiRNA或上述重組表達載體的宿主細胞優(yōu)選為HeLa細胞，其按照如下方法構(gòu)建能穩(wěn)定抑制GCF基因表達的HeLa細胞采用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineM2000將上述pGPU6/GFP/Neo_shRNA載體導入Hela細胞株中，然后通過G418抗生素進行篩選(確定殺死所有HeLa細胞的G418抗生素的最低濃度為700 μ g/ml,選用700 μ g/ml進行轉(zhuǎn)染后篩選，選用350 μ g/ml為維持選擇的藥物濃度)，挑選單克隆細胞培養(yǎng)并檢測抑制GCF基因的蛋白水平，從而得到穩(wěn)定抑制GCF基因表達的細胞系，更優(yōu)選地，該宿主細胞為GCF-shRNA-HeLa單克隆細胞系，已于2012年2月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5821，保藏單位地 址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。上述抑制GCF基因表達的SiRNA、上述重組表達載體、上述宿主細胞用于制備治療宮頸癌的藥物。本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果(I)本發(fā)明提供了三對能有效地抑制GCF基因表達的SiRNA序列；(2)構(gòu)建了能穩(wěn)定表達上述SiRNA序列的載體；(3)本發(fā)明轉(zhuǎn)染成功獲得具有抑制GCF基因表達的SiRNA功能的細胞系，優(yōu)選為GCF-shRNA-HeLa CGMCC No. 5821，該細胞系屬于單克隆，RNA干擾效率高，能有效抑制GCF基因的表達，同時使具有SiRNA同源序列的基因表達沉默而不影響其它基因的功能，所以該細胞系特異性強，無毒副作用；該細胞系為人類揭示GCF基因的生物學功能及了解早期反應基因(IER5)的有關(guān)信號轉(zhuǎn)導途徑等研究提供了實驗細胞，GCF作為IER5的負調(diào)控因子，抑制GCF基因的表達可以使IER5過量表達從而提高腫瘤細胞的輻射敏感性，所以本發(fā)明提供的SiRNA序列、包含上述SiRNA序列的編碼DNA的表達載體以及上述宿主細胞可以用于宮頸癌藥物的研發(fā)，同時也可用于對該基因有關(guān)的潛在藥物開發(fā)與其反應連鎖基因的研究，從而有利于宮頸癌的放療與藥物研發(fā)。


圖1是pGPU6/GFP/Neo載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo_shRNA的Bam H I和Pst I單酶切鑒定圖；其中M: lamda/Ecol30I ；M左側(cè)為Pst I酶切結(jié)果；M右側(cè)為Bam H I酶切結(jié)果；編號 1、2 為 pGPU6/GFP/Neo-shRNA796 的酶切結(jié)果，編號 3、4 為 pGPU6/GFP/Neo_shRNA1405的酶切結(jié)果，編號5、6為pGPU6/GFP/Neo-shRNA1696的酶切結(jié)果，編號7、8為pGPU6/GFP/Neo-shRNA1696的酶切結(jié)果，編號9、10為陽性對照口6 詘/6 /他0-1^4 0!1-8111 應的酶切結(jié)果、編號11、12為陰性對照pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA的酶切結(jié)果。圖3是Western Blot檢測結(jié)果；(A)為陽性對照以及正常HeLa、陰性對照中GAPDH蛋白的表達情況，其中，1:A5-3，2 :A5-2，3 :A5_1，4 :陰性對照(Negative)，5 :正常HeLa(Normal) ; (B)轉(zhuǎn)染1、2、3號重組質(zhì)粒的HeLa及正常HeLa、陰性對照中GCF蛋白的表達情況；注圖中實驗組細胞名稱中第一個大寫字母表示重復實驗的第幾次，第一個數(shù)字表示轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的編號，最后一個數(shù)字為該種質(zhì)粒挑選出的第幾株單克隆細胞系。如C1-6表示在C組轉(zhuǎn)染I號質(zhì)粒后挑選出的第6株單克隆細胞。圖4是GCF-shRNA-HeLa (左)與陰性對照HeLa (右)細胞形態(tài)比較(X 40);圖5是GCF-shRNA-HeLa單克隆細胞與陰性對照HeLa的生長曲線；圖6是輻射對GCF-shRNA-HeLa細胞周期影響的實驗曲線，其中A :輻射后隨時間的變化處于Gtl-Gl期的細胞數(shù)目； B :輻射后隨時間的變化處于G2-M期的細胞數(shù)目；C :輻射后隨時間的變化處于S期的細胞數(shù)目；D :輻射后隨時間的變化凋亡(APOP)的細胞數(shù)目。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡名本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)實驗條件如SambiOOk等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學出版社，2002)中所述的條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。實施例1抑制GCF基因表達的SiRNA序列的篩選利用網(wǎng)絡資源以及軟件對GCF基因進行生物信息學分析，檢索NCBI GeneBank得到GCF基因RNA全序列，編號為NM_003203. 4，全長4455bp，其編碼區(qū)序列為(CDS，codingsequence)位于131 2476。選擇編碼區(qū)作為SiRNA設計的祀序列。在相應的SiRNA設計網(wǎng)站(www. ambion. com)上進行初步設計與篩選,然后對比下列設計原則篩選出來SiRNA序列。SiRNA序列設計的原則(I)在GCF基因的啟動子后50-100個堿基自5’ -端開始。(2)尋找GCF基因序列中的23個堿基，最好是5’_AA (N19)TT_3，(N是任何堿基)。如果找不到四個以上AA (N19)TT,則用AA (N21)補足。如果找不到四個以上AA (N21),則用NA (N21)補足。(3)所選定序列中，G和C的數(shù)目的總和為總數(shù)(23)的35_55%。(4)滿足以上(I廣(3)項要求的片段數(shù)目如果不足四個，將G和C的數(shù)目的總和放寬至為總數(shù)(23)的30-70%。(5)避免二級結(jié)構(gòu)重復,如ACGACGACG，AAAA等。(6)將所選定的正義鏈和反義鏈與 GeneBank (http //www. Ncb1. nlm. nih. gov/blast/)中已知同物種的基因序列進行比較，排除那些和其它編碼序列或EST同源的序列，排除反義鏈的5'端連續(xù)8個堿基與其它基因配對的潛在編碼SiRNA的DNA序列，排除任何一段連續(xù)14個堿基與其它基因配對的潛在編碼SiRNA的DNA序列，最后得到4對SiRNA，編碼SiRNA的DNA的核苷酸序列(共2Int)如下GCF-S1RNA796 :其靶序列即作用部位為796_816bp。正義鏈5，-GCAAGATACTTGGGAACAACA-3’(SEQ ID No.1)反義鏈5’-TGTTGTTCCCAAGTATCTTGC-3’ (SEQ ID No. 2)
GCF-SiRNA1405 :其靶序列即作用部位為 1405_1425bp。正義鏈5’-GGAAGGAACATCTAGTGATGA-3’ (SEQ ID No. 3)反義鏈5’-TCATCACTAGATGTTCCTTCC-3’ (SEQ ID No. 4)GCF-SiRNA1696 :其靶序列即作用部位為 1696_1716bp。正義鏈5，-GCCATGGTTCAAATCTGTAGA-3’(SEQ ID No. 5)反義鏈5，-TCTACAGATTTGAACCATGGC-3，(SEQID No. 6)GCF-SiRNA1738 :其靶序列即作用部位為 1738_1758bp。正義鏈5’-GGAAGATTCAAAGAAGGAAAG-3，(SEQ ID No. 7) 反義鏈5，-CTTTCCTTCTTTGAATCTTCC-3’(SEQ ID No. 8)根據(jù)shRNA設計原則，將上述4對SiRNA設計成發(fā)夾shRNA插入片段以使其插入pGPU6/GFP/Neo載體中從而穩(wěn)定表達SiRNA，編碼發(fā)夾shRNA的shDNA的核苷酸序列如下GCF-shRNA796 正義鏈5’ -CACCGCAAGATACTTGGGAACAACATTCAAGAGATGTTGTTCCCAAGTATCTTGCTTTTTTG-3’ ；(SEQ ID No. 9)反義鏈5’ -GATCCAAAAAAGCAAGATACTTGGGAACAACATCTCTTGAATGTTGTTCCCAAGTATCTTGC-3’ 。(SEQ ID No. 10)GCF-shRNA1405 正義鏈5’-CACCGGAAGGAACATCTAGTGATGATTCAAGAGATCATCACTAGATGTTCCTTCCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 11)反義鏈5’-GATCCAAAAAAGGAAGGAACATCTAGTGATGATCTCTTGAATCATCACTAGATGTTCCTTCC-3’ 。(SEQ ID No. 12)GCF-shRNAI696 正義鏈5’-CACCGCCATGGTTCAAATCTGTAGATTCAAGAGATCTACAGATTTGAACCATGGCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 13)反義鏈5’-GATCCAAAAAAGCCATGGTTCAAATCTGTAGATCTCTTGAATCTACAGATTTGAACCATGGC-3’ 。(SEQ ID No. 14)GCF-shRNA1738 正義鏈5’-CACCGGAAGATTCAAAGAAGGAAAGTTCAAGAGACTTTCCTTCTTTGAATCTTCCTTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 15)反義鏈5’-GATCCAAAAAAGGAAGATTCAAAGAAGGAAAGTCTCTTGAACTTTCCTTCTTTGAATCTTCC-3’ 。(SEQ ID No. 16)
上述發(fā)夾shRNA插入片段包含有21個堿基對的SiRNA作用片段；一個序列為TTCAAGAGA的loop環(huán)結(jié)構(gòu)以避免形成終止信號；shRNA插入片段的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)；正義鏈的5’端添加有CACC，與Bbs I酶切后形成的粘端互補；反義鏈5’端添加有GATC,與Bam H I酶切后形成的粘端互補。此外，為了進行下列實驗，本發(fā)明還設置了陽性和陰性對照陽性對照hGAPDH_shRNA正義鏈5’-GACCGTATGAGAACAGCCTCAAGTTCAAGAGACTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3’ 。 (SEQID No. 17)反義鏈5’-GATCCAAAAAAGTAGTACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3’。( SEQID No. 18)陰性對照NC-shRNA正義鏈5’-CACCGTTCTCCGAACGTGTAACGTCAAGAGGTTACGTTACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3’ 。(SEQ ID No. 19)反義鏈5’-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTTGCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3’。(SEQ ID No. 20)以上編碼發(fā)夾shRNA的shDNA的核苷酸序列采用人工合成。實施例2pGPU6/GFP/Neo_shRNA 載體構(gòu)建包括如下步驟1、GCF-shRNA 模板的退火(I)由 Invitrogen 公司人工合成 GCF-shRNA796、GCF-shRNA1405、GCF_shRNA1696、GCF-shRNA1738模板序列以及陽性對照hGAPDH-shRNA模板序列和陰性對照NC-shRNA模板序列，其合成的正義鏈或反義鏈序列為發(fā)夾結(jié)構(gòu)。(2)將合成的 DNA oligo 用 TE (PH8. O)溶解，濃度為 100 μ M。(3)對發(fā)夾結(jié)構(gòu)的正義鏈和反義鏈進行退火處理使其形成互補的雙鏈反應體系為50yL，其中正義鏈(ΙΟΟμΜ) :5yL ;反義鏈(100 μ M) :5 μ L ;退火緩沖液(10 X shDNAAnnealing Buffer) 5 μ L ；ddH20:35 μ L。在PCR儀上按照如下程序進行退火處理95°C、5min ;85°C、5min ;75°C、5min ；70°C、5min ;4°C保存，所得到退火產(chǎn)物即為正義鏈和反義鏈互補的雙鏈模板溶液，將其稀釋500倍，終濃度為20nM，用于連接反應。2、pGPU6/GFP/Neo (5117bp)載體的線性化pGPU6/GFP/Neo載體的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。 ①采用Bbs I和Bam H I雙酶切對pGPU6/GFP/Neo載體進行線性化處理。酶切體系為50 μ L，具體為pGPU6/GFP/Neo2 μ g ；Bbs I 2 μ L ；Bam H I 2 μ L ;10XBuffer G 5 μ L ;(1(1!120補M 50 μ L0②將上述反應體系混合均勻并進行離心處理，然后在37°C條件下酶切l(wèi)h，酶切后進行1%的瓊脂糖凝膠檢測，采用博大泰克公司的純化試劑盒回收長度約為4060bp的片段，然后將其稀釋至濃度為50ng/y L。3、將步驟I的退火產(chǎn)物與步驟2的雙酶切產(chǎn)物連接連接反應體系如下步驟I得到的退火產(chǎn)物I μ L (終濃度為20ηΜ);步驟2得到的雙酶切產(chǎn)物I μ L(50ng/yL);雙蒸水15yL ;10X連接緩沖液2yL ;T4DNA連接酶(5weissU/ μ L) I μ L。
將上述反應體系置于14_37°C，優(yōu)選為16°C左右中靜置8h，得到的連接產(chǎn)物可保存于-20°C冰箱中。4、轉(zhuǎn)化(I)將冰上融化的感受態(tài)細胞50 μ L和上述連接產(chǎn)物3-5 μ L混合，輕輕地混勻后冰浴30min ;再在42°C水浴中熱激90s ;然后快速冰浴2_3min使細胞冷卻；再向其中加入500 μ L LB培養(yǎng)基(不含抗生素)并混勻，置于恒溫震蕩器(培英牌THZ-C恒溫震蕩器)中以200轉(zhuǎn)/分鐘，370C的條件培養(yǎng)lh，使細菌復蘇；然后在含相應抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)板進行鋪板，待板上液體吸收后倒置該培養(yǎng)板，再將其置于37°C，培養(yǎng)16h。(2)挑菌培養(yǎng)16h后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)板的LB瓊脂上出現(xiàn)多個直徑約Imm左右的白色菌群斑點，挑出其中周圍噬菌體少的菌斑接種到含50 μ g/ml氨芐抗生素的LB培養(yǎng)液中，37200轉(zhuǎn)/分恒溫震蕩器中搖菌過夜。第二天觀察LB培養(yǎng)液是否變混濁，變混濁的說明搖菌成功。然后使用堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用Bam H I和Pst I分別酶切鑒定，質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo的Bam H I和Pst I酶切位點之間是Pst I的酶切位點，而插入目的基因片段之后，Pst I酶切位點被取代，所以陽性克隆應該可以被Bam H I切開，而不能被Pst I切開，酶切結(jié)果見圖2。從圖2中可以看出陽性重組質(zhì)粒Pst I酶切后顯示兩條帶，第I條為超螺旋的SC構(gòu)型，第2條為質(zhì)粒的松弛開環(huán)的OC構(gòu)型；而陽性重組質(zhì)粒被Bam H I單酶切而線性化,條帶在5100bp左右。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒的菌液送上海吉瑪制藥有限公司采用T7通用引物進行測序，其中重組表達載體pGPU6/GFP/Neo_shRNA796的測序結(jié)果見序列表中SEQ ID No. 21。重組表達載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA1405的測序結(jié)果見序列表中的SEQIDNo. 22。重組表達載體pGPU6/GFP/Neo-shRNA1696的測序結(jié)果見序列表中的SEQIDNo. 23。重組表達載體pGPU6/GFP/Neo_shRNA1738的測序結(jié)果見序列表中的SEQIDNo. 24。采用高純度質(zhì)粒中量抽提試劑盒(Axygen)從測序正確的菌液中抽提pGPU6/GFP/Neo-shRNA796、pGPU6/GFP/Neo_shRNA1405、pGPU6/GFP/Neo_shRNA1696、pGPU6/GFP/Neo-shRNA1738、pGPU6/GFP/Neo-hGAPDH_shRNA、pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA 重組質(zhì)粒，并按試劑盒說明進行操作。
實施例3pGPU6/GFP/Neo_shRNA轉(zhuǎn)染HeLa細胞系的建立與篩選將實施例2 構(gòu)建的 pGPU6/GFP/Neo-shRNA796 (命名為 I 號質(zhì)粒)、pGPU6/GFP/Neo-shRNA1405 (命名為 2 號質(zhì)粒)、pGPU6/GFP/Neo_shRNA1696 (命名為 3 號質(zhì)粒)、pGPU6/GFP/Neo-shRNA1738 (命名為 4 號質(zhì)粒)以及陽性對照 pGPU6/GFP/Neo-hGAPDH_shRNA (命名為5號質(zhì)粒)和陰性對照pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA (命名為6號質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染到人正常Hela細胞建立單克隆細胞系，具體步驟如下1、確定HeLa的G418致死劑量(人正常Hela細胞購自軍事醫(yī)學科學院二所第四研究室)pGPU6/GFP/Neo載體購于上海吉瑪公司，含有抗G418的基因，并表達綠色熒光蛋白，因此用這兩個指標來篩選轉(zhuǎn)染成功的單克隆細胞。選取生長狀況良好的HeLa細胞，胰酶消化制成細胞懸液，以每孔10000個細胞接種于24孔板，24h后換液，用含有不同濃度G418的DMEM細胞培養(yǎng)液，濃度梯度為IOOyg/ ml>200 μ g/ml、300 μ g/ml>400 μg/ml、500 μ g/ml>600 μ g/ml>700 μg/ml、800 μ g/ml、900 μ g/mlUOOO μ g/ml,同時設立空白對照，兩個復孔，以后每3天換液I次，加G41816天后700 μ g/ml濃度以上細胞全部死亡，600 μ g/ml濃度還剩下20%融合在底面的活細胞，除去培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞，用溶于50%甲醇的O. 4%臺盼蘭染色20min。確定殺死所有HeLa細胞的G418抗生素的最低濃度為700 μ g/ml,選用700 μ g/ml進行轉(zhuǎn)染后篩選,選用350 μ g/ml為維持選擇的藥物濃度。2、選擇脂質(zhì)體和重組表達載體合適的比例選擇陰性對照pGPU6/GFP/Neo-NC-shRNA質(zhì)粒做預實驗，監(jiān)控質(zhì)粒和脂質(zhì)體的細胞毒性和轉(zhuǎn)染效率，脂質(zhì)體LipOfectamineTM2000產(chǎn)品說明書，24孔板推薦DNA用量O. 8μ g, Lipofectamine 2000推薦用量2μ g。在此參考劑量的上下分別選擇DNAO μ g、O. 6μ g、0. 8μ g、l. 0μ g,Lipofectamine 2000 選擇 0 μ 1、2μ 1、2· 5μ 1，12 種組合方式分別轉(zhuǎn)染人正常HeLa細胞，同時每種組合設立兩個復孔，流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染效率，綜合考慮細胞毒性和轉(zhuǎn)染效率，選擇最佳比例DNA0. 8μ g，LipofectamineTM20002y 1，6孔板的底面積是24孔板的5倍，則選擇DNA4 μ g, Lipofectamine 200010 μ 1，每孔接種20000細胞。3、細胞轉(zhuǎn)染將pGPU6/GFP/Neo-shRNA質(zhì)粒(1-4號質(zhì)粒)、陰性對照質(zhì)粒(6號質(zhì)粒)以及陽性對照質(zhì)粒(5號質(zhì)粒)分別轉(zhuǎn)染Hela細胞，其中陽性對照用于檢測轉(zhuǎn)染操作是否成功有效。分別做兩組平行試驗，每組實驗有三個復孔，分別命名為第一組A、B、C ;第二組D、E、F。每組18個24孔板，另有正常Hela細胞相同實驗條件下培養(yǎng)。按照Lipofectamine 2000說明書的操作方法轉(zhuǎn)染真核細胞，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen,具體方法如下轉(zhuǎn)染前I天將細胞以2X IO5個細胞接種于35mm培養(yǎng)皿中，于轉(zhuǎn)染當日細胞達
70% 90%融合。將質(zhì)粒DNA (4 μ g)滴入250 μ I無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)液中，混勻。將12μ1 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)圈、垂直、貼近液面滴入250 μ I無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)液中，滴完輕輕混勻，室溫放置5min?；旌仙鲜鰞煞菖囵B(yǎng)基，室溫孵育20min。
去除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，PBS3 4ml清洗細胞，一次，加1. 5ml無血清無抗生素培養(yǎng)基。加入含有質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合物O. 5ml, 370C 5%C02條件下培養(yǎng)6h后，棄去無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)液，加入含10%FBS無抗生素的DMEM培養(yǎng)基IOml。培養(yǎng)72h，拍照觀察綠色熒光蛋白表達情況。4、轉(zhuǎn)染效率的計算轉(zhuǎn)染后72小時熒光顯微鏡下800倍觀察，發(fā)出較強的綠色熒光的細胞算作轉(zhuǎn)染成功的細胞，較弱或沒有的則算作沒有轉(zhuǎn)染進去。轉(zhuǎn)染效率=轉(zhuǎn)染成功的細胞數(shù)/細胞總數(shù)X 100%，數(shù)出每一組的轉(zhuǎn)染效率，求出平均數(shù)。
5、G418篩選挑出單克隆細胞株上述轉(zhuǎn)染成功的細胞每天換10%胎牛血清完全培養(yǎng)基，三天后換含有濃度為700 μ g/ml G418的培養(yǎng)基，12天后胰酶消化細胞，計數(shù)，數(shù)100個細胞鋪到IOOmm培養(yǎng)皿中，剩下的傳代分裝到6孔板內(nèi)，24h后(細胞大約1:6分裂為佳)加入含700 μ g/ml G418的10%胎牛血清完全培養(yǎng)基，進行篩選，每三天換液一次，IOOmm培養(yǎng)皿中有單克隆形成，在熒光顯微鏡下用藍色激發(fā)光100倍放大倍數(shù)觀察，用胰酶局部消化挑取單克隆，挑選綠色熒光亮度強的單克隆移至新的24孔板中用加有100個單位雙抗的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并維持G418350 μ g/ml的選擇壓力。以后觀察24孔板細胞生長狀態(tài)長至85%以上即可消化傳代至35mm皿并維持G418350 μ g/ml選擇壓力，擴大培養(yǎng)單克隆細胞珠，單克隆細胞株在細胞密度小時生長緩慢，可相應提高培養(yǎng)基內(nèi)血清的濃度，用15%胎牛血清培養(yǎng)基尚可。6、單克隆細胞系的檢測將篩選出的細胞擴大培養(yǎng)到IOOmm培養(yǎng)皿，剩下的繼續(xù)培養(yǎng)留種(注意標記清楚包括細胞種類，時間，細胞狀態(tài)等)，細胞長滿后，再次觀察熒光，挑熒光亮度強的收細胞提取總蛋白質(zhì)，Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后細胞蛋白質(zhì)的表達量，挑選出GCF表達最低的單克隆細胞株(收細胞提蛋白質(zhì)及Western Blotting檢測方法如下)。將檢測正確的單克隆細胞擴大培養(yǎng)至IOOmm培養(yǎng)皿，按1:3傳代繼續(xù)加藥培養(yǎng)長滿后收細胞凍存，以備后續(xù)實驗。下面對Western Blot實驗進行說明(I)選擇正常HeLa細胞和熒光強度高且穩(wěn)定并最終能夠穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)染細胞即F6-4(陰性對照，Negative)，A5-1、A5-2、A5-3、C1-6、B2-3、E3-10、E3-14、E3-15 做 WesternBlot實驗，其中4號即pGPU6/GFP/Neo GCF_shRNA1738質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞不能穩(wěn)定傳代，全部死亡。(2)細胞總蛋白的提取將原DMEM收集于離心管中，加PBS清洗一次，O. 25%胰酶O. 5ml消化2分鐘，DMEM停止消化，吹打使細胞懸浮，收集于離心管中，IOOOrpm離心4min ；小心棄去上清，加PBS,重新懸浮細胞,轉(zhuǎn)至1. 5mlEP管中，IOOOrpm離心4min ;小心棄去上層PBS,每IOmg細胞加入50 70 μ I蛋白裂解液(lysis buffer,購自美國Thermo)吹打懸浮，室溫混勻5min，HOOOrpm離心10分鐘，收集上清于另一1. 5mlEP管中(小心吸取，不要吸取絮狀沉淀)，沸水煮lOmin，分裝，_80°C保存?zhèn)溆?。蛋白質(zhì)濃度測定考馬斯亮藍染色測蛋白濃度，取5μ I蛋白樣品，195 μ I 7jC,2ml考馬斯亮藍，將蛋白樣品稀釋40倍后測蛋白濃度，200 μ I水，2ml考馬斯亮藍為空白對照，測595nm吸光值。
計算蛋白質(zhì)濃度蛋白濃度=吸光值X0. 27444Xμ I(3) Western blot檢測基本步驟為制膠、蛋白上樣(每孔上樣量為40 μ g)、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜、顯色、曝光、洗片。具體如下聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE):配制一定量的6%的分離膠，混勻后灌膠，并小心在膠面上加入適量異丙醇，待分離膠自然凝聚后倒出；配制一定量的5%的濃縮膠，混勻后倒膠，迅速插入梳子，待凝固后小心拔出梳子，用注射器抽取電泳緩沖液沖洗加樣孔，清除未凝的丙烯酰胺。將蛋白質(zhì)樣品用微量注加樣器(白槍頭)加入樣品孔中。蛋白質(zhì)樣品加至樣品孔的底部，避免氣泡進入空內(nèi)，氣泡易使樣品混入到相鄰的樣品孔中。
將電極插頭與適當電極相連。恒流15mA，待染料的前端遷移至分離膠的底部大約兩個小時，停止電泳，一般情況下使目的條帶遷移至濃縮膠三分之二處壓蛋白片子效果較 好。SDS-PAGE結(jié)束后，從電泳槽中取出凝膠玻璃板。輕輕撬開上層薄玻璃板，凝膠貼于另一塊板上。取下凝膠，在左上角切下一小塊作為標記，后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡IOmin后開始轉(zhuǎn)膜。將塑料支架平放，注意黑片(負極)在下，白片(正極在上)依次放置海綿墊、濾紙、凝膠、轉(zhuǎn)印NC纖維膜、濾紙、海綿墊，用玻璃棒趕走各層氣泡，夾好支架，放于電轉(zhuǎn)盒內(nèi)，在4°C冰箱中過夜進行電轉(zhuǎn)，(GCF)恒壓46v，16. 5h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，膜用麗春紅預染，觀察蛋白情況，置于超純水中漂洗，麗春紅洗去后，用超純水再洗5min。將漂洗過的NC膜放于5%BSA (TBST配制)中室溫振搖封閉lh。棄去封閉液。用一抗稀釋液將一抗稀釋到適當比例，然后將洗好的膜放于稀釋好的一抗中，(GCF 一抗稀釋濃度為I =4000，BAPDHl 10000 β-actinl :4000)室溫振搖孵育2h。棄去一抗稀釋液膜用TBST漂洗3次，每次5min。加入5%牛奶(TBST配制)稀釋辣根酶標記的二抗，稀釋濃度為1:2000,室溫振搖孵育lh。棄去二抗，TBST漂洗 3 次，每次 5min。取等體積 Western Blotting LuminolReagent試劑A液、B液混合(按每平方厘米NC膜O. 125ml混合液計算)稀釋20倍。將NC膜輕輕接觸濾紙吸干液體，有蛋白質(zhì)的一面朝上，放在保鮮膜上，然后將A、B混合液均勻加到膜上，反應lmin，用保鮮膜覆蓋NC膜，表面一定要平整，再用透明膠帶將保鮮膜覆蓋的NC膜固定在顯影盒內(nèi)，有蛋白質(zhì)的一面朝上。在暗室內(nèi)進行放射自顯影，自顯影時間根據(jù)情況調(diào)整，定影出片后觀察結(jié)果。各個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后GCF蛋白表達下調(diào)情況見圖3 (A)、表I以及圖3 (B)和表2。表I陽性對照以及正常HeLa (Normal )、陰性對照(Negative)中GAPDH蛋白的表達情況
權(quán)利要求
1.一種抑制GCF基因表達的SiRNA，其特征在于，編碼所述SiRNA的DNA選自(a)、(b)、(c)中的任意一組 Ca)正義鏈的堿基序列如SEQ ID No.1所示，反義鏈的堿基序列如SEQ ID No. 2所示；(b)正義鏈的堿基序列如SEQID No. 3所示,反義鏈的堿基序列如SEQ ID No. 4所示；(c)正義鏈的堿基序列如SEQID No. 5所示,反義鏈的堿基序列如SEQ ID No. 6所示。
2.一種包含權(quán)利要求1所述編碼SiRNA的DNA的重組表達載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體是基于pGPU6/GFP/Neo載體構(gòu)建的載體。
4.一種包含權(quán)利要求1所述SiRNA或權(quán)利要求2所述重組表達載體的宿主細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為GCF-shRNA-HeLa，保藏編號為 CGMCC No. 5821。
6.權(quán)利要求1所述SiRNA在制備治療宮頸癌藥物上的應用。
7.權(quán)利要求2或3所述重組表達載體在制備治療宮頸癌藥物上的應用。
8.權(quán)利要求4或5所述宿主細胞在制備治療宮頸癌藥物上的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制GCF基因表達的SiRNA，屬于醫(yī)藥基因工程領(lǐng)域。編碼所述SiRNA的DNA選自(a)、(b)、(c)中的任意一組(a)正義鏈的堿基序列如SEQ ID No.1所示，反義鏈的堿基序列如SEQ ID No.2所示；(b)正義鏈的堿基序列如SEQ ID No.3所示，反義鏈的堿基序列如SEQ ID No.4所示；(c)正義鏈的堿基序列如SEQ ID No.5所示，反義鏈的堿基序列如SEQ ID No.6所示。本發(fā)明還公開了包含所述編碼SiRNA的DNA的重組表達載體，以及GCF-shRNA-HeLaCGMCC No.5821，該細胞系的RNA干擾效率高，特異性強，無毒副作用，能有效抑制GCF基因的表達。本發(fā)明的抑制GCF基因表達的SiRNA、重組表達載體、GCF-shRNA-HeLa單克隆細胞還可用于制備治療宮頸癌的藥物。
文檔編號A61P35/00GK102994503SQ201210523760
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者丁庫克, 崔巍, 茍巧, 周平坤, 蘇旭, 楊川杰, 王春英, 尹玲玲, 崔慶佳, 劉建香, 武云云, 劉曉丹, 張士猛, 王春燕, 董凌月, 齊雪松, 崔宏星, 劉青杰, 張慶召, 尚兵, 毛玲, 劉淑娟 申請人:中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所, 河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院