專利名稱：具有氧化還原/pH雙重刺激響應(yīng)性的納米水凝膠及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種納米水凝膠及其制備方法和應(yīng)用，進(jìn)一步涉及具有氧化還原/pH雙重刺激響應(yīng)性的納米水凝膠及其制備方法，以及該納米水凝膠作為藥物載體的應(yīng)用。·
背景技術(shù)：
根據(jù)大量研究表明，阿霉素是一種有效的抗癌藥物，但是直接注射后通過體液循環(huán)到達(dá)腫瘤組織的劑量很低，而且會給人體帶來嚴(yán)重的副反應(yīng)。世界上已經(jīng)有很多研究來發(fā)展目標(biāo)祀向藥物傳輸體系(drug delivery systems, dds)來增強(qiáng)藥效和降低副反應(yīng),這些藥物載體包括各種形態(tài)的膠束、納米粒子、微膠囊、納米水凝膠等。在各種藥物載體中，聚合物納米水凝膠是一種理想的藥物載體。作為一種通過物理或者化學(xué)交聯(lián)的三維高親水性的聚合物網(wǎng)絡(luò)，水凝膠是最接近于人體各種組織細(xì)胞的形態(tài)，從某種意義上說，人體各種組織都是不同水含量的凝膠。其中，化學(xué)交聯(lián)的納米水凝膠的高度親水性和膠體穩(wěn)定性使得它是一種理想的藥物傳輸載體。對于目標(biāo)藥物載體，智能型的納米水凝膠尤其重要，因為它可以選擇性的在目標(biāo)區(qū)域釋放藥物，而在別的區(qū)域保持穩(wěn)定，一般體現(xiàn)為對于PH值、溫度、離子濃度、氧化還原價勢或者它們之間的組合的刺激響應(yīng)性。其中，最重要的是PH和氧化還原的刺激響應(yīng)性，因為腫瘤組織(pH弱酸性)和正常細(xì)胞(pH中性)間，以及細(xì)胞外液(pH中性)和細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體和溶酶體(pH酸性)之間存在著明顯的差異，而由不同比例的還原型/氧化型谷胱甘肽產(chǎn)生的細(xì)胞外液的氧化環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)液的還原環(huán)境氛圍則使得氧化還原刺激響應(yīng)性也非常重要。針對這些不同組織部位的不同氧化還原/pH設(shè)計多重刺激敏感性的藥物載體，可以智能化的控制釋藥和對于腫瘤細(xì)胞具有靶向殺傷性。對于腫瘤組織，一般為了增強(qiáng)藥效，保持藥物在目標(biāo)組織增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)(EPR, Enhanced enhanced permeability and retention effect),需要藥物載體為穩(wěn)定的高分子量聚合物；但是同時為了在釋藥結(jié)束后可以順利通過腎臟代謝排出體外，減小藥物載體對人體的副作用，一般又要求聚合物分子量小于初次代謝閾值(45 — 50 kDa),為了同時滿足這兩個矛盾的需求，制備生物可降解的藥物載體顯得尤為重要。據(jù)大量研究表明，葉酸受體是一種在多種癌細(xì)胞中廣泛存在，并且和葉酸分子發(fā)生相互特殊作用的物質(zhì)。利用葉酸和葉酸受體特有的相互作用，人們通常將葉酸作為特殊的靶向分子來修飾各種納米抗癌藥物載體，起到對于癌細(xì)胞的靶向識別作用，從而提高藥物的傳遞效率，降低藥物的副作用。基于以上信息，設(shè)計制備一種具有化學(xué)交聯(lián)的、良好的膠體穩(wěn)定性的、具有氧化還原/pH雙重刺激響應(yīng)性的、可生物降解的葉酸靶向型的納米水凝膠藥物載體將會是對于藥物傳遞領(lǐng)域的一次很好探索。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有化學(xué)交聯(lián)的、良好的膠體穩(wěn)定性的、具有氧化還原/pH雙重刺激響應(yīng)性的、可生物降解的葉酸靶向型的納米水凝膠及其制備方法。本發(fā)明另一目的在于提供所述的納米水凝膠作為藥物載體的應(yīng)用。本發(fā)明提供的具有氧化還原/pH雙重刺激響應(yīng)性的納米水凝膠的制備方法，具體步驟為
第一步在溶劑中加入聚合單體和交聯(lián)劑，反應(yīng)溫度為60 - 120°C，蒸餾沉淀除去一半溶劑，反應(yīng)時間為0. 5 — 2 h ;離心除去溶劑和未反應(yīng)單體，用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌3 —5次，真空烘箱內(nèi)干燥(例如45°C干燥24 h),即得到聚合物凝膠粒子；
第二步將第一步得到的凝膠粒子，加入一定量和一定比例的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)/ N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，先在溶劑中進(jìn)行活化反應(yīng)，再和氨基化的葉酸分子反應(yīng)，即得到具有氧化還原/pH雙重刺激響應(yīng)性的納米水凝膠。本發(fā)明中，所述溶劑為單一溶劑或混合容劑，其中，單一溶劑為乙醇、乙腈、水、四氫呋喃、甲基異丁基酮或甲苯，混合溶劑為不同重量比例的乙腈與乙醇、乙腈與四氫呋喃、乙腈與水、乙醇與甲苯、或甲基異丁基酮與乙腈的混合物；所述聚合單體為甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)、聚乙二醇(Mn=300，475，526，600，800，900，1000，1500,2000)，N_2_ 羥丙基一甲基丙烯酰胺(HPMA)等；所述交聯(lián)劑為N，N’-雙(丙烯酰)胱胺(BACy)。降解的測試條件為在25 mL的單口燒瓶里加入5 mg的納米水凝膠粒子和10 mL的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)，然后加入還原劑10 mM的二硫蘇糖醇(DTT)或者還原型谷胱甘肽(GSH)，然后放入恒溫?fù)u床(200 rpm搖速，37. 5°C)勻速振蕩。上述反應(yīng)中所用的各物質(zhì)之間的量比范圍為聚合單體重量交聯(lián)劑重量溶劑重量EDC 重量NHS 重量葉酸重量=I 0. I - 0. 4 40 — 100 :0. 02 - 0. 2 :0. 02 - 0. 2
0.02 - 0. 2 ;其中，EDC的物質(zhì)的量NHS的物質(zhì)的量=I :1 — 2. 5 (折算成重量比為EDC的重量NHS 的重量=I :0. 6 — I. 5)。本發(fā)明所制備的納米水凝膠，大小為50 - 1650 nm,多分散度為0. 09 — 0. 35。本發(fā)明提供的納米水凝膠可作為藥物載體應(yīng)用。載藥的條件為8—10 mg的納米水凝膠和4-6 mg鹽酸阿霉素,超聲分散在15-20mL的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7. 4)中，磁力攪拌20-24h，然后離心移去上清液，用磷酸鹽緩沖溶液(pH=7. 4)洗滌3次除去表面吸附的阿霉素，即得物理負(fù)載阿霉素的納米水凝膠。釋藥的條件為將8-10 mg載藥納米水凝膠粒子分散在8-10 mL的兩種緩沖溶液中(磷酸鹽緩沖溶液，pH=7. 4 ;醋酸一醋酸鈉緩沖溶液，pH=5. 0，濃度為5-100 mM，例如5，10,15,20,50,100禮)，超聲分散均勻，然后分為4-5份，每份2 mL左右，將一份凝膠溶液移入透析袋中(透析分子量Mn=14000)，再放入80 mL的含不同濃度的DTT或者GSH的緩沖溶液中，即刻開始計時釋藥。在預(yù)訂時間，從瓶內(nèi)取出3 mL釋藥的緩沖溶液進(jìn)行紫外測量，再補(bǔ)充3 mL純的緩沖溶液保持體積恒定。所制備的納米水凝膠在還原劑降解后，分子量小于2000且分子量分布均勻(Mn=1200, PDK1. I)，遠(yuǎn)小于代謝閾值(45 — 50 kDa)，預(yù)計可以很好的代謝排出體外。針對上述的納米水凝膠藥物載體的用途，用于裝載抗癌藥物阿霉素。裝載阿霉素藥物分子，其包封率和載藥率可以方便地用納米凝膠和阿霉素的不同比例加以控制。在上述方案的基礎(chǔ)上，所屬抗癌藥物阿霉素的載藥率的重量百分比為16. O - 42. 3 %。阿霉素的釋放過程可以通過調(diào)節(jié)環(huán)境的氧化還原環(huán)境和pH值加以控制，在高谷胱甘肽濃度和較低pH值(pH=5. 0)條件下(模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境)展現(xiàn)出較快的釋放速度(5小時釋藥95%)，而在低谷胱甘肽濃度和中性的pH值條件下(模擬細(xì)胞外環(huán)境)保持穩(wěn)定，釋放量小于20%。通過將載有藥物的上述納米藥物載體和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗，納米水凝膠藥物載體體現(xiàn)出了很好的釋藥行為。通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)2 h后載藥納米水凝膠粒子已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞，隨著時間延長到5 h，24 h，熒光逐漸增強(qiáng)，說明納米水凝膠降解釋放出更多的阿霉素；48 h后阿霉素藥物對于細(xì)胞的殺傷作用已經(jīng)非常明顯，細(xì)胞存活率大幅降低，剩余的少量細(xì)胞也處于皺縮狀態(tài)，說明所制備的納米水凝膠是一種較好的藥物載體。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明制備工藝清晰簡潔，得到的納米水凝膠藥物載體具有氧化還原/pH雙重刺激響應(yīng)性，氧化還原響應(yīng)性可以使得納米水凝膠在細(xì)胞外低GSH濃度的環(huán)境中保持穩(wěn)定，長時間循環(huán)，很少泄露藥物，而在細(xì)胞內(nèi)高GSH濃度的環(huán)境中快速降解，變?yōu)樾》肿恿康木€性鏈，從而快速釋放藥物，達(dá)到在目標(biāo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)控制釋放抗癌藥物的效果。pH響應(yīng)性則使得納米水凝膠在內(nèi)涵體，溶酶體等亞細(xì)胞器官內(nèi)更有效的釋放出阿霉素，體現(xiàn)出與GSH的協(xié)同效應(yīng)。而凝膠粒子的可生物降解性和降解后的小分子量又可以使得藥物載體迅速代謝排出體外，進(jìn)一步減少對人體的副作用。以上設(shè)計思路基本覆蓋了藥物傳遞領(lǐng)域所關(guān)心的一些基本問題，因此產(chǎn)品具有良好的全面性。


圖I :制備的不同粒徑的PMAA納米水凝膠粒子的透射電鏡照片。圖2 =PMAA納米水凝膠粒子在10 mM的DTT或者GSH作用下降解后的GPC測試分子量。圖3 :用熒光顯微鏡拍攝的不同時間的載藥凝膠粒子對于腫瘤細(xì)胞(Hela細(xì)胞)作用的光學(xué)照片。載藥凝膠粒子(a, b)2 h, (c, d) 5 h, (e, f) 24 h, (i, j) 48 h;阿霉素藥物(g, h) 24 h, (k, I) 2h;未載藥的凝膠粒子(m, n) 2h, (o, p) 2h。
具體實(shí)施例方式下面將通過實(shí)例對于本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例I :PMAA納米水凝膠的制備
MAA單體500 mg，BACy 交聯(lián)劑 55. 6 mg, 16. 7 mg AIBN 引發(fā)劑，40 mL 乙腈，加熱到 82°C，蒸餾除去20 mL溶劑，離心除去溶劑和未反應(yīng)單體，用乙醇和去離子水洗滌3次，真空烘箱干燥24 ho實(shí)施例2 PAA納米水凝膠的制備
AA單體500 mg, BACy交聯(lián)劑55. 6 mg, 16. 7 mg AIBN引發(fā)劑，40 mL乙腈一乙醇混合溶劑(卩^|:￥^!|=1:1)，加熱到82°(，蒸餾除去20 mL溶劑，離心除去溶劑和未反應(yīng)單體，用丙酮和去離子水洗滌3次，真空烘箱干燥24 h。實(shí)施例3 PMAA-co-PHPMA納米水凝膠的制備
MAA 單體 250 mg,HPMA 250mg, BACy 交聯(lián)劑 55. 6 mg, 16. 7 mg AIBN 引發(fā)劑，40 mL 乙腈一甲苯混合溶劑(Vill V￥*= 4 :1)，加熱到82°C，蒸餾除去20 mL溶劑，離心除去溶劑和未反應(yīng)單體，用丙酮和去離子水洗滌3次，真空烘箱干燥24 h。實(shí)施例4: PMAA-co-PEG納米水凝膠的制備
MAA 單體 200 mg，PEG (Mn=475)300 mg, BACy 交聯(lián)劑 55. 6 mg, 16. 7 mg AIBN 引發(fā)劑，40 mL乙腈，加熱到82°C，蒸餾除去20 mL溶劑，離心除去溶劑和未反應(yīng)單體，用乙醇和去離子水洗滌3次，真空烘箱干燥24 h。實(shí)施例5 PMAA修飾葉酸的納米水凝膠的制備 步驟I :氨基化葉酸的制備
葉酸 44Img (I mmol), 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 247 mg (1.2 mmol), DMSO 30 mL,NHS 230 mg (2 mmol)，加熱到50 0C反應(yīng)6小時，再加入吡啶500 u g,乙二胺600 mg (10mmol)，室溫反應(yīng)12小時。加入240 mL乙腈沉淀，過濾，乙醚洗滌3次，真空干燥得到粗產(chǎn)物。進(jìn)一步純化粗產(chǎn)物用2 mol/L的鹽酸溶解，然后再加入過量的乙腈沉淀，然后過濾，再用乙醚洗滌3次，真空干燥過夜，得到暗黃色粉末。步驟2 =PMAA納米水凝膠粒子修飾葉酸
PMAA凝膠粒子50 mg,加入20 mL PBS緩沖溶液(pH=5. 5)，超聲10分鐘均勻分散，加入I-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)96 mg,室溫下攪拌10分鐘，然后加入N-輕基丁二酰亞胺(NHS)58 mg,反應(yīng)2小時,再加入上一步制備的氨基化的葉酸15 mg,反應(yīng)12小時。離心，將粒子用乙醇和去離子水各洗滌3次，真空烘箱干燥24 h。即可得到修飾葉酸的PMAA納米水凝膠粒子。應(yīng)用例
取實(shí)施例中制得的納米水凝膠10 mg,加入6 mg的阿霉素,配成20 mL的溶液,磷酸鹽 緩沖溶液，常溫下攪拌24 h，產(chǎn)物用離心分離，冷凍干燥，制成負(fù)載有抗癌阿霉素的納米水凝膠藥物載體，載藥率的重量比為16. 7 - 42. 3 wt%0
權(quán)利要求
1.一種納米水凝膠的制備方法，其特征在于采用蒸餾沉淀法，具體步驟為第一步在溶劑中加入聚合單體和交聯(lián)劑，反應(yīng)溫度為60 - 120°C,蒸餾沉淀除去一半溶劑，反應(yīng)時間為O. 5 — 2 h ;離心除去溶劑和未反應(yīng)單體，用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌 3 - 5次，真空烘箱內(nèi)干燥，得到聚合物凝膠粒子；第二步將第一步得到的凝膠粒子，加入I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)/ N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，先在溶劑中進(jìn)行活化反應(yīng)，再和氨基化的葉酸分子反應(yīng)，即得到具有氧化還原/pH雙重刺激響應(yīng)性的納米水凝膠；其中，所述溶劑為單一溶劑或混合容劑，單一溶劑為乙醇、乙腈、水、四氫呋喃、甲基異丁基酮或甲苯，混合溶劑為乙腈與乙醇、乙腈與四氫呋喃、乙腈與水、乙醇與甲苯、或甲基異丁基酮與乙腈的混合物；所述聚合單體為甲基丙烯酸、丙烯酸、聚乙二醇，或N-2-羥丙基一甲基丙烯酰胺；所述交聯(lián)劑為N，N’ -雙(丙烯酰)胱胺；所用的各物質(zhì)之間的量比范圍為聚合單體重量交聯(lián)劑重量溶劑重量=EDC重量 NHS 重量葉酸重量=I 0. I - O. 4 40 — 100 0. 02 - O. 2 0. 02 - O. 2 0. 02 — O. 2。
2.由權(quán)利要求I所述方法制備得到的納米水凝膠，其特征在于納米水凝膠粒徑大小為 50 - 1650 nm,多分散度為 O. 09 — O. 35。
3.由權(quán)利要求I所述的納米水凝膠作為藥物載體的應(yīng)用。
4.據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于載藥的條件為8—10 mg的納米水凝膠和4-6 mg鹽酸阿霉素,超聲分散在15-20 mL的磷酸鹽緩沖溶液中，磷酸鹽緩沖溶液pH=7. 4，磁力攪拌20-24h，然后離心移去上清液，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次除去表面吸附的阿霉素，即得物理負(fù)載阿霉素的納米水凝膠。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有氧化還原/pH雙重刺激響應(yīng)性的納米水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。制備過程為在溶劑中加入聚合單體和交聯(lián)劑，進(jìn)行聚合反應(yīng)，蒸餾沉淀除去一半溶劑；除去溶劑和未反應(yīng)單體，干燥,得到聚合物凝膠粒子；也可以進(jìn)一步修飾帶上氨基等不同官能團(tuán)，通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)/N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和氨基化的葉酸反應(yīng)，得到葉酸靶向的納米水凝膠粒子。該納米水凝膠形態(tài)規(guī)整的球形，大小均勻，粒徑可調(diào)控，具有氧化還原和pH雙重刺激響應(yīng)性，具有較好的膠體穩(wěn)定性和良好的分散性，用作藥物載體，在后續(xù)的體內(nèi)代謝中通過腎臟很容易的排出體外。
文檔編號A61K9/00GK102973488SQ201210503848
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月2日
發(fā)明者汪長春, 潘元佳 申請人:復(fù)旦大學(xué)