專利名稱：miR-296-3p在制備前列腺癌發(fā)生或轉移診斷試劑盒中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學材料技術領域，本發(fā)明公開了一種小分子非編碼RNA的用途，尤其涉及一種小分子非編碼RNA即miR-296-3p在制備腫瘤發(fā)生或轉移診斷試劑盒中的應用。
背景技術：
前列腺癌(prostate cancer, Pca)是發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤，發(fā)病隨年齡而增長，其發(fā)病隱匿，生長緩慢，病因復雜，給臨床的早期診斷帶來很大的障礙。前列腺癌容易發(fā)生淋巴結轉移和骨轉移，是引起前列腺癌患者死亡的主要原因，也一直是基礎和臨床研究的熱點。前列腺癌的常用治療手段主要有內分泌治療、手術治療，化療和放療。 比較新的免疫治療和基因治療也有巨大應用潛力。近年來不斷有文獻報道m(xù)icroRNA在腫瘤診斷和治療中的重要作用，前列腺癌特異性miRNA的發(fā)現(xiàn)為其診斷和治療打開了一個全新的局面。microRNA是一類內源性小分子非編碼RNAs，結構高度保守，具有表達時序性和組織特異性，通過與靶基因3’非編碼區(qū)(3’ UTR)互補序列特異性結合，導致翻譯抑制或者mRNA降解，從而調節(jié)基因表達[I]。microRNA在惡性腫瘤中表達譜各異并發(fā)揮著重要的調控作用，隨著大規(guī)模、高通量miRNA檢測技術的推廣應用，發(fā)現(xiàn)新的miRNA不僅為腫瘤的診斷和預后提供了頗具價值的標準，同時也為尋找新的腫瘤生物治療靶標奠定基礎[2]。研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中存在miRNA表達譜差異，它們的表達水平和腫瘤細胞的分化程度密切相關，而常規(guī)的mRNA標志物不具備此特點。Kati PP, Minja JP等[3]檢測了前列腺組織和細胞中319種miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)位于染色體缺失區(qū)域的miRNA低表達，而位于擴增區(qū)的miRNA高表達，它們通過靶向一些腫瘤相關基因如RAS、BCL2等最終影響前列腺腫瘤細胞或正常細胞的生長分化。Annika Schaefer,Monika Jung等[4]采用微陣列技術和實時熒光定量PCR分析了 155例前列腺癌病人組織中miRNA的表達譜，結合臨床病例數(shù)據(jù)，通過ROC分析發(fā)現(xiàn)了可以作為診斷標志物的miR-205 ;而在Kaplan-Meier分析和Cox比例風險回歸分析之后，發(fā)現(xiàn)了可以作為預后診斷標志物的miR-96。首次報道與臨床前列腺癌療效和轉移相關的單個miRNA是miR-221 [5]。Martin Spahn, Susanne Kneitz等在分析了不同類型的臨床標本之后發(fā)現(xiàn)98%的前列腺癌組織中都伴隨有miR-221的特征性表達下調。根據(jù)Gleason評分或腫瘤分期和復發(fā)率，miR-221表達的進行性降低和高危腫瘤以及不良預后密切相關。而且miR-221的表達下調是前列腺癌特異性的，屬于轉移過程中的頻發(fā)事件。進一步的研究表明其可能的作用機制與c-kit致癌基因有關?；谇傲邢侔┲衜iR表達譜差異的一系列研究為后續(xù)的功能分析提供了豐富的證據(jù)，也為臨床診斷和預后評價以及尋找新的高危前列腺癌治療靶標開辟思路。P69和M12屬于前列腺癌同源細胞系，P69來源于SV40T永生化的人非致瘤性前列腺上皮細胞[6]。隨后通過裸鼠皮下成瘤實驗和在體篩選，得到了具有局部侵襲和遠端轉移能力的M12細胞。二者的遺傳背景一致，但是致瘤能力和轉移潛能差異很大，是研究前列腺癌轉移機制的理想模型。有關miR-296的研究報道還比較少，Thomas等報道m(xù)iR-296能夠直接調控HGSmRNA有效促進腫瘤血管發(fā)生[7] ；miR-296能夠下調p21WAF1表達，改變p53_p21WAF1通路從而促進腫瘤發(fā)生[8]?，F(xiàn)有的文獻所報道的miR-296多為miR-296_5p，對miR-296_3p的研究目前僅有6篇報道[9-14]，其中一篇主要針對膠質細胞瘤的藥物抵抗性[9]，其他研究主要集中在miR-296-3p與其它miRNA共同調節(jié)某個或某些基因的表達[10]，鮮有miR-296_3p對于腫瘤生長轉移相關功能的研究。我們的研究聚焦在miR-296-3p對于前列腺癌發(fā)生與轉移，對于腫瘤發(fā)生和轉移的治療具有重大意義。我們以非轉移性前列腺癌細胞系P69和高轉移性前列腺癌細胞系M12兩個細胞系為主要研究模型進行研究。參考文獻 I.Esquela-Kerscher A,Slack FJ.Oncomirs-microRNAs with a role incancer[J]. Nat Rev Cancer，2006，6(4):259-269。2. Lu Jj Getz G. Microrna expression profiles classify human cancers[J].Nature, 2005，435:834-838。3.Porkka KP, Pfeiffer MJj Waltering KKj et al. Microrna expressionprofilingin prostate cancer[J]. Cancer Res，2007，67(13):6130-5。4. Schaef er A，Jung MjMoll enkopf HJj et al. Diagnostic andprognosticimpIications of microrna profiling in prostate carcinoma[J]. Int JCancer, 2010，126(5) : 1166-76。5. Spahn Mj Kneitz Sj Scholz CJj et al. Expression of microrna-221isprogressively reduced in aggressive prostate cancer and metastasis andpredictsclinical recurrence[J]. Int J Cancer，2010，127(2):394-403。6. Bae VLj Jackson-Cook CKj Maygarden SJj et al. Metastatic sublines ofansv40 large t antigen immortalized human prostate epithelial cell line[J].Prostate, 1998，34(4) : 275-82。7. ThomasWu ** rdinger, BakhosA. Tannous, OkaySaydamj et al. miR-296regulatesgrowth factor receptor overexpressionin angiogenic endothelial cells[J]. CancerCell;2008, 14:382 - 393。8.A-rumYoon,RanGaoj ZeeniaKaul et al MicroRNA-296 is enriched incancercells and downregulates p2IWAFl mRNA expression via interaction with its3’ untranslatedregion[J]· Nucleic Acids Research，2011，1-14。9.MiR_296_3p regulates cell growth and multi-drug resistance ofhumanglioblastoma by targeting ether-a -go-go (EAGl)[J]. European Journal ofCancer(In press)010. A TSH-CREBI-microRNA loop is required for thyroid cell growth[J].Molecular Endocrinology 2011，25 (10):1819-1830。11. MicroRNA signatures associated with immortalization ofEBV-transformedlymphoblastoid cell lines and their clinical traits[J]. CellProliferation 2011，44，59-66。12. Differential genomic imprinting and expression of imprintedmicroRNAsin testes-derived male germ-line stem cells in mouse[J]. Plos One2011，6(7)e22481。13.Expression profile of microRNAs and mRNAs in human placentasfrompregnancies complicated by preeclampsia and preterm labor [J].ReproductiveSciences 2011， 18(1)46-56。14. Improving murine embryonic stem cell differentiation intocardiomyocyteswith neuregulin-1: differential expression of microRNA [J]. American Journal ofPhysiology Cell Physiology 2011 7;301 (I):C21 - C30。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一種與前列腺癌轉移相關的小分子非編碼miR-296-3p及其反義寡核苷酸的用途。為了解決上述問題，本發(fā)明提供了 miR-296_3p在制備前列腺癌發(fā)生或轉移診斷試劑盒中的應用。本發(fā)明亦提供了 anti-miR-296_3p在制備抑制前列腺癌侵襲轉移藥物中的應用。miR-296-3p能直接抑制E- I丐粘蛋白表達,其反義寡核苷酸anti-miR-296_3p能有效抑制前列腺癌細胞侵襲和轉移。所述的miRNA及其反義寡核苷酸序列通過化學合成獲得或通過構建真核細胞表達載體進行表達獲得。所述的miRNA及其反義寡核苷酸序列為核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或二者的混合，這些序列可以經(jīng)過任意修飾，如3’或5’端連接DIG 或 biotin 等。本發(fā)明的優(yōu)點在于，本發(fā)明采用全基因組深度測序研究發(fā)現(xiàn)，與非轉移性前列腺癌細胞系P69相比，高轉移性前列腺癌細胞系M12中miR-296-3p高表達而E-鈣粘蛋白低表達，Western blot和real-time PCR等方法也驗證了上述結果。miR-296_3p通過作用于其靶基因E-鈣粘蛋白使其降解從而促進前列腺癌細胞遷移侵襲。過表達miR-296-3p后，E-鈣粘蛋白的表達水平降低，腫瘤細胞間的粘附減弱，遷移侵襲能力增強。因此，檢測miRNA-296-3p和E-鈣粘蛋白的表達，可以對前列腺癌轉移進行診斷和病理分級，對其轉移和預后做出評價，提出了 miR-296-3p在制備前列腺癌發(fā)生或轉移診斷試劑盒中的應用。圍繞miR-296-3p靶向E-鈣粘蛋白的特點可以設計腫瘤轉移干預策略，提出了anti-miR-296-3p在制備抑制前列腺癌侵襲轉移藥物中的應用。本發(fā)明在醫(yī)學和生物制藥領域有重大實際意義和巨大的潛在應用價值。


圖I為前列腺癌細胞系P69和M12的遷移能力和形態(tài)學差異比較A為羅氏xCELLigence系統(tǒng)實時連續(xù)監(jiān)測活細胞遷移能力時P69和M12的動力學曲線(P69-紅，M12-綠)；B為光鏡下3D培養(yǎng)基質中P69和M12的形態(tài)；C為激光掃描共聚焦顯微鏡觀察3D培養(yǎng)基質中P69和M12的形態(tài)(紅-Vimentin，綠-E-cadherin,藍-DAPI)；D為P69和M12中miR-296_3p和E-鈣粘蛋白的數(shù)字基因測序結果；E為計算機序列比對分析顯示miR-296_3p與E-鈣粘蛋白3’ UTR區(qū)的結合；F為實時熒光定量PCR檢測P69和M12中miR-296_3p的水平；G蛋白免疫印跡檢測P69和M12中E-鈣粘蛋白的表達水平(actin為內參)。圖2為miR-296_3p直接靶向E-鈣粘蛋白A為實時熒光定量PCR驗證穩(wěn)定轉染細胞系中miR-296_3p是否過表達；
B為實時熒光定量PCR檢測miR-296_3p過表達之后E-鈣粘蛋白編碼基因⑶HlmRNA水平的變化；C為蛋白免疫印跡分析miR-296_3p過表達之后E-鈣粘蛋白表達水平的變化；D為流式細胞術測定細胞系P69-Ctrl和P69-miR-296_3p中E-鈣粘蛋白的表達水平；E為瓊脂糖凝膠分析M12細胞中miR-296-3p表達下調之后E-鈣粘蛋白編碼基因CDHl mRNA水平的變化；F實時熒光定量PCR分析M12細胞中miR-296_3p表達下調之后E-鈣粘蛋白編碼基因CDHl mRNA水平的變化；G E-鈣粘蛋白3’ UTR結構示意圖(紅色代表miR-296_3p可能的結合位點)；H雙熒光素報告基因分析Hela細胞中轉入miR-296_3p后熒光素酶活性的變化；圖3miR-296_3p通過下調E-鈣粘蛋白促進前列腺癌細胞侵襲遷移A、B為RT-CA實時監(jiān)測miR-296_3p過表達及E-鈣粘蛋白回復之后P69細胞遷移侵襲能力的變化；C =RT-CA實時監(jiān)測miR-296_3p過表達之后P69細胞遷移侵襲能力的變化。圖4為anti-miR-296_3p抑制了高轉移性腫瘤細胞的體內外遷移侵襲活性和克隆形成能力A為RT-CA實時監(jiān)測miR-296_3p表達下調之后M12細胞遷移能力的變化；B為過表達E-鈣粘蛋白后RT-CA實時監(jiān)測M12細胞遷移能力的變化；C為短時(0h，48h)生物發(fā)光成像分析miR-296-3p表達下調之后高轉移性細胞系M12轉移能力的變化；D為長時(4周)生物發(fā)光成像分析miR-296-3p表達下調之后高轉移性細胞系M12轉移能力的變化；E裸鼠肺部腫瘤轉移灶HE染色分析；F軟瓊脂克隆形成實驗檢測miR-296_3p表達下調之后M12錨定非依賴性生長能力的變化。培養(yǎng)2周后克隆大小的變化；G結晶紫染色之后定量分析克隆數(shù)目的變化并進行統(tǒng)計分析。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Samtoook等人，分子克隆實驗室手冊(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I. P69和M12的遷移能力和形態(tài)學差異及miR-296_3p在兩種細胞中的差異性表達I.細胞遷移實驗(Migration)(I)組裝 CIM-16 :lower chamber 分兩組，對照組每孔加入 160ul SFM(serumfreemedium),血清誘導組每孔加入160ul全培基(5%FBS) ；upper chamber每孔加入30_50ulSFM ；(2)平衡CM-16放入37° C培養(yǎng)箱平衡Ih ；
(3)檢測背景RT_CADP Analyzer 檢測 CM-16 的基礎值； (4)準備細胞細胞饑餓6_8h后，0. 05%Typsin消化，細胞計數(shù)，調整密度為4 XlOVml，備用；(5)種板upper chamber每孔加入IOOul單細胞懸液,室溫平衡30min ；(6)測定CM-16放入RT-CA DP Analyzer，啟動實時測定程序，15min間隔一次，24h后停止；(7)數(shù)據(jù)分析=RT-CA分析細胞指數(shù)Cl (cell index)，細胞陽性遷移結果的標準是Cl 彡 0. 2。如圖I-A所示，M12細胞的實時遷移曲線高于P69細胞，P69細胞處于基線，遷移不明顯。該結果說明，M12細胞具有高遷移的特性，P69細胞具有低遷移特性。2.三維細胞培養(yǎng)(3 dimensional cell culture, 3D culture)(I)解凍3D基質膠，4° C置冰盒內過夜；(2)冰上操作，48孔板每孔加入250ul基質膠，37° C孵育30min促進膠凝；同時配制 2%Assay Media (2ml matrix+98ml medium),4° C 保存一周或-20。C 長期保存；(3)37° C溫育Assay Media作為細胞稀釋液；(4)單層貼壁細胞消化后用24ml Assay Media重懸制備單細胞懸液,細胞計數(shù)并調整密度至IX 104/ml，48孔板每孔加入500ul細胞懸液；(5)倒置顯微鏡下每天觀察細胞生長狀況和結構變化，每隔4天換液一次；(6)根據(jù)不同細胞系的特點，當細胞形態(tài)生長至預期的程度時，結束培養(yǎng)，準備后續(xù)的細胞形態(tài)和結構分析。(7)結果分析倒置熒光顯微鏡拍照保存。如圖1B\C，分別為光鏡下和熒光顯微鏡下3D培養(yǎng)P69和M12細胞形態(tài)，彩色圖片為熒光免疫組織化學染色。(紅-Vimentin,綠-E_cadherin，藍-DAPI)。該結果說明，M12細胞較P69細胞有更強的侵襲能力，3D培養(yǎng)P69細胞呈圓團狀生長，而M12細胞則呈散亂的星形出芽生長，向周圍遷移，具有明顯的局部侵襲特性。3.總RNA提取和實時熒光定量PCR3. I細胞總RNA的提取(I)Trizol 裂解細胞lml/O10 皿，室溫靜置 5min ；(2)裂解液轉移至I. 5mlEP管，每暈升加入200 ii I氯仿，用力振搖15s,室溫靜置2-3min，然后 12000g 4。C 離心 15min ；(3)小心吸取上層水相(含RNA)至新的I. 5ml EP管，加入500 μ I的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置IOmin, 12000g 4。C離心15min ；(4)去上清，75%乙醇(RNase free水配制)洗滌沉淀，手輕彈管底使白色沉淀漂浮，重復洗滌一次，8000g 4° C離心IOmin ；(5)去上清，吸水紙上扣干EP管，通風櫥中干燥數(shù)分鐘；(6) RNA沉淀溶于20-100 μ I水中，充分溶解，NanoDrop2000測定濃度，并稀釋至相同濃度(I μ g/μ I)。 3. 2逆轉錄反應(I)處理基因組DNA : 10 μ I的處理體系。RNA 模板(I μ g/ μ I)、10XReaction Buffer with MgCl2、DNase I 各 I μ I,RNasefree 水補至 10 μ 1，混勻后，37。C 30min ;然后加入 I μ I 50mM EDTA,65° C IOmin,滅活殘余的DNase I。(2) cDNA 合成Fermentas 體系表I
試齊Ij_fflS_
RNA 模板(I pg)11 μ 5 X AM V RT buffer4μ1
dNTP Mix, 10 mM each2μ1
RiboLock1·' RNase Inhibitor0.5 μ (20 u)
01igo(dT)i s primer or0.5 (ug (100 pmol)
Random hexamer primer or0.2 μ I (100 pmol)Gene-specific primer15-20 pmol
AMV Reverse Transcriptase0.5 μ I (10 u)
Total Volume20Lii
t上述20μ I反應體系，混勻后離心，若使用Oligo (dT) 18primer orGene-specificprimer,程序設置為 50。C 60min,85。C 5min ;若使用 Random hexamerprimer,程序設置為 25° C 10min,50° C 60min,85° C 5min。3.3實時熒光定量PCR(I)反應體系按如下表格配制表 2ComponentVolumef.Lil) for I reaction
Master Mix(2x)5.0
Forward Primer0.5Reverse Primer0.5 Sample(IOx)1.0 DEPC H2O3.0 Total Volume10 0(2)根據(jù)AB公司St印One PCR擴增儀操作說明設置程序參數(shù)，具體條件如下Holding Stage :95。C IOmin ；Cycling Stage :95。C 15s,60° C 30s,72° C 30s(40cycle) ；Melt Curve Stage :95° C 15s,60° C lmin,95° C 15s。3. 4數(shù)據(jù)處理熒光定量PCR定量檢測所得miRNA的5 CT值，采用Excel 2003數(shù)據(jù)分析工具，當相對標準誤(STDEVX 0. 5，認為結果可靠。如圖1F，為實時熒光定量PCR結果，顯示P69和M12細胞中miR-296-3p的表達水平差異，M12細胞較P69細胞高I. 5倍。4免疫印跡分析4. I細胞總蛋白的抽提(I)取對數(shù)生長期貼壁細胞，70%生長密度，移除舊的培養(yǎng)液，使用IXPBS洗滌2次；(2)每 6cm 培養(yǎng)皿細胞加 SDS 裂解緩沖液(62. 5mM Tris, 2%SDS, pH=6. 8) 50ul，室溫靜置2-3min，細胞刮刮下，轉移至I. 5ml EP管，100° C水浴IOmin ；(3)超聲波細胞粉碎機處理細胞裂解液，20kHz，30s X 3 ；(4) 13000rpm,室溫離心15min,轉移上清至新的I. 5ml EP管；(5)NanoDrop2000測定蛋白濃度，立即上樣或將樣品保存于-20° C備用。4.2蛋白免疫印跡(I)制膠①將I. 5mm厚的制膠用的玻板洗凈后，晾干備用；②將玻璃板對齊后放入夾中卡緊，卡在架子上準備灌膠(操作時要使兩玻璃對齊以免漏膠)；③按下表配置12%和8%的分離膠及5%的濃縮膠；表3分離膠及濃縮膠配方
權利要求
1.miR-296-3p在制備前列腺癌發(fā)生或轉移診斷試劑盒中的應用。
2.anti-miR-296-3p在制備抑制前列腺癌侵襲轉移藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了miR-296-3p在制備腫瘤發(fā)生或轉移診斷試劑盒中的應用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-296-3p通過作用于其靶基因CDH1，使其轉錄受抑制或降解，使E-鈣粘蛋白表達下降，從而促進前列腺癌細胞遷移侵襲。過表達miR-296-3p后，E-鈣粘蛋白的表達水平降低，腫瘤細胞間的粘附減弱，遷移侵襲能力增強。因此，檢測miRNA-296-3p和E-鈣粘蛋白的表達，可以對前列腺癌轉移進行診斷和病理分級，對其轉移和預后做出評價。圍繞miR-296-3p靶向E-鈣粘蛋白的特點可以設計腫瘤轉移干預策略，提出了anti-miR-296-3p在制備抑制前列腺癌侵襲轉移藥物中的應用。本發(fā)明在醫(yī)學和生物制藥領域有重大實際意義和巨大的潛在應用價值。
文檔編號A61K48/00GK102965439SQ20121049167
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權日2012年11月27日
發(fā)明者余健秀, 閆潔, 黃建, 王艷麗 申請人:上海交通大學醫(yī)學院