專利名稱：一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬高分子納米載體靶向基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域，特別涉及一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法。
背景技術(shù)：
目前，基因治療作為應(yīng)對(duì)各種遺傳病和癌癥的重要手段，正受到廣泛關(guān)注。通常情況下，基因治療載體可分為病毒載體和非病毒載體。病毒載體因具有較高的轉(zhuǎn)染效率而比較常用，但是其本身存在免疫原性、高毒性及不能大規(guī)模生產(chǎn)等缺點(diǎn)。非病毒載體，尤其是聚酰胺胺樹狀大分子(PAMAM)，由于其毒性相對(duì)較低、效率高、可以大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而后來居上，受到越來越多的關(guān)注。在特定部位的疾病治療中，許多基因載體由于無(wú)法靶向到病灶部位，常常導(dǎo)致病人正常組織和器官受損，甚至威脅患者的生命。據(jù)報(bào)道，PAMAM樹狀大分子經(jīng)修飾后不僅可以提高轉(zhuǎn)染效率還可以提高其轉(zhuǎn)染特異性。[SantosJL. , PanditaDj Rodrigues J，et al. , Receptor-mediated gene delivery using PAMAMdendrimers conjugatedwith peptides recognized by mesenchymal stem cells. MolPharmaceutics, 2010，7，763-774.]。近年來，發(fā)展一種具有靶向功能的納米載體，實(shí)現(xiàn)治療基因的靶向運(yùn)輸，提高治療的特異性，已成為必然的研究趨勢(shì)。某些癌細(xì)胞，如人口腔表皮樣癌細(xì)胞(KB細(xì)胞)和人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)的細(xì)胞膜表面具有高度表達(dá)的葉酸受體(folate receptor),能夠?qū)Ｒ回R(shí)別葉酸并與之結(jié)合。聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子是一種高度支化的大分子，它具有良好的單分散性和水溶性，在使用劑量下沒有細(xì)胞毒性和免疫原性。PAMAM樹狀大分子表面有大量可控功能基團(tuán)，可以通過化學(xué)反應(yīng)連接或物理吸附一些靶向基團(tuán)或藥物分子等。葉酸(FA)是一種含有谷氨酸殘基的小分子，能夠修飾在納米載體或聞分子材料的表面以提聞其對(duì)具有葉酸受體聞表達(dá)的癌細(xì)胞的靶向能力。因此，將葉酸修飾在PAMAM樹狀大分子表面，有望制備一種具有葉酸靶向功能的基因載體，實(shí)現(xiàn)治療基因的負(fù)載與靶向輸送。檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明以葉酸修飾的包裹納米金顆粒的聚酰胺胺樹狀大分子為載體，用于靶向基因轉(zhuǎn)染的方法，尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，該方法具有轉(zhuǎn)染條件溫和，易于操作，轉(zhuǎn)染效率高，特異性好等優(yōu)點(diǎn)，在癌癥的基因治療等方面具有很好的發(fā)展前景。本發(fā)明的包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，包括(I)稱取葉酸(FA)，溶于二甲基亞砜(DMSO)中；稱取1_ (3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶于DMSO中，將EDC溶液加到FA溶液中，攪拌反應(yīng)4_5h ;得到活化的FA溶液；FA與DMSO的配比為4. 22mg :3mL、EDC與DMSO的配比為18. 33mg :2ml ；稱取第5代末端基團(tuán)為氨基的聚酰胺胺樹狀大分子G5. NH2，溶于DMSO中，配制成濃度為10. Omg/mL的G5. NH2溶液；按照FA與G5. NH2摩爾比為5 :1，將活化的FA溶液加入G5. NH2溶液中，室溫下磁力攪拌，反應(yīng)2-4d ；在上述溶液中加入HAuCl4水溶液，混合攪拌20_40min，然后加入NaBH4溶液還原金酸鹽，反應(yīng)2-4h ；HAuCl4與G5. NH2摩爾比控制在25:1，HAuCl4溶液與NaBH4溶液的體積比為 420 :453 ；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物在蒸餾水中透析2-3天；然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子Au DENPs-FA反應(yīng)產(chǎn)物；
(2)按照相應(yīng)的N/P比，取Au DENPs-FA溶液用無(wú)菌水稀釋，并用無(wú)菌水將相應(yīng)質(zhì)量的質(zhì)粒稀釋，然后混合均勻，370C孵育30-60min，得到不同N/P比的Au DENPs-FA/pDNA復(fù)合物；(3) Hela細(xì)胞于37°C、5%C02培養(yǎng)24h，更換培養(yǎng)基，加入含Au DENPs-FA終濃度分別為 0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM 和 3000nM 的細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C、5%C02 培養(yǎng)24h，加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，去除培養(yǎng)基，加入DMSO，搖床振蕩30min ;測(cè)試吸光值，MTT與細(xì)胞數(shù)目的比例為100 ii g : 10000個(gè)細(xì)胞，DMSO與細(xì)胞數(shù)目的比例為200 ii L : 10000個(gè)細(xì)胞；(4)將HeIa細(xì)胞于37 °C、5%C02培養(yǎng)24h，更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，加入AuDENPs-FA/pDNA復(fù)合物溶液，搖勻，37°C培養(yǎng)4h后更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48h。所述步驟(I)中的HAuCl4水溶液濃度為30mg/mL。所述步驟(I)中的NaBH4溶液的濃度為10mg/mL，溶劑中H2O與CH3OH的體積比為2:1。所述步驟(I)中的透析所用透析袋截留分子量為14000 ;用去離子水透析兩天，每天3次，每次2L去離子水。所述步驟(2)中的質(zhì)粒為帶有熒光素酶基因的質(zhì)?；驇в性鰪?qiáng)的綠色熒光蛋白EGFP基因的質(zhì)粒。所述步驟(2)中的N/P比為樹狀大分子的伯氨基與pDNA骨架上磷酸基團(tuán)摩爾比，數(shù)值范圍為I :1_5。所述步驟(3)中的MTT濃度為5. Omg/ml。所述步驟(3)中的吸光值測(cè)試參數(shù)為測(cè)試波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)630nm。所述步驟(4)中轉(zhuǎn)染后表達(dá)時(shí)間為24_48h。本發(fā)明以包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子為靶向基因轉(zhuǎn)染載體，以宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞作為靶細(xì)胞，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。本發(fā)明通過核磁共振(NMR)對(duì)修飾在樹狀大分子表面的葉酸數(shù)量進(jìn)行了表征。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、水動(dòng)力學(xué)粒徑以及表面電勢(shì)對(duì)基因轉(zhuǎn)染載體與PDNA形成復(fù)合物的能力進(jìn)行表征。細(xì)胞毒性試驗(yàn)由MTT法驗(yàn)征。此外，用帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒(Luc)和帶綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒(EGFP)對(duì)基因轉(zhuǎn)染載體的靶向基因轉(zhuǎn)染能力進(jìn)行測(cè)定。和對(duì)照的未經(jīng)葉酸修飾的包裹納米金顆粒的聚酰胺胺樹狀大分子Au DENPs載體的轉(zhuǎn)染效果相比，本發(fā)明制備的基因載體能夠顯著地提高對(duì)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力，因此本發(fā)明制備的具有葉酸靶向功能包裹納米金的聚酰胺胺樹狀大分子能夠作為基因載體用于癌細(xì)胞的靶向基因輸送。核磁共振(NMR)、透射電鏡圖(TEM)、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、水動(dòng)力學(xué)粒徑與表面電勢(shì)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、熒光素酶基因與綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別如下(I)1H NMR 測(cè)試結(jié)果1H NMR圖譜用于表征葉酸對(duì)樹狀大分子表面的修飾。參見說明書附圖I :在化學(xué)位移分別為6. 5,7. 5和8. 5ppm處有三個(gè)小的質(zhì)子峰，它們是FA分子結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)的質(zhì)子峰。根據(jù)積分面積可以求出每個(gè)Au DENP表面連接了 4. 6個(gè)FA分子。(2) TEM 結(jié)果TEM圖用于表征Au DENPs-FA的形貌和直徑大小。參見說明書附圖2 :制備的AuDNEPs-FA形狀接近球形，單分散性好，平均直徑只有2. Onm。(3)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Au DENPs和Au DENPs-FA均具有很好的DNA復(fù)合能力。參見說明書附圖3。結(jié)果表明Au DENPs和Au DENPs-FA均可以在較低N/P (N/P=0. 5)下與DNA很好復(fù)合，將DNA完全阻滯。(4)水動(dòng)力學(xué)粒徑與表面電勢(shì)測(cè)試結(jié)果測(cè)試結(jié)果如說明書附圖4所示。結(jié)果表明，Au DENPs/pDNA復(fù)合物和AuDENPs-FA/pDNA復(fù)合物的大小在合適轉(zhuǎn)染的尺寸范圍內(nèi)。修飾了葉酸的AuDENPs-FA/pDNA復(fù)合物的粒徑較Au DENPs/pDNA的粒徑小，而他們的復(fù)合物電勢(shì)則相差不大，都在適合轉(zhuǎn)染的電勢(shì)范圍內(nèi)。(5)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果測(cè)試結(jié)果如說明書附圖5所示。MTT試驗(yàn)結(jié)果表明，修飾了葉酸的Au DENPs-FA比Au DENPs的毒性有所降低，尤其是在較高的濃度下，3000nM時(shí)，經(jīng)Au DENPs處理過有低于50%的細(xì)胞存活，而經(jīng)Au DENPs-FA處理過的細(xì)胞活力超過50%。這表明在合適的濃度范圍內(nèi)，材料毒性不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，為轉(zhuǎn)染提供有利條件。(6)熒光素酶基因轉(zhuǎn)染試驗(yàn)以帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒并以具有葉酸受體高表達(dá)的人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)兩種材料Au DENPs與Au DENPs-FA對(duì)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。參見說明書附圖6。測(cè)試結(jié)果顯示兩種材料的轉(zhuǎn)染效率均與N/P有關(guān)，且在相同N/P下，Au DENPs-FA的轉(zhuǎn)染效率明顯高于Au DENPs的轉(zhuǎn)染效率。在N/P=2. 5時(shí)，Au DENPs-FA的轉(zhuǎn)染效率最高。表明Au DENPs-FA對(duì)Hela細(xì)胞具有更好的靶向轉(zhuǎn)染效果。(7)增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)基因轉(zhuǎn)染試驗(yàn)以帶有增強(qiáng)的綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒并以具有葉酸受體高表達(dá)的人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)兩種材料Au DENPs與Au DENPs-FA對(duì)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。參見說明書附圖7。對(duì)于Hela細(xì)胞，Au DENPs-FA可以更好地將EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞具有較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)表達(dá)；而未修飾葉酸的材料Au DENPs對(duì)EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率較低，細(xì)胞的綠色熒光信號(hào)相對(duì)較弱。這一結(jié)果證明葉酸修飾的Au DENPs-FA對(duì)癌細(xì)胞具有特異性的靶向效果。(8)自由葉酸阻斷實(shí)驗(yàn)
以帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒并以在添加葉酸的培養(yǎng)基生長(zhǎng)的人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞為模型來檢測(cè)兩種材料Au DENPs與Au DENPs-FA對(duì)葉酸受體被屏蔽后的癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。參見說明書附圖8。對(duì)于在添加自由葉酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h的Hela細(xì)胞，AuDENPs與Au DENPs-FA的轉(zhuǎn)染效率相似。這一結(jié)果證明在癌細(xì)胞上的葉酸受體被屏蔽后，AuDENPs-FA不能體現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的特異性靶向效果。有益.效果( I)本發(fā)明制備的包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有靶向作用，可用于基因分子的靶向輸送；(2)本發(fā)明具有轉(zhuǎn)染條件溫和，易于操作，轉(zhuǎn)染效率高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，在癌癥治療等方面具有很好的應(yīng)用前景。



圖I為本發(fā)明制備的Au DENPs-FA的核磁共振氫譜圖；圖2為本發(fā)明制備的Au DENPs-FA的透射電鏡圖(a)和粒徑分布直方圖(b)；圖3為本發(fā)明制備的Au DENPs/pDNA復(fù)合物(a)和Au DENPs-FA/pDNA復(fù)合物(b)的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)電泳圖譜；圖4為本發(fā)明制備的Au DENPs-FA與pDNA形成復(fù)合物的粒徑(a)和電勢(shì)(b)圖；Au DENPs/pDNA復(fù)合物為對(duì)照組；圖5為Au DENPs與Au DENPs-FA兩種材料對(duì)Hela細(xì)胞毒性比較圖；圖6為Au DENPs與Au DENPs-FA兩種材料在不同N/P下對(duì)Hela細(xì)胞的熒光素酶基因轉(zhuǎn)染效率比較圖；圖7為Au DENPs與Au DENPs-FA兩種材料對(duì)Hela細(xì)胞的綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染的明場(chǎng)照片(a)、熒光照片(b)及疊加照片(C)；圖8為Au DENPs與Au DENPs-FA兩種材料在不同N/P下對(duì)葉酸受體被屏蔽的Hela細(xì)胞的熒光素酶基因轉(zhuǎn)染效率比較圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例I稱取葉酸(FA)4.22mg，溶于 3mL DMS0。稱取 18. 33mg EDC溶于 2ml DMSO 中，將 EDC溶液加到FA溶液中，攪拌反應(yīng)3h。稱取第五代聚酰胺胺樹狀大分子(G5. NH2)40mg,溶于4mLDMSO中，配制成濃度為10. Omg/mL的溶液。按照FA/G5. NH2摩爾比為5/1，將(I)中活化好的葉酸溶液加入G5. NH2溶液中，室溫下磁力攪拌，反應(yīng)3d。在以上溶液中加入0.42mL HAuCl4水溶液(20mg/mL)混合攪拌半小時(shí),然后加0. 453mL的10mg/mL的NaBH4溶液(H2O: CH3OH (體積比)=2:1 )，反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，在蒸餾水中透析兩天(2LX6，一天3次)。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到Au DENPs-FA反應(yīng)產(chǎn)物。NMR表征結(jié)果如

書I所示，在化學(xué)位移分別為6. 5、7. 5和8. 5ppm處有三個(gè)小的質(zhì)子峰，它們是FA分子結(jié)構(gòu)中特征基團(tuán)的質(zhì)子峰，根據(jù)積分面積求出每個(gè)Au DENP表面連接了 4. 6個(gè)FA分子。TEM結(jié)果如

書2所示，Au DENPs-FA的形狀接近球形并且單分散性較好，平均直徑在2. Onm。實(shí)施例2根據(jù)實(shí)施例I的方法制備的Au DENPs-FA以及對(duì)比例I制備的Au DENPs與pDNA形成復(fù)合物，并進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。配制8孔含有溴化乙錠(0. lyg/mL)的瓊脂糖凝膠(I. 0%w/v),室溫放置待瓊脂糖凝膠凝固。以I U gpDNA為例，分別按照不同N/P (0. 125，0. 25，0. 5，1,2,5)配制載體/pDNA復(fù)合物，并以裸pDNA為對(duì)照。然后將對(duì)應(yīng)的載體/pDNA復(fù)合物分別加到瓊脂糖凝膠的孔中，電壓80V，時(shí)間30min。使用凝膠成像儀對(duì)DNA在凝膠中的遷移進(jìn)行分析。結(jié)果如

書3所示。結(jié)果表明，Au DENPs-FA和Au DENPs均可以在較低N/P (N/P=0. 5)下與DNA很好復(fù)合，將DNA阻滯。實(shí)施例3根據(jù)實(shí)施例I的方法制備的Au DENPs-FA以及對(duì)比例I制備的Au DENPs與5 U gDNA (N/P=l，2. 5,5)復(fù)合后，分別用去離子水調(diào)節(jié)體積為lmL。采用馬爾文激光粒度儀(Malvern, MK,633nm激光)對(duì)其粒徑和表面電勢(shì)進(jìn)行了表征,結(jié)果如

書4所示。結(jié)果表明，隨著N/P的增加，所有復(fù)合物的尺寸均先減少而后稍有增大。相同N/P下，AuDENPs-FA/pDNA復(fù)合物尺寸較Au DENPs/pDNA復(fù)合物的尺寸相差不大。另外隨著N/P的增力口，Au DENPs-FA/pDNA復(fù)合物與Au DENPs/pDNA復(fù)合物的表面電勢(shì)均有所增加。實(shí)施例4以具有葉酸受體高表達(dá)的人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)實(shí)施例I制備材料Au DENPs-FA與對(duì)比例I制備材料Au DENPs的細(xì)胞毒性。將模型細(xì)胞培養(yǎng)于含有 10%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液中，分別加入濃度為 0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM 和3000nM的含Au DENPs或Au DENPs-FA的細(xì)胞培養(yǎng)基與細(xì)胞共培養(yǎng)24h，隨后加入20 y LMTT (5. Omg/ml)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。去除孔中的培養(yǎng)液，每孔加入200 y L DMSO，搖床振蕩30min，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)試吸光值，測(cè)試波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)630nm。結(jié)果如

書5所示。結(jié)果表明，隨著材料濃度的增加，細(xì)胞存活率下降，但在高濃度下，經(jīng)Au DENPs-FA處理的細(xì)胞存活率要高于Au DENPs處理的細(xì)胞存活率。實(shí)施例5以帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒并以具有葉酸受體高表達(dá)的人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)實(shí)施例I制備材料Au DENPs-FA與對(duì)比例I制備材料Au DENPs作為載體對(duì)癌細(xì)胞的靶向基因轉(zhuǎn)染效果。將模型細(xì)胞培養(yǎng)于不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液中，加入一定濃度的Au DENPs/pDNA與Au DENPs-FA/pDNA復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng)4h，隨后更換含10%FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。將細(xì)胞裂解測(cè)定熒光素酶活性，結(jié)果見

書6。測(cè)試結(jié)果顯示兩種材料的轉(zhuǎn)染效率均與N/P有關(guān)，且在相同N/P下，Au DENPs-FA的轉(zhuǎn)染效率明顯高于Au DENPs的轉(zhuǎn)染效率。在N/P=2. 5時(shí)，Au DENPs-FA的轉(zhuǎn)染效率最高。表明AuDENPs-FA具有明顯的靶向基因轉(zhuǎn)染效果。實(shí)施例6以帶有增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(EGFP)基因的質(zhì)粒并以具有葉酸受體高表達(dá)的人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)實(shí)施例I制備材料Au DENPs-FA與對(duì)比例I制備材料AuDENPs作為載體對(duì)癌細(xì)胞的靶向基因轉(zhuǎn)染效果。將模型細(xì)胞培養(yǎng)于不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液中，加入一定濃度的Au DENPs/pDNA與Au DENPs-FA/pDNA復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng)4h，隨后更換含10%FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用 激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果見

書7。對(duì)于Hela細(xì)胞，Au DENPs-FA可以更好地將EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞具有較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)表達(dá)；而未修飾葉酸的材料Au DENPs對(duì)EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率較低，細(xì)胞的綠色熒光信號(hào)較弱。這一結(jié)果證明葉酸修飾的Au DENPs-FA對(duì)癌細(xì)胞具有特異性的靶向效果。對(duì)比例I稱取第五代聚酰胺胺樹狀大分子(G5. NH2) 40mg，溶于4mL DMSO中，配制成濃度為10. Omg/mL的溶液，加入0. 42mL HAuCl4水溶液(20mg/mL)混合攪拌半小時(shí)，然后加0. 453mL的lOmg/mL的NaBH4溶液(H2O: CH3OH (體積比)=2:1)，反應(yīng)此。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至截留分子量為14000的透析袋中，用去離子水透析兩天，每天3次，每次2L去離子水。然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到Au DENPs反應(yīng)產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)制備的Au DENPs都呈球形，尺寸較小且分散性較好，Au DENPs的平均尺寸為I. 9nm。對(duì)比例2帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒并以具有葉酸受體被屏蔽的人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)實(shí)施例I制備材料Au DENPs-FA與對(duì)比例I制備材料Au DENPs作為載體對(duì)癌4胞的靶向基因轉(zhuǎn)染效果。將模型細(xì)胞培養(yǎng)于含有自由葉酸(5 PM)的培養(yǎng)基中24h，更換不含F(xiàn)BS和自由葉酸的培養(yǎng)液中，加入一定濃度的Au DENPs/DNA與AuDENPs-FA/DNA復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)，隨后更換含10%FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。將細(xì)胞裂解測(cè)定熒光素酶活性，結(jié)果見

書8。測(cè)試結(jié)果顯示兩種材料的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)，沒有明顯差別。這一結(jié)果證明在癌細(xì)胞上的葉酸受體被屏蔽后，Au DENPs-FA不能體現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的特異性靶向效果。
權(quán)利要求
1.一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，包括 (1)稱取葉酸(FA)，溶于二甲基亞砜(DMSO)中；稱取I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)溶于DMSO中，將EDC溶液加到FA溶液中，攪拌反應(yīng)4_5h ;得到活化的FA 溶液；FA 與 DMSO 的配比為 4. 22mg 3mL, EDC 與 DMSO 的配比為 18. 33mg :2ml ； 稱取第5代末端基團(tuán)為氨基的聚酰胺胺樹狀大分子G5. NH2,溶于DMSO中，配制成濃度為10. Omg/mL的G5. NH2溶液；按照FA與G5. NH2摩爾比為5 :1，將活化的FA溶液加入G5. NH2溶液中，室溫下磁力攪拌，反應(yīng)2-4d ； 在上述溶液中加入HAuCl4水溶液，混合攪拌20-40min，然后加入NaBH4溶液還原金酸鹽，反應(yīng)2-4h ；HAuCl4與G5. NH2摩爾比控制在25:1，HAuCl4溶液與NaBH4溶液的體積比為420 :453 ； 反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物在蒸餾水中透析2-3天；然后進(jìn)行冷凍干燥處理，得到包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子Au DENPs-FA反應(yīng)產(chǎn)物； (2)按照相應(yīng)的N/P比，取AuDENPs-FA溶液用無(wú)菌水稀釋，并用無(wú)菌水將相應(yīng)質(zhì)量的質(zhì)粒稀釋，然后混合均勻，37°C孵育30-60min，得到不同N/P比的Au DENPs-FA/pDNA復(fù)合物； (3)Hela細(xì)胞于37°C、5%C02培養(yǎng)24h，更換培養(yǎng)基，加入含AuDENPs-FA終濃度分別為0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM 和 3000nM 的細(xì)胞培養(yǎng)液，37°C、5%C02 培養(yǎng) 24h，加A MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，去除培養(yǎng)基，加入DMS0，搖床振蕩30min ;測(cè)試吸光值，MTT與細(xì)胞數(shù)目的比例為100 ii g : 10000個(gè)細(xì)胞，DMSO與細(xì)胞數(shù)目的比例為200 ii L : 10000個(gè)細(xì)胞； (4)將HeIa細(xì)胞于37°C、5%C02培養(yǎng)24h，更換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，加入AuDENPs-FA/PDNA復(fù)合物溶液，搖勻，37°C培養(yǎng)4h后更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24_48h。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于所述步驟(I)中的HAuCl4水溶液濃度為30mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于所述步驟(I)中的NaBH4溶液的濃度為10mg/mL，溶劑中H2O與CH3OH的體積比為2:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于所述步驟(I)中的透析所用透析袋截留分子量為14000 ;用去離子水透析兩天，每天3次，每次2L去離子水。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于所述步驟(2)中的質(zhì)粒為帶有熒光素酶基因的質(zhì)?；驇в性鰪?qiáng)的綠色熒光蛋白EGFP基因的質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于所述步驟(2)中的N/P比為樹狀大分子的伯氨基與pDNA骨架上磷酸基團(tuán)摩爾比，數(shù)值范圍為I :1-5。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于所述步驟(3)中的MTT濃度為5. Omg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于所述步驟(3)中的吸光值測(cè)試參數(shù)為測(cè)試波長(zhǎng)570nm,參比波長(zhǎng)630nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于所述步驟(4)中轉(zhuǎn)染后表達(dá)時(shí)間為24-48h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體的靶向基因轉(zhuǎn)染方法，包括包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子的制備；包裹納米金顆粒的葉酸功能化聚酰胺胺樹狀大分子載體與質(zhì)粒復(fù)合物的制備；復(fù)合物的靶向?qū)m頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)。本發(fā)明制備的載體用于基因轉(zhuǎn)染具有轉(zhuǎn)染條件溫和，易于操作，轉(zhuǎn)染效率高，特異性好等優(yōu)點(diǎn)，在癌癥治療等方面具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102961759SQ201210513688
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者史向陽(yáng), 肖童雨, 溫詩(shī)輝 申請(qǐng)人:東華大學(xué)