專利名稱：丹酚酸a凍干粉針用于制備保護腦血管內皮細胞藥物的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種丹酚酸A凍干粉針用于制備保護腦血管內皮細胞藥物的用途。
背景技術：
腦血管病又稱腦卒中，是由各種病因使供應腦部血液的血管發(fā)生病變所致的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。其主要病因為腦動脈系統(tǒng)病損(如腦動脈硬化)等原因導致的腦動脈管腔狹窄、血管痙攣、閉塞或破裂、血流減少或完全阻塞，腦部血液循環(huán)和功能障礙，腦組織受損而發(fā)生的一系列癥狀。主要包括缺血性和出血性腦血管病。其中(ICVD，又稱缺血性卒中)占80 左右。缺血性腦血管病是指局部腦組織包括神經(jīng)細胞、膠質細胞及聯(lián)系纖維由于供血障礙發(fā)生的變性、壞死或一過性的功能喪失·血管內血栓形成、栓塞、血管狹窄導致的腦動脈阻塞是缺血性腦卒中的主要原因。缺血引起腦神經(jīng)細胞損傷和死亡的作用機制多樣、復雜，缺血性腦卒中(即腦缺血)后，由于腦部缺乏血液和氧氣的供應，導致大腦能量代謝失衡，產(chǎn)生一系列病理性損傷，如氧化應激、興奮性氨基酸毒性、鈣超載、炎癥反應等，從而導致神經(jīng)元的大量死亡。它是臨床上的常見病、多發(fā)病，死亡率及致殘率很高，現(xiàn)已經(jīng)成為世界公認的三大致死疾病之一。臨床上治療主要是溶栓、挽救缺血區(qū)域(半暗帶)的瀕臨死亡的神經(jīng)元和促進損傷后神經(jīng)功能的恢復。防治缺血性腦血管疾病是目前人類迫切需要解決的醫(yī)學難題。目前美國FDA僅批準了組織纖溶酶原活化因子(tPA)用于中風后的溶栓治療，但其治療時間窗很窄，只有在中風4.5小時內使用才有效；而且還存在出血以及缺血再灌加重腦損傷的危險性。而目前針對缺血性中風治療的神經(jīng)保護藥包括鈣通道阻斷劑如尼莫地平、谷氨酸受體拮抗劑如地佐環(huán)平(DizocilPine)、抗氧化劑或自由基清除劑如依達拉奉、NO信號傳導通路調節(jié)劑蘆貝魯哩(Lubeluzole)以及炎癥抑制劑恩莫單抗(Enlimomab)等。但它們中有的治療作用不確切或特異性不強，有的毒副作用較大、耐受性小，有的還處于臨床前或臨床研究階段，很難在防治缺血性腦卒中發(fā)揮積極影響。因而，研發(fā)出快速有效、安全穩(wěn)定的防治腦缺血藥物迫在眉睫。在此領域中醫(yī)藥發(fā)揮了不可忽視的積極作用。丹酚酸A (Salvianolic acid A),又名丹酚酸甲，是唇形科植物丹參Salviamiltiorrhiza Bunge的干燥根及根莖中所含的一種水溶性酹酸類化合物,丹酹酸A對腦微血管栓塞有明顯的藥理作用，而且作用優(yōu)于丹酚酸B (張恒艾.丹酚酸A對腦微血管栓塞大鼠的影響及機制研究[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，2011〕，丹酚酸A是由丹參素和咖啡酸縮合而成，含有多個酚羥基、羥基、酯鍵等活潑基團，其對光和熱不穩(wěn)定，暴露空氣易氧化成丹酚酸C和異丹酚酸C等，由于丹酚酸A的上述理化特性，制成丹酚酸A注射齊IJ，其穩(wěn)定性成為制成注射劑的關鍵技術。但是，有關丹酚酸A制劑特別是注射劑研究文獻資料不多，并且普遍存在注射劑不穩(wěn)定性的問題，無法保證丹酚酸A藥理作用
發(fā)明內容
為克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種丹酚酸A凍干粉針用于制備保護腦血管內皮細胞藥物的用途，其中，所述丹酚酸A凍干粉針包括含丹酚酸A主份原料，填充劑和抗氧劑；其中所述凍干粉針的各成份按下列重量配比制成:含丹酚酸A主份原料20g 60g，填充劑20g 60g，抗氧劑為制成總量的0.02% 0.1 %，其中所述含丹酚酸A主份原料中:丹酚酸A94% 97%，紫草酸0.20Z0 1.5%，迷迭香酸0.20Z0 1.5%，丹酚酸B0.2% 1.5%，丹酚酸 C0.4% 2.0% ；
所述丹酚酸A凍干粉針采用如下制備方法獲得:取丹參藥材，切成飲片或粉碎成直徑約Imm 5mm顆粒，每次加3 15倍量、45 95 0C水溫浸提取，同時以10 50轉/分速度攪拌，或加3 15倍量水煎煮提取，共提取I 3次，每次提取I 4小時；提取液減壓濃縮至相對密度1.0 1.25 (600C )，加入乙醇使含醇量在50% 85%，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無醇味，得丹參提取液；或者取丹參藥材，切成飲片或粉碎成直徑約Imm 5mm顆粒，每次加3 15倍量30% 60%乙醇回流提取，每次提取I 4小時，共提取I 3次；減壓回收乙醇并濃縮至無醇味，得丹參提取液；上述丹參提取液加水稀釋至每Iml含丹酚酸BI 30mg，水溶液用堿調pH至3.5 6.5，加入與丹酚酸B摩爾百分比0.1 3%氯化鋅作為催化劑，在100 140°C溫度加熱轉化I 6小時；轉化液調pH值至2.5 4.5，靜置、離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸Al 10mg，經(jīng)HPD-100大孔樹脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹脂比為1: 35
I: 70，樹脂柱徑高比為1: 4 1: 30，分別用I 8倍柱體積水、I 10倍柱體積10% 40%乙醇洗脫，除去雜質，再用2 10倍柱體積20% 60%乙醇洗脫，HPLC檢測，收集含有丹酚酸A的20% 60%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；水溶液濃縮至每Iml含1-1Omg丹酚酸A的溶液，通過聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 5 1: 25，樹脂柱徑高比為1: 4 1: 25，分別用I 10倍柱體積水、5 20倍柱體積20% 60%乙醇溶液洗脫除雜，再用4 15倍柱體積40% 90%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的40% 90%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味水溶液；水溶液濃縮，調酸pH至2.0 4.0，用水溶液1_8倍量的叔丁基甲基醚，分2 6次萃取，分離有機層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酹酸Alg IOg的萃取液,力口入I 3倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的5 20倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 4
I: 25，以正戊烷-叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脫6 30倍柱體積，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脫6 30倍柱體積，減壓回收洗脫劑，回收有機溶劑后的丹酚酸A加5 20倍量水溶解，微波真空干燥，得所述含丹酚酸A主份原料，取含丹酚酸A主份原料IOg 80g加注射用水1500 2800ml攪拌使溶解，用堿調pH值4.0 5.0，再加入所述填充劑使其溶解，再加入所述抗氧劑，攪拌使溶解混勻，再加入活性炭0.5 2g攪拌吸附，濾過除去活性炭，加注射用水灌裝成瓶，送入凍干機再進行冷凍干燥，
其中所述冷凍干燥包括如下步驟:A、冷凍:以20°C 30 V /h速度降溫至-40 V -45 V，保溫冷凍10 16小時；B、升華:抽真空至0.3mbar以下，在10 14小時內將凍結的丹酚酸A丹酚酸A制劑溫度上升到_23°C _27°C，維持-23°C -27°C真空干燥6 8小時；C、干燥:繼續(xù)升溫，以0.5°C 1.(TC /min均勻升溫至40°C 45°C，維持40°C 45°C干燥2 5小時后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。優(yōu)選的，還包括用于保護腦微血管內皮細胞損傷的用途。優(yōu)選的，其中所述填充劑用量為20mg 40mg/2ml 3ml。優(yōu)選的，微波真空干燥溫度:20-100°C，回差溫度1_5°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分鐘。優(yōu)選的，微波真空干燥溫度:50-85°C，回差溫度2-4°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分鐘。優(yōu)選的，微波真空干燥溫度:55-80°C，回差溫度2-3°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率25-60KW，干燥120-140分鐘。本發(fā)明提供的丹酚酸A凍干粉針主藥是丹酚酸A主份原料，本發(fā)明通過對丹參的提取、轉化、純化、干燥工藝，得到了以丹酚酸A為主的主份原料:經(jīng)過系統(tǒng)的篩選和優(yōu)化，首先比較確定了起始原料丹酚 酸B的提取溶劑和提取方法，由于丹酚酸B水溶性較好，確定了采用水提取或低濃度醇提取，又由于丹酚酸B熱穩(wěn)定性較差，確定了采用熱水溫浸提取并加攪拌提取方法，或用低濃度乙醇回流提取，使提取溶度低于100°C，保持丹酚酸B不被破壞，通過正交實驗確定了最佳溶劑用量和提取時間，得到了適應工業(yè)化生產(chǎn)的丹酚酸B最佳提取工藝的。本發(fā)明與現(xiàn)有技術對比表明:起始原料用丹參藥材直接提取即可進行投料轉化，不需對丹酚酸B進行純化后再進行轉化，即本發(fā)明催化轉化反應中，反應原料丹酚酸B不需要高純度，例如不需要丹酚酸B的純度> 50%。一般認為反應原料越純越好，然而，本發(fā)明的催化轉化反應中，丹酚酸B的純度高低對轉化反應效果沒有影響。相反，丹酚酸B純度>50%時不但產(chǎn)生大量雜質，且沒有提高轉化率，因此，本發(fā)明取得了預料不到的技術效果。再者，本發(fā)明通過反復實驗比較，首先確定了對丹酚酸A主份原料產(chǎn)率產(chǎn)生重要影響的因素如轉化前丹酚酸類化合物的濃度、PH值、溫度、時間等。在此基礎上，又通過付出大量的時間、物質和精力反復實驗對溫度、PH值、時間、丹酚酸B的濃度及其他相關條件進行了研究，以及這些因素彼此之間如何協(xié)同作用共同對丹酚酸A主份原料產(chǎn)率產(chǎn)生影響，從而確定了丹酚酸B轉化丹酚酸A的需要控制的最佳溫度、pH值、時間等，并將丹酚酸B起始濃度控制在lmg/ml 30mg/ml,從而使得本發(fā)明丹酹酸A轉化率更加明顯優(yōu)于其他轉化條件?；瘜W反應中，反應物的純度與濃度常常影響反應的效果。一般情況下對反應物有濃度要求，且認為濃度高比濃度低好。本發(fā)明的催化轉化反應中，丹酚酸B的濃度高低對轉化反應效果沒有影響。相反，可能是由于高溫轉化的原因，丹酚酸B純度高不但產(chǎn)生大量雜質，且沒有提高轉化率。而且含丹酚酸B水溶液中丹酚酸B的濃度并非越高越好，30mg/ml以上濃度轉化率反而低，效果更差。因此，本發(fā)明在節(jié)約成本和生產(chǎn)周期方面，取得了預料不到的技術效果，具有創(chuàng)造性。在現(xiàn)有技術沒有給出任何技術啟示的情況下，本領域技術人員如果僅從理論上推斷，是不可能得出在上述各條件參數(shù)下將丹酸B轉化成丹酚酸A主份原料具有更好的轉化效果的結論。更為重要的是，本發(fā)明通過創(chuàng)造性的勞動，發(fā)現(xiàn)氯化鋅作為催化劑能顯著提高丹酚酸B轉化丹酚酸A主份原料的轉化率，轉化率非常穩(wěn)定的能達到接近60 %，多數(shù)情況都可以超過60%，這在以往任何一項現(xiàn)有技術中都是不可能的，因此，取得了預料不到的技術效
果O由于丹酚酸A含量較低，經(jīng)轉化后丹酚酸A含量大提高，但還含大量雜質，因此，分別選擇了弱極性和非極性大孔吸附樹脂進行粗分離，再選擇聚酰胺、溶劑萃取、硅膠分離，并對不同流份進行測定，去除雜質部分后，將丹酚酸A主份原料中的丹酚酸A含量從10%左右提高到80%，至90%，至93%，至96%。進一步，在顯著提高轉化率的同時，本發(fā)明通過適于實際產(chǎn)業(yè)應用的純化步驟，尤其是通過一系列的分離、洗脫處理等步驟后，沒有采用傳統(tǒng)的常壓干燥，并從真空干燥、噴霧干燥、微波真空干燥方法中優(yōu)選了微波真空干燥，從而徹底克服了以往干燥溫度過高，干燥時間過長及對丹酚酸A的破壞大的缺陷；而冷凍干燥時間過長，成本極高且冷凍干燥所得的提取物無法完全去除溶劑殘留問題。另外，本發(fā)明還可以將低濃度與高濃度的丹酚酸B混合，只需配成合適的起始轉化濃度即可，同樣可以達到轉化成丹酚酸A主份原料的目的。因此，這種轉化原料的制備工藝非常簡單，生產(chǎn)成本降低的同時也非常適于實際產(chǎn)業(yè)中的應用。丹酚酸A主份原料除含主要成分丹酚酸A之外，還含少量丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸C ;丹酚酸A通過清除自由基，減輕膜脂質過氧化引起的流動性和通透性變化，阻止離子的異常通透和酶的漏出，從而降低了腦缺血再灌注而引起的損傷，對腦缺血有保護作用。丹酚酸A可劑量依賴性地抑制腺苷二磷酸(ADP)、凝血酶、花生四烯酸、膠原或U46619誘導的血小板聚集，降低血小板中cAMP水平，以及減少ADP引起的血小板P選擇素的表達和纖維蛋白原結合，從而阻止ADP引起的血小板白細胞聚集，對動脈粥樣硬化及栓塞形成有防治作用；丹酚酸A改善大鼠大腦中動脈阻塞模型大鼠神經(jīng)功能缺陷狀態(tài)，縮小梗塞面積，減輕腦水腫，降低相關腦區(qū)神經(jīng)元損傷程度，對腦缺血損傷有保護作用，對學習記憶損傷的保護作用。丹酚酸A主份原料中的丹酚酸B是丹參及其制劑丹參注射液、香丹注射液的主要有效成分，與丹酚酸A —樣對腦缺血有保護作用，對動脈粥樣硬化及栓塞形成有防治作用；對腦缺血損傷有保護作用，紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸C作用與丹酚酸A類同，均有較強的抗氧化作用，能清除氧自由基，抑制脂質過氧化反應，其作用強度高于維生素C、維生素E，是目前已知的抗氧化作用最強的天然產(chǎn)物之一，明顯抑制ADP、花生四烯酸、膠原誘導的家兔血小板的聚集反應，及抑制血栓形成的作用，并能延長缺氧條件下動物的存活時間。能明顯改善腦缺血再灌損傷大鼠的神經(jīng)功能缺陷，改善行為障礙，明顯縮小腦梗死面積，明顯改善FeCl3所致的大鼠腦缺血造成的動物神經(jīng)功能損傷，使其障礙的改善，并能縮小腦梗死面積；迷迭香酸還有助于防止自由基造成的細胞受損，因此降低了癌癥和動脈硬化的風險。丹酚酸A主份原料中的紫草酸還有抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，預防動脈粥樣硬化、血管狹窄和血管內膜 增生，具有擴血管作用。能抑制尿酸和過超氧陰離子自由基的形成、抑制過氧化物的產(chǎn)生，有消炎和降尿酸的作用。體外能抑制促黃體激素釋放的作用。
丹酚酸A主份原料中的丹酚酸C還通過抑制微管蛋白聚合誘導細胞有絲分裂阻滯從而誘導凋亡，具有抗腫瘤細胞增殖活性。丹酚酸A主份原料中的丹酚酸A、丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸C組合后具有共同的對腦血管有保護作用、對動脈粥樣硬化及栓塞形成有防治作用、對腦缺血損傷有保護作用，使其比丹酚酸A單體化合物單獨使用作用更強，同時還有有消炎和降尿酸的作用、降低了癌癥和動脈硬化的風險。本發(fā)明提供的丹酚酸A凍干粉針，是在上述制備丹酚酸A主份原料工藝基礎上，根據(jù)丹酚酸A的化學與物理特性，從影響藥物穩(wěn)定的附加劑，劑型、容器、外界如空氣、光線、水分，雜質等產(chǎn)生化學反應反而導致藥劑的分解進行創(chuàng)造性的實驗分析。通過篩選制劑處方，反復試驗，選擇了甘露醇、葡萄糖、乳糖等，制成凍干粉針，粉針成型良好，塊狀物疏松，孔隙、色澤均勻，并且穩(wěn)定性非常高，通過加入少量抗氧劑，解決了由于空氣、光線、水分，雜質等產(chǎn)生化學反應導致的藥物分解。將丹酚酸A制成合適的制劑，解決了丹酚酸A制成注射劑穩(wěn)定性問題，通過選擇合適的輔料與劑型，保證了丹酚酸A藥理作用，為臨床提供安全、有效的丹酚酸A注射制劑。我們根據(jù)丹酚酸A的理化特性，通過選擇合適的劑型，篩選了不同的輔料，優(yōu)選了不同的制備工藝及工藝參數(shù)，制備出了穩(wěn)定、安全、有效、質量可控的丹酚酸A凍干粉針。本發(fā)明與現(xiàn)有技術對比表明:本發(fā)明通過創(chuàng)造性的勞動，最終確定了凍干速度降溫速度及冷凍時間，升華時升溫速度與溫度，確定真空升華時間，明確了干燥升溫速度和溫度，及干燥時間；創(chuàng)造性的明確定了冷凍降溫速度與溫度、升華升溫速度與溫度干燥升溫速度與溫度及時間之間的復雜關系，以及適宜的數(shù)值范圍的確定等，從而才最終獲得了穩(wěn)定的凍干粉針劑。重要的是，采用本發(fā)明制備方法制成的丹酚酸A凍干粉針完全可以不改變丹酚酸A原有的化學屬性；制成的丹酚酸A凍干粉針組合物與丹酚酸A相比具有水溶性好、熱穩(wěn)定性高、復溶性好等特點。更為重要的是， 本發(fā)明中的原料藥丹酚酸A通過堿液將pH值調整到適合范圍，再通過加入甘露醇等，使其更易于冷凍干燥，并且不影響藥性，而且制成凍干粉針后主藥丹酚酸A的含量有所提高，而丹酚酸B的含量有所降低，不會使制劑作用降低，反而會使制劑作用加強，起到了意想不到的效果。另一方面，本發(fā)明還提供了其用于預防和或治療缺血性腦血管病方面的用途。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，易卒中型腎血管性高血壓大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)術后麻醉蘇醒評分，模型組蘇醒后(12h內)的神經(jīng)行為評分(自發(fā)活動、四肢運動的對稱性、前肢伸展爬行動作的對稱性、爬籠壁、推軀干反應、觸須對刺激的反應等)顯著低于假手術組，說明腦血栓缺血后易卒中型腎血管性高血壓大鼠(RHRSP)神經(jīng)功能受損嚴重，且在持續(xù)的72h內，神經(jīng)行為評分持續(xù)明顯低于假手術組；尼莫地平組和丹酚酸A單體化合物組以及丹酚酸A凍干粉針各劑量組與模型組相比，大鼠蘇醒后的神經(jīng)行為有不同程度的升高，以丹酚酸A凍干粉針中、高劑量組最為明顯，且其缺血后24h的神經(jīng)行為已基本接近假手術組水平；至缺血后72h丹酚酸A凍干粉針各劑量組大鼠神經(jīng)行為已恢復正常，且同劑量丹酚酸A凍干粉針組大鼠的整體狀態(tài)比丹酚酸A單體化合物組恢復得快且稍好，神經(jīng)行為有更優(yōu)的趨勢。提示丹酚酸A凍干粉針能改善RHRSP腦血栓缺血后神經(jīng)行為，具有保護及改善腦缺血后神經(jīng)癥狀的作用，效果優(yōu)于尼莫地平，且有優(yōu)于同劑量丹酚酸A單體化合物的趨勢。經(jīng)過腦組織病理檢查實驗數(shù)據(jù)對比可知，假手術組腦組織雙側對稱，未見病變，模型組血管內血栓附著嚴重。與模型組比較，鏡下觀察丹酚酸A凍干粉針各劑量組大鼠缺血側大腦中動脈(MCA)局部血栓的長度縮短，在動脈壁附著面積減小，以高、中劑量組最為明顯。TTC染色可見梗死腦組織呈白色，丹酚酸A凍干粉針各劑量組中被染成白色的腦組織范圍比模型對照組顯著縮小。HE染色可見模型組缺血側皮層MCA供血區(qū)(以額頂皮質為中心)梗死灶內有明顯的腦組織軟化，細胞壞死，局部壞死組織脫落等現(xiàn)象，丹酚酸A凍干粉針高劑量組大鼠此處未見組織萎縮脫落現(xiàn)象；丹酚酸A凍干粉針各劑量組和模型對照組的HE染色顯示灶內、灶周均有小血·管增生，但是丹酚酸A凍干粉針各劑量組與模型組比較增生的小血管數(shù)目顯著增多；另外，HE染色顯示模型對照組可見大小不等的灶狀出血，丹酚酸A凍干粉針高、中劑量組并無發(fā)現(xiàn)有灶狀出血現(xiàn)象。結果顯示丹酚酸A凍干粉針能明顯改善RHRSP腦血栓缺血后腦組織病理狀態(tài)，降低血栓附著面積、減少梗死面積，增加梗死區(qū)內及周圍腦組織的小血管數(shù)、減少腦出血現(xiàn)象、從而保護腦組織壞死脫落，具有保護腦血栓缺血致腦組織損傷的作用，且優(yōu)于丹酚酸A單體化合物。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，腦血栓后腦組織血腦屏障破壞，通透性增加，伊文思藍(EB)結合白蛋白可通過開放的血腦屏障(BBB)進入腦組織。丹酚酸A凍干粉針給藥后，各劑量組大鼠腦組織顯微鏡下EB光斑數(shù)以及腦組織EB檢出含量明顯減少，且少于同劑量的丹酚酸A單體化合物組，與模型組比較均有顯著差異，說明丹酚酸A凍干粉針對腦組織損傷致血腦屏障通透性增加具有抑制作用，能保護血腦屏障，而保護腦組織進一步受損傷，作用效果強于丹酚酸A單體化合物。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，通過對RHRSP腦血栓大鼠模型組比較，假手術組未見梗死腦組織；丹酚酸A凍干粉針各劑量組腦組織梗死體積及腦含水量明顯小于模型對照組，且劑量越大，梗死體積越小，腦含水量越少。丹酚酸A凍干粉針低、中、高劑量組梗死體積及腦含水量均低于尼莫地平組；且比同劑量的丹酚酸A單體化合物組要低。說明丹酚酸A凍干粉針可加速病灶的修復，減小RHRSP腦血栓后缺血腦組織梗死范圍，減輕腦組織水腫，具有修復和保護缺血后腦組織損傷的作用，優(yōu)于丹酚酸A單體化合物及尼莫地平。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，與RHRSP腦血栓缺血模型組比較，缺血治療后，丹酚酸A凍干粉針各劑量組腦組織缺血半暗帶區(qū)MVD和血管場面積不同程度地顯著增高，較尼莫地平和同劑量丹酚酸A單體化合物更為明顯，且7d內比較穩(wěn)定。表明丹酚酸A凍干粉針能增加腦組織缺血半暗帶的MVD和血管場面積比，提示丹酚酸A凍干粉針有促進缺血腦組織微血管新生和側枝循環(huán)建立的作用，且效果優(yōu)于丹酚酸A單體化合物和尼莫地平。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，RHRSP腦血栓缺血模型組血管內皮生長因子信使核糖核酸(VEGFmRNA)表達水平較假手術組有明顯升高，說明腦組織缺血缺氧后能刺激腦組織內VEGF的表達增加，提示腦梗死后機體自身會出現(xiàn)一種對抗缺血性損傷的保護性反應，使VEGF的表達增加，在缺血后出現(xiàn)自身“代償性血管再生”。丹酚酸A凍干粉針各劑量組與模型組組比較，VEGFmRNA表達水平顯著升高，表明丹酚酸A凍干粉針能顯著促進缺血腦組織血管新生，促進側枝循環(huán)代償?shù)慕ⅲ炀热毖氚祹?，保護缺血導致的腦組織損傷，且存在一定的量效關系，有優(yōu)于同劑量丹酚酸A單體化合物的趨勢。
經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，RHRSP腦血栓缺血模型組大鼠腦組織堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)蛋白表達較假手術組有明顯升高，但隨缺血時間的延長，有下降的趨勢，提示腦組織缺血缺氧后，機體自身產(chǎn)生短暫的保護應激反應，可刺激腦組織bFGF蛋白表達增力口。丹酚酸A凍干粉針各劑量組與模型組比較，各時間段的bFGF蛋白表達顯著增高；各劑量組自身各時間段比較顯示，bFGF蛋白表達持續(xù)穩(wěn)定；提示丹酚酸A凍干粉針能增加缺血腦組織原發(fā)和繼發(fā)bFGF蛋白表達，具有很好的神經(jīng)細胞保護作用和促進血管生成的作用，有助于側枝循環(huán)的建立，挽救缺血半暗帶，且作用效果優(yōu)于丹酚酸A單體化合物和尼莫地平。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，丹酚酸A凍干粉針能減輕腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，有利于其神經(jīng)行為的恢復，丹酚酸A凍干粉針具有改善腦組織損傷后神經(jīng)功能的作用，且作用效果比丹酚酸A單體化合物明顯。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，丹酚酸A凍干粉針各劑量組與缺血再灌注損傷模型組相比:腦梗死體積比顯著減少，腦指數(shù)以及腦含水量均明顯減少，表明丹酚酸A凍干粉針能減少腦缺血再灌注大鼠腦組織梗塞范圍，能減輕腦缺血再灌注損傷后的腦組織水腫程度，效果優(yōu)于丹酚酸A單體化合物和尼莫地平。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，局灶性腦缺血大鼠，給予不同劑量丹酚酸A凍干粉針I(yè)Omin始，各藥物組較自身給藥前缺血半暗帶局部腦血流量(rCBF)有明顯上升，且以丹酚酸A凍干粉針高、中劑量組尤為顯著；丹酚酸A凍干粉針各劑量組相比，有良好的量效關系；丹酚酸A凍干粉針中劑量組各時段的rCBF與尼莫地平組相當。由此可知，丹酚酸A凍干粉針有增加腦缺血大鼠腦組織缺血半暗帶rCBF的作用，有利于挽救缺血半暗帶瀕臨死亡的腦組織，發(fā)揮治療腦缺血的作用，且有優(yōu)于丹酚酸A單體化合物的趨勢。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，在大鼠持續(xù)缺血2h恢復再灌后，各組大鼠缺血半暗帶rCBF均有不同程度的增加。但局灶性腦缺血再灌模型組大鼠缺血再灌3h內血流灌注極不穩(wěn)定，在恢復再灌I 1.5h 內，缺血半暗帶rCBF升至最高水平,但仍在缺血前的50%以下，腦組織仍呈低灌注狀態(tài)，且此后又急劇下降至缺血前40%以下，腦組織因再灌而加劇受損。而再灌后，尼莫地平、丹酚酸A凍干粉針高、中、低劑量組大鼠rCBF明顯增高，各時間段rCBF與模型組相比都有極顯著差異。再灌后lh，丹酚酸A凍干粉針高劑量組rCBF恢復至接近原rCBF的75%，尼莫地平組和丹酚酸A凍干粉針中劑量組恢復至約為原rCBF的69%，IOmg/kg丹酚酸A單體化合物組恢復至原rCBF的65%左右，丹酚酸A凍干粉針低劑量組恢復至約為原rCBF的61 %，且至再灌注3h內，各藥物組rCBF都維持在相對穩(wěn)定的范圍內。結果表明丹酚酸A凍干粉針能明顯改善大鼠缺血再灌注后缺血半暗帶腦組織的腦血流量，恢復腦細胞血供，從而挽救缺血半暗帶，防止腦組織進一步損傷甚至死亡，且效果優(yōu)于丹酚酸A單體化合物，對缺血性腦血管病有很好的治療作用。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，丹酚酸A凍干粉針能升高缺血腦組織三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、(單磷酸腺苷)AMP、磷酸肌酸(PC)的含量，降低腦組織乳酸(LA)含量，能顯著改善大鼠腦缺血以及缺血再灌注的能量代謝。丹酚酸A凍干粉針可通過改善缺血后腦組織的能量代謝，增加腦組織能量物質的供應，增強腦細胞的生存能力，挽救腦缺血后的缺血半暗帶瀕臨死亡的腦細胞，防止腦組織進一步損傷甚至死亡，且作用效果較丹酚酸A單體化合物和尼莫地平明顯，可很好地用于治療缺血性腦血管病。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，大鼠腦缺血2h再灌24h后，神經(jīng)細胞凋亡嚴重；而尼莫地平、丹酚酸A單體化合物以及不同劑量丹酚酸A凍干粉針干預后，與模型組比較，大鼠腦組織內神經(jīng)細胞凋亡顯著減少(P<0.001或P<0.01);且以丹酚酸A凍干粉針高、中劑量組的凋亡率最低；表明丹酚酸A凍干粉針具有抑制腦缺血損傷大鼠腦組織神經(jīng)元死亡、抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用，效果優(yōu)于丹酚酸A單體化合物和尼莫地平。神經(jīng)營養(yǎng)因子是神經(jīng)元生長與存活必需的一組蛋白質分子，對神經(jīng)元生長、發(fā)育以及功能的完整性起支持作用。神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的一部分，可以維持神經(jīng)元存活和促進神經(jīng)細胞分化和誘導軸突生長；能保護神經(jīng)元、促進神經(jīng)元修復以及抑制遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，從而對抗腦缺血、保護腦缺血損傷。大鼠腦缺血再灌后，大鼠腦組織內較假手術組有所增高，提示腦缺血再灌損傷后，腦組織內NGF、BDNF表達應激保護性增加；但缺血后腦組織內NT-3含量明顯減少。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，與模型對照組比較，丹酚酸A凍干粉針各劑量組NGF、BDNF, NT-3蛋白表達均明顯增強，且有優(yōu)于同劑量丹酚酸A單體化合物以及尼莫地平的趨勢。提示丹酚酸A凍干粉針能增強缺血損傷腦組織內源性神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF、BDNF、NT-3的表達，為神經(jīng)元存活提供條件，而達到神經(jīng)元保護的作用。大鼠腦缺血再灌注后，腦組織內炎癥細胞因子白細胞介素_1β (IL-Ιβ)、白細胞介素_6(IL-6)、白細胞介素_8(IL-8)、腫瘤壞死因子- a (TNF-α )、細胞間粘附分子-1 (ICAM-1)含量均極顯著增加；經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，給予丹酚酸A凍干粉針各劑量組的大鼠腦組織各炎癥細胞因子含量較模型組明顯降低，且較同劑量的丹酚酸A單體化合物組以及尼莫地平組顯著。提示丹酚酸A凍干粉針可以抑制缺血損傷腦組織炎癥細胞因子的表達，抑制腦組織炎癥反應的發(fā)生，抑制炎性反應介導的神經(jīng)元及腦組織級聯(lián)損傷，效果優(yōu)于丹酚酸A單體化合物和尼莫地平。細胞內Ca2+超載是腦缺血過 程中介導繼發(fā)性腦損害的重要機理之一，是缺血、缺氧產(chǎn)生不可逆神經(jīng)元損傷的最后共同途徑。Ca2+超載可通過激發(fā)作為第二信使的激活蛋白酶、激活磷脂酶、激活內切核酸酶等一系列酶反應對細胞產(chǎn)生損害，誘導細胞凋亡，導致急性細胞死亡和遲發(fā)性神經(jīng)元壞死。K+、Mg2+均為Ca2+拮抗劑。K+作為神經(jīng)細胞極化狀態(tài)必不可少的陽離子，可以抑制鈣離子的內流進而減輕鈣超載；Mg2+可激活機體內多種酶系，在腦組織內參與細胞多種重要的代謝活動，影響神經(jīng)傳導、離子轉運、蛋白合成及能量代謝諸多方面，能緩解血管平滑肌的痙攣，改善微循環(huán)，改善腦損傷后缺血缺氧，阻滯顱腦損傷后神經(jīng)細胞內鈣超載。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，腦缺血再灌注模型組與假手術組比較腦組織Ca2+含量極顯著增高，K+、Mg2+含量顯著降低；與模型組比較，尼莫地平組、丹酚酸A單體化合物組和丹酚酸A凍干粉針各劑量組能顯著降低腦組織中Ca2+含量、升高K+、Mg2+含量，且以丹酚酸A凍干粉針效果最為顯著。說明丹酚酸A凍干粉針能抑制Ca2+內流減輕鈣超載，從而可抑制Ca2+超載誘導的神經(jīng)元細胞凋亡。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，丹酚酸A凍干粉針能明顯提高腦缺血再灌注損傷大鼠的大腦皮層和紋狀體單胺類遞質5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)的含量，升高大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織中Y-氨基丁酸(GABA)、?；撬?Tau)含量、顯著降低腦組織中谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)的含量以及氨基酸興奮毒性指數(shù)。且劑量增加，作用增強。結合腦組織病理病理學檢查顯示的丹酚酸A凍干粉針能明顯減輕腦水腫，改善神經(jīng)元細胞形態(tài)的結果，表明丹酚酸A凍干粉針能抑制單胺類神經(jīng)遞質過度釋放，改善單胺類神經(jīng)遞質紊亂；抑制腦缺血再灌注中興奮性氨基酸的堆積，穩(wěn)定興奮性氨基酸-抑制性氨基酸遞質的平衡，減輕興奮性氨基酸毒性；從而抑制單胺類神經(jīng)遞質紊亂和興奮性氨基酸毒性誘導的神經(jīng)元細胞凋亡，且效果較同劑量丹酚酸A單體化合物以及尼莫地平更具有優(yōu)勢。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，丹酚酸A凍干粉針各劑量組與缺血再灌注模型組相比，大鼠腦組織中脂質過氧化物(LPO)含量顯著降低，且低于同劑量的丹酚酸A單體化合物組；超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性顯著升高，且有高于同劑量丹酚酸A單體化合物組的趨勢，效果較尼莫地平組也更明顯；說明丹酚酸A凍干粉針能增加缺血再灌注損傷腦組織中過氧化物清除酶的活性、抑制過氧化物的產(chǎn)生，從而對抗氧自由基對神經(jīng)元細胞和腦組織的損傷，其抗氧化作用有優(yōu)于同劑量的丹酚酸A單體化合物的趨勢。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，腦血栓缺血模型組各時間段的腦血管內皮細胞凋亡數(shù)目顯著高于假手術組，腦組織缺血后6h，內皮細胞凋亡就已明顯增多，至缺血后24小時達高峰。與模型組比較，丹酚酸A凍干粉針各劑量組的各時間段的細胞凋亡數(shù)顯著減少，且少于同劑量的丹酚酸A單體化合物和尼莫地平組。說明丹酚酸A凍干粉針能抑制腦缺血后腦血管內皮細胞凋亡，提高腦血管內皮細胞存活率，從而保證腦血管內皮細胞功能的正常，維持缺血損傷后腦血管結構和功能的完整而增強對抗腦缺血損傷的能力，發(fā)揮治療缺血性腦血管病作用。

經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，經(jīng)丹酚酸A凍干粉針和尼莫地平作用后，缺氧及缺氧-復氧損傷大鼠腦微血管內皮細胞存活率顯著升高，且丹酚酸A凍干粉針組存活率顯著高于尼莫地平組，且比同劑量的丹酚酸A單體化合物組的細胞存活率也要高。提示丹酚酸A凍干粉針能保護腦微血管內皮細胞缺氧及缺氧-復氧損傷，增強其耐缺氧能力，提高缺氧損傷以及缺氧-復氧損傷的腦微血管內皮細胞存活率，優(yōu)于尼莫地平和丹酚酸A單體化合物。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，缺氧-復氧損傷，能造成大鼠腦微血管內皮細胞各期凋亡率顯著增加。與模型組比較，丹酚酸A凍干粉針各劑量組、丹酚酸A單體化合物組及尼莫地平組均可顯著減低細胞早、晚期及總凋亡率；丹酚酸A凍干粉針各劑量組之間呈一定的量效關系。且丹酚酸A凍干粉針10 μ mol/L劑量組與尼莫地平40 μ mol/L劑量組效果相當，同劑量的丹酚酸A凍干粉針優(yōu)于丹酚酸A單體化合物。提示丹酚酸A凍干粉針具有良好的抗缺氧-復氧損傷導致的大鼠腦微血管內皮細胞凋亡的作用。不同劑量丹酚酸A凍干粉針、丹酚酸A單體化合物和尼莫地平作用后，缺氧-復氧損傷的大鼠腦微血管內皮細胞分泌組織纖維酶原激活物(t-PA)和一氧化氮(NO)的分泌量較模型組顯著升高(P < 0.01或P < 0.001)，其中丹酚酸A凍干粉針中、高劑量組升至接近正常對照組水平；各給藥組t-PA/PAI和NO/ΕΤ比值也較模型組顯著提高。實驗結果提示丹酚酸A凍干粉針能改善缺氧-復氧損傷后腦微血管內皮細胞的分泌功能，作用效果顯著優(yōu)于尼莫地平，且有優(yōu)于同劑量丹酚酸A單體化合物的趨勢。缺氧-復氧損傷后，BMVEC胞內Ca2+濃度顯著增高。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，與模型組比較，各藥物組Ca2+濃度極顯著降低，以丹酚酸A凍干粉針中、高劑量組效果最為顯著，細胞內鈣離子濃度顯著低于尼莫地平40 μ mol/L劑量組，且優(yōu)于同劑量的丹酚酸A單體化合物。提示丹酚酸A凍干粉針具有抑制缺氧-復氧損傷致BMVEC胞內Ca2+濃度的作用。
經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，丹酚酸A凍干粉針對大鼠動脈血栓形成時間的影響與生理鹽水對照組比較，丹酚酸A凍干粉針高、中、低劑量組的血栓形成時間顯著延長；低劑量組(0.5mg/kg)血栓形成時間與20mg/kg阿司匹林組相當；中劑量組比同劑量的丹酹酸A單體化合物組血栓形成時間延長；表明丹酚酸A凍干粉針能延長血栓形成時間，預防動脈血栓的形成，預防血栓而致的缺血性腦血管病。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，丹酚酸A凍干粉針對大鼠血栓形成的影響與生理鹽水組比較，丹酚酸A凍干粉針高、中、低劑量組大鼠血栓濕、干重均顯著減輕。且低劑量組與20mg/kg阿司匹林組效果相當。說明丹酚酸A凍干粉針具有很好的抑制血栓形成的作用，能用于預防或治療血栓所致的缺血性腦血管病，且比丹酚酸A單體化合物效果明顯。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，丹酚酸A凍干粉針對大鼠靜脈栓塞的影響與生理鹽水組比較，丹酚酸A凍干粉針高、中、低劑量組大鼠靜脈血栓濕、干重顯著減輕，低劑量組(0.5mg/kg)與20mg/kg阿司匹林組效果相當(P > 0.05);中劑量組較同劑量的丹酹酸A單體化合物效果明顯。表明丹酚酸A凍干粉針有抑制靜脈血栓形成的作用，可用于預防急性缺血性腦血管病發(fā)生后的靜脈血栓栓塞。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，丹酚酸A凍干粉針對大鼠體外血栓形成與生理鹽水組比較，丹酚酸A凍干粉針高、中、低劑量組大鼠體外血栓形成的長度顯著縮短，血栓濕、干重顯著減輕，低劑量組(0.5mg/kg)與20mg/kg阿司匹林組效果相當；表明丹酹酸A凍干粉針對體外血栓形成具有較好的抑制作用，且有優(yōu)于同劑量丹酚酸A單體化合物的趨勢。。經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，丹酚酸A凍干粉針對體內已形成的血栓的影響與生理鹽水組比較，生理鹽水組均持續(xù)栓塞，且無出現(xiàn)再通現(xiàn)象；各藥物組持續(xù)栓塞的動物數(shù)少，與生理鹽水組相比均有極顯著差異；丹酚酸A凍干粉針中劑量組，其血管開放程度與同劑量的丹酚酸A單體化合物組及2000U/kg尿激酶組相似，其再通率相當，但其血管開放狀態(tài)較丹酚酸A單體化合物和尿激酶組有更穩(wěn)定的趨勢；丹酚酸A凍干粉針高劑量組持續(xù)再通率以及再通率均高于尿 激酶組，且再栓率明顯低于尿激酶組；丹酚酸A凍干粉針低劑量組再通率雖低于尿激酶組，但其再栓率與尿激酶組相當，且有低于尿激酶再栓率的趨勢。說明丹酚酸A凍干粉針有較好的溶栓以及防止溶栓后再栓塞的作用，且作用較穩(wěn)定。腦血栓后，大鼠全血粘度、血漿粘度顯著增高，紅細胞壓積也顯著升高，經(jīng)過實驗數(shù)據(jù)對比可知，丹酚酸A凍干粉針各劑量組與模型組比較，其全血粘度和血漿粘度以及紅細胞壓積均明顯降低；結果提示丹酚酸A凍干粉針能加快微血流流速，降低血液粘度，改善血液流變學而有效對抗腦血栓的作用，且較尼莫地平組效果更顯著，亦有優(yōu)于同劑量丹酚酸A單體化合物的趨勢。綜上所述，本發(fā)明的丹酚酸A凍干粉針對缺血性腦血管病具有明顯的治療效果，本發(fā)明中所述缺血性腦血管病包括各種病因形成的影響腦循環(huán)的病變及其導致的以神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能的缺損為主的缺血性腦組織損害。主要包括一下的任何一種或幾種:(I)腦血栓:由來自心臟的栓子如人工瓣膜、房顫、心室血栓、擴張性心肌病、動/靜脈血管炎等形成栓子隨血液流入腦部血管，導致構成整個腦部血循環(huán)的前循環(huán)和后循環(huán)的各級血管的任何一部位和/或多部位血栓。(2)腦缺血再灌注損傷(3)腦栓塞。(4)顱外頸動脈和腦基底動脈的粥樣硬化或狹窄(5)腔隙性腦梗塞。(6)短暫性腦缺血性發(fā)作(7)血管性癡呆。醫(yī)學和藥學研究人員無法預先在不做相關實驗的前提下，預先得知丹酚酸A凍干粉針具有上述的良好用途。


圖1.丹酚酸A核磁共振氫譜圖；圖2.丹酚酸A核磁共振碳譜圖；圖3.紫草酸核磁共振氫譜圖；圖4.紫草酸核磁共振碳譜圖；圖5.迷迭香酸核磁共振氫譜圖；圖6.迷迭香酸核磁共振碳譜圖；圖7.丹酚酸B核磁共振氫譜圖；圖8.丹酚酸B核磁共振碳譜圖；圖9.丹酚酸C核磁共振氫譜圖；圖10.丹酚酸C核磁共振碳譜圖；圖11.混合對照品溶液HPLC圖；圖12.紫草酸對照品溶液HPLC圖；圖13.迷迭香酸對照品溶液HPLC
圖14.丹酚酸B對照品溶液HPLC圖；圖15.丹酚酸A對照品溶液HPLC圖；圖16.丹酚酸C對照品溶液HPLC圖；圖17.丹酚酸A組合物HPLC圖；圖18.注射用丹酚酸A凍干曲線圖；圖19.注射用丹酚酸A凍干真空曲線圖。
具體實施例方式實施例1取丹參藥材，粉碎成6目顆粒，每次加7倍量92°C水，溫浸提取3次，同時以25轉/分速度攪拌，每次溫浸提取3小時；提取液減壓濃縮至相對密度1.20 (600C )，加入乙醇使含醇量在70%，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸B20mg，水溶液用10%氫氧化鈉調pH至4.0，加入0.5% ZnCl2作為催化劑，120°C溫度加熱轉化4小時，轉化液用20%磷酸調pH值至2.5，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A3mg，經(jīng)HPD-100大孔樹脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹脂比為1: 50，樹脂柱徑高比為1: 10，分別用3倍柱體積水、5倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質，再用4倍柱體積40%乙醇洗脫，HPLC檢測，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；水溶液濃縮至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通過聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 10，樹脂柱徑高比為1: 8，分別用3倍柱體積水、12倍柱體積40%乙醇溶液洗脫除雜，再用8倍柱體積60%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的60%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20%磷酸調PH至2.5，用水溶液3倍量的叔丁基甲基醚，分3次萃取，分離有機層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入I 3倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的15倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 10，以正戊烷-叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷:叔丁基甲基醚(4: 6)洗脫10倍柱體積，正戊烷:叔丁基甲基醚出:4)洗脫10倍柱體積，減壓回收洗脫劑，回收有機溶劑后的丹酚酸A加12倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥溫度50°C，回差溫度4°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率60KW) 130分鐘，得丹酚酸A主份原料。經(jīng)測定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量為94.57 %，紫草酸含量0.663% ;迷迭香酸含量1.16% ;丹酚酸B含量1.24% ;丹酚酸C含量1.48%。實施例2取丹參藥材，粉碎成直徑約2_顆粒，每次加7倍量90°C水，溫浸提取3次，同時以25轉/分速度攪拌，每次溫浸提取3小時；提取液減壓濃縮至相對密度1.16(60°C)，加入乙醇使含醇量在70%，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸B20mg，水溶液用10%氫氧化鈉調pH至3.5，加入0.5% ZnCl2作為催化劑，120°C溫度加熱轉化4小時，轉化液用20%磷酸調pH值至2.5，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A3mg，經(jīng)HPD-100大孔樹脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹脂比為1: 50，樹脂柱徑高比為1: 10，分別用3倍柱體積水、5倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質，再用4倍柱體積40%乙醇洗脫，HPLC檢測，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；水溶液濃縮至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通過聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 10，樹脂柱徑高比為1: 8，分別用3倍柱體積水、12倍柱體積40%乙醇溶液洗脫除雜，再用8倍柱體積60%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的60%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20%磷酸調pH至2.5，用水溶液3倍量的叔丁基甲基醚，分3次萃取，分離有機層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酹酸A0.5g的萃取液,加入I 3倍量娃膠,攪拌,揮干；把攪拌樣娃膠加到已裝好的15倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑`高比為1: 10，以正戊烷-叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脫10倍柱體積，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脫10倍柱體積，減壓回收洗脫劑，回收有機溶劑后的丹酚酸A加10倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥溫度50°C，回差溫度2V，真空度-0.07Mpa以上，微波功率20KW) 120分鐘，得含丹酚酸A主份原料。經(jīng)測定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量為95.23 %，紫草酸含量0.70 %;迷迭香酸含量1.08% ;丹酚酸B含量1.21% ;丹酚酸C含量1.48%。實施例3取丹參藥材，切成飲片，每次加8倍量85°C水溫浸提取3次，同時以20轉/分速度攪拌，每次溫浸提取2.5小時；提取液減壓濃縮至相對密度1.20 (600C )，加入乙醇使含醇量在75%，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸B15mg，水溶液用10%氫氧化鉀調pH至5.0，加入0.6% ZnCl2作為催化劑，在120°C溫度加熱轉化3.5小時，轉化液用15%鹽酸調pH值至2.5，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A5mg，經(jīng)HPD-100大孔樹脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹脂比為1: 45，樹脂柱徑高比為1: 8，分別用3.5倍柱體積水、4倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質，再用5倍柱體積45%乙醇洗脫，HPLC檢測，收集含有丹酚酸A的45%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；水溶液濃縮至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通過聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 9，樹脂柱徑高比為1: 7，分別用4倍柱體積水、10倍柱體積40%乙醇溶液洗脫除雜，再用8倍柱體積65%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用15%鹽酸調pH至2.6，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分離有機層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.8g的萃取液，加入2 3倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的13倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 8，以正戊烷叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脫8倍柱體積，正戊烷-叔丁基甲基醚(6: 4)洗脫8倍柱體積，減壓回收洗脫劑，回收有機溶劑后的丹酚酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥溫度60°C，回差溫度2.5°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10KW) 130分鐘，得含丹酚酸A主份原料。經(jīng)測定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量為96.03 %，紫草酸含量0.60 %;迷迭香酸含量1.01% ;丹酚酸B含量1.08% ;丹酚酸C含量1.27%。實施例4取丹參藥材，粉碎成直徑約2mm顆粒，每次加9倍量85°C水溫浸提取2次，同時以30轉/分速度攪拌，每次溫·浸提取3.5小時；提取液減壓濃縮至相對密度1.18 (600C )，加入乙醇使含醇量在75%，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸B18mg，水溶液用10%碳酸鈉調pH至5.2，加入0.6% ZnCl2作為催化劑，在123°C溫度加熱轉化4.5小時，轉化液用15%硝酸調pH值至2.8，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A6mg，經(jīng)HPD-100大孔樹脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹脂比為1: 40，樹脂柱徑高比為1: 7，分別用4倍柱體積水、4倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質，再用5倍柱體積40%乙醇洗脫，HPLC檢測，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；水溶液濃縮至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通過聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 8，樹脂柱徑高比為1: 8，分別用4倍柱體積水、9倍柱體積40%乙醇溶液洗脫除雜，再用7倍柱體積65%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸AlOmg水溶液；水溶液用15%硝酸調pH至2.6，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分離有機層，減壓回收乙酸甲酯，制成每Iml含丹酚酸A0.7g的萃取液，加入3倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的10倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 7，以正戊烷-叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脫8倍柱體積，正戊烷-叔丁基甲基醚(6: 4)洗脫9倍柱體積，減壓回收洗脫劑，回收有機溶劑后的丹酚酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥溫度60°C，回差溫度3°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率5KW) 100分鐘，得含丹酚酸A主份原料。經(jīng)測定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量為94.72 %，紫草酸含量0.76 %;迷迭香酸含量1.13% ;丹酚酸B含量1.26% ;丹酚酸C含量1.46%。實施例5取丹參藥材，切成飲片，每次加10倍量80°C水溫浸提取3次，同時以15轉/分速度攪拌，每次溫浸提取3小時；提取液減壓濃縮至相對密度1.12 (600C )，加入乙醇使含醇量在70%，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸B20mg，水溶液用10%碳酸氫鈉調pH至4.4，加入0.8% ZnCl2作為催化劑，在128°C溫度加熱轉化4.0小時，轉化液用20%硫酸調pH值至2.6，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A5mg，經(jīng)HPD-100大孔樹脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹脂比為1: 40，樹脂柱徑高比為1: 7，分別用4倍柱體積水、4倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質，再用5倍柱體積40%乙醇洗脫，HPLC檢測，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；水溶液濃縮至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通過聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 10，樹脂柱徑高比為1: 15，分別用4倍柱體積水、7倍柱體積35%乙醇溶液洗脫除雜，再用6倍柱體積60%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的60%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用20%硫酸調pH至2.8，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分離有機層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入2.5倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的9倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 8，以正戊烷:叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脫8倍柱體積，正戊烷-叔丁基甲基醚(6: 4)洗脫8倍柱體積，減壓回收洗脫劑，回收有機溶劑后的丹酚酸A加10倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥溫度65°C，回差溫度4°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率12KW) 110分鐘，得含丹酚酸A主份原料。經(jīng)測定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量為95.23 %，紫草酸含量0.69 %;迷迭香酸含量1.17% ;丹酚酸B含量1.25% ;丹酚酸C含量1.47%。實施例6取丹參藥材，粉碎成直徑約2mm顆粒，每次加9倍量85°C水溫浸提取3次，同時以20轉/分速度攪拌，每次溫浸提取2.5小時；提取液減壓濃縮至相對密度1.1 (600C )，加入乙醇使含醇量在70%，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸BlOmg，水溶液用20%檸檬酸鈉調pH至5.5，加入0.4% ZnCl2作為催化劑，在132°C溫度加熱轉化3.5小時，轉化 液用20%醋酸調pH值至2.6，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A5mg，經(jīng)HPD-100大孔樹脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹脂比為1: 35，樹脂柱徑高比為1: 8，分別用3倍柱體積水、4.5倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質，再用6倍柱體積40%乙醇洗脫，HPLC檢測，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；水溶液濃縮至每ml含8mg丹酚酸A的溶液，通過聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 12，樹脂柱徑高比為1: 18，分別用4倍柱體積水、8倍柱體積30%乙醇溶液洗脫除雜，再用5倍柱體積65%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20%醋酸調pH至2.7，用5倍量的叔丁基甲基醚，分5次萃取，分離有機層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入2倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的10倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 10，以正戊烷、叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脫8倍柱體積，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脫8倍柱體積，減壓回收洗脫劑，回收有機溶劑后的丹酚酸A加12倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥溫度65°C，回差溫度5°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率15KW) 90分鐘，得含丹酚酸A主份原料。經(jīng)測定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量為95.24%，紫草酸含量0.69%；迷迭香酸含量1.07% ;丹酚酸B含量1.21% ;丹酚酸C含量1.46%。
實施例7取丹參藥材，粉碎成直徑約2mm顆粒，每次加9倍量88 °C水溫浸提取3次，同時以22轉/分速度攪拌，每次溫浸提取3.5小時；提取液減壓濃縮至相對密度1.24 (600C )，加入乙醇使含醇量在75%，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸B13mg，水溶液用10%氫氧化鈉調pH至3.6，加入0.5% ZnCl2作為催化劑，在133°C溫度加熱轉化4.5小時，轉化液用10%鹽酸調pH值至2.7，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A5mg，經(jīng)HPD-100大孔樹脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹脂比為1: 40，樹脂柱徑高比為1: 9，分別用4倍柱體積水、4倍柱體積22%乙醇洗脫，除去雜質，再用6倍柱體積43%乙醇洗脫，HPLC檢測，收集含有丹酚酸A的43%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；水溶液濃縮至每ml含IOmg丹酚酸A的溶液，通過聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 15，樹脂柱徑高比為1: 20，分別用4倍柱體積水、8倍柱體積30%乙醇溶液洗脫除雜，再用5倍柱體積60%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的60%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用10%鹽酸調pH至2.8，用5倍量的叔丁基甲基醚，分5次萃取，分離有機層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.5g的萃取液，加入3倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的12倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 10，以正戊烷、叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脫6倍柱體積，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脫7倍柱體積，減壓回收洗脫劑，回收有機溶劑后的丹酚酸A加10倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥溫度50°C，回差溫度1°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率3KW) 150分鐘，得含丹酚酸A主份原料。經(jīng)測定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量為95.02 %，紫草酸含量0.75%;迷迭香酸含量1.12% ;丹酚酸B含量1.26% ;丹酚酸C含量1.46%。實施例8
取丹參藥材，切成飲片，每次加9倍量90°C水溫浸提取3次，同時以25轉/分速度攪拌，每次溫浸提取3小時；提取液減壓濃縮至相對密度1.13(60°C)，加入乙醇使含醇量在75%，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸B20mg，水溶液用10%碳酸鈉調pH至3.5，加入1.0% ZnCl2作為催化劑，在135°C溫度加熱轉化4.5小時，轉化液用15%硫酸調pH值至3.0,離心,上清液減壓濃縮至每Iml含丹酹酸A5mg,經(jīng)HPD-100大孔樹脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹脂比為1: 36，樹脂柱徑高比為1: 9，分別用3倍柱體積水、4倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質，再用5倍柱體積45%乙醇洗脫，HPLC檢測，收集含有丹酚酸A的45%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味；水溶液濃縮至每Iml含6mg丹酚酸A的溶液，通過聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 10，樹脂柱徑高比為1: 10，分別用4倍柱體積水、8倍柱體積45%乙醇溶液洗脫除雜，再用8倍柱體積65%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸AlOmg水溶液；水溶液用15%硫酸調pH至2.7，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分離有機層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸A0.6g的萃取液，加入3倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的10倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 8，以正戊烷、叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脫8倍柱體積，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脫8倍柱體積，減壓回收洗脫劑，回收有機溶劑后的丹酚酸A加8倍量水溶解，用微波真空干燥(干燥溫度80°C，回差溫度4°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率60KW) 120分鐘，得含丹酚酸A主份原料。經(jīng)測定，所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A含量為95.34%，紫草酸含量0.62%;迷迭香酸含量1.10% ;丹酚酸B含量1.23% ;丹酚酸C含量1.47%。實施例9取實施例3制成的含丹酚酸A主份原料80g，加注射用水2800ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調pH值4.5，加入甘露醇60g使溶解，再加入維生素C0.5g,攪拌使溶解，混勻，加入活性炭2g攪拌吸附，濾過，除去活性炭；加注射用水至3000ml，檢測中間體含量，pH值，檢測合格后用0.22 μ m微孔濾膜濾過，濾液灌裝于無菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機，關閉箱門，開啟凍干機，以20°C /h速度降溫至_40°C，保溫冷凍16小時；抽真空至0.3mbar以下，在10小時內將凍結的丹酚酸A制劑溫度上升到_25°C，維持_25°C真空干燥8小時；繼續(xù)升溫，以0.5°C /min均勻升溫至41°C，維持41°C干燥3小時后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。實施例10取實施例4 制成的含丹酚酸A主份原料20g，加注射用水1800ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調pH值4.6，加入甘露醇40g使溶解，再加入維生素C0.3g,攪拌使溶解，混勻，加入活性炭Ig攪拌吸附，濾過，除去活性炭；加注射用水至2000ml，檢測中間體含量，pH值，檢測合格后用0.22 μ m微孔濾膜濾過，濾液灌裝于無菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機，關閉箱門，開啟凍干機，以30°C /h速度降溫至_45°C，保溫冷凍10小時；抽真空至0.3mbar以下，在14小時內將凍結的丹酚酸A制劑溫度上升到_27°C，維持_27°C真空干燥6小時；繼續(xù)升溫，以1.(TC /min均勻升溫至45°C，維持45°C干燥2小時后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。實施例11取實施例5制成的含丹酚酸A主份原料10g，加注射用水1500ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調pH值4.6，加入甘露醇20g使溶解，再加入維生素C0.8g,攪拌使溶解，混勻，加入活性炭1.2g攪拌吸附，濾過，除去活性炭；加注射用水至2000ml，檢測中間體含量，PH值，檢測合格后用0.22 μ m微孔濾膜濾過，濾液灌裝于無菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機，關閉箱門，開啟凍干機，以25°C /h速度降溫至_42°C，保溫冷凍12小時；抽真空至0.3mbar以下，在13小時內將凍結的丹酚酸A制劑溫度上升到_23°C，維持_23°C真空干燥7小時；繼續(xù)升溫，以0.8°C /min均勻升溫至420C，維持42°C干燥4小時后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。實施例12取實施例6制成的含丹酚酸A主份原料30g，加注射用水2000ml攪拌使溶解，用20%碳酸鈉調pH值4.6，加入甘露醇20g、乳糖IOg使溶解，再加入硫脲0.5g，攪拌使溶解，混勻,加入活性炭1.0g攪拌吸附，濾過，除去活性炭；加注射用水至2000ml，檢測中間體含量，pH值，檢測合格后用0.22 μ m微孔濾膜濾過，濾液灌裝于無菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機，關閉箱門，開啟凍干機，以29°C /h速度降溫至-44°C,保溫冷凍14小時；抽真空至0.3mbar以下,在11小時內將凍結的丹酹酸A制劑溫度上升到-26°C，維持-26°C真空干燥6.5小時；繼續(xù)升溫，以0.6°C /min均勻升溫至43°C，維持43°C干燥3.5小時后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。實施例13取實施例7制成的含丹酚酸A主份原料35g，加注射用水2500ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鉀調pH值4.6，加入葡萄糖30g使溶解，再加入亞硫酸氫鈉3g，攪拌使溶解，混勻，加入活性炭1.5g攪拌吸附，濾過，除去活性炭；加注射用水至3000ml，檢測中間體含量，PH值，檢測合格后用0.22 μ m微孔濾膜濾過，濾液灌裝于無菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機，關閉箱門，開啟凍干機，以27°C /h速度降溫至_43°C，保溫冷凍11小時；抽真空至0.3mbar以下，在12.5小時內將凍結的丹酚酸A制劑溫度上升到-24°C，維持-24°C真空干燥7.5小時；繼續(xù)升溫，以0.7°C /min均勻升溫至40°C，維持40°C干燥5小時后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。實施例14取實施例8制成的含丹酚酸A主份原料40g，加注射用水2700ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調pH值4.6，加入葡萄糖20g、乳糖20g使溶解，再加入焦亞硫酸鈉4g，攪拌使溶解，混勻，加入活性炭1.5g攪拌吸附，濾過，除去活性炭；加注射用水至3000ml，檢測中間體含量，PH值，檢測合格后用0.22 μ m微孔濾膜濾過，濾液灌裝于無菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機，關閉箱門，開啟凍干機，以28°C /h速度降溫至-41 °C，保溫冷凍13小時；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小時內將凍結的丹酚酸A制劑溫度上升到-25.5°C，維持-25.5°C真空干燥6.5小時；繼續(xù)升溫，以
0.9°C /min均勻升溫至44°C，維持44°C干燥3.5小時后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針 。實施例15取實施例1制成的含丹酚酸A主份原料60g，加注射用水2700ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調pH值4.6，加入甘露醇40g使溶解，再加入維生素C2g，攪拌使溶解，混勻，加入活性炭2g攪拌吸附，濾過，除去活性炭；加注射用水至3000ml，檢測中間體含量，pH值，檢測合格后用0.22 μ m微孔濾膜濾過，濾液灌裝于無菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機，關閉箱門，開啟凍干機，以24.5°C/h速度降溫至-42.5°C，保溫冷凍11.5小時；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小時內將凍結的丹酚酸A制劑溫度上升到-24.5 0C，維持-24.5°C真空干燥6.5小時；繼續(xù)升溫，以0.55 °C /min均勻升溫至42.5°C，維持42.5°C干燥2.5小時后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。實施例16取實施例2制成的含丹酚酸A主份原料70g，加注射用水2800ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調pH值4.6，加入甘露醇40g使溶解，再加入維生素C2g，攪拌使溶解，混勻，加入活性炭2g攪拌吸附，濾過，除去活性炭；加注射用水至3000ml，檢測中間體含量，pH值，檢測合格后用0.22 μ m微孔濾膜濾過，濾液灌裝于無菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機，關閉箱門，開啟凍干機，以28.5°C/h速度降溫至-44.5°C，保溫冷凍11.5小時；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小時內將凍結的丹酚酸A制劑溫度上升到-24.5°C，維持-24.5°C真空干燥6.5小時；繼續(xù)升溫，以0.75°C /min均勻升溫至43.5°C，維持43.5°C干燥3小時后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。實施例17取市售丹酚酸A單體化合物原料(丹酚酸A含量99.62%) 40g，加注射用水2700ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調pH值4.6，加入葡萄糖20g、乳糖20g使溶解，再加入焦亞硫酸鈉4g，攪拌使溶解，混勻,加入活性炭1.5g攪拌吸附，濾過，除去活性炭；加注射用水至3000ml，檢測中間體含量，pH值，檢測合格后用0.22 μ m微孔濾膜濾過，濾液灌裝于無菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機，關閉箱門，開啟凍干機，以28°C /h速度降溫至-41 °C，保溫冷凍13小時；抽真空至0.3mbar以下，在13.5小時內將凍結的丹酚酸A制劑溫度上升到-25.5°C，維持-25.5°C真空干燥6.5小時；繼續(xù)升溫，以0.9°C /min均勻升溫至44°C，維持44°C干燥3.5小時后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。實驗例1:丹酚酸A主份原料分析方法及分離、結構鑒定研究一、丹酚酸A主份原料分析方法研究1.儀器與試藥儀器:Waters e2695高效液相色譜儀，Empower2色譜工作站,2998 二極管陣列檢測器；Sartorius cp225D十萬分之一電子天平。色譜柱:YMCC18色譜柱(250 X 4.6mm, 5 μ m)；試劑:甲醇為色譜純，水為Millipore制備的超純水，其他試劑均為分析純。迷迭香酸對照 品、丹酚酸B對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用；紫草酸對照品、丹酚酸C對照品均購自上海海燦生物科技有限公司，丹酚酸A對照品為自制，經(jīng)純度標化含量為99.52%。2.對照品溶液及供試品溶液的制備2.1對照品溶液的制備:分別精密稱取紫草酸對照品約10.0Omg、迷迭香酸對照品約10.0Omg、丹酚酸B對照品約10.0Omg、丹酚酸C對照品約10.0Omg、丹酚酸A對照品約10.00mg，置不同IOOml量瓶中，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取紫草酸對照品、迷迭香酸對照品、丹酚酸B對照品、丹酚酸C對照品各IOml，置不同IOOml量瓶中，分別加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液。精密吸取上述儲備溶液各10ml，置同一 IOOml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。2.3供試品溶液的制備精密稱取實施例1樣品約10.0Omg,置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密吸取IOml至IOOml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。3.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八燒基娃燒鍵合娃膠為填充劑；流速1.0ml/min ;檢測波長:286nm ;柱溫300C ;理論板數(shù)按丹酚酸A峰計算應不低于10000。O 10分鐘時，甲醇的比例由30%升至40%，0.1 0.5%磷酸水溶液的比例由70%降至60% ;10 30分鐘時，甲醇的比例由40%升至55%，0.1 0.5%磷酸水溶液的比例由50%降至45% ；30 60分鐘時，甲醇的比例由55%升至80%，0.1 0.5%磷酸水溶液的比例由45 %降至20 %。
在上述條件下，5個對照品的色譜峰保留時間見表1，HPLC圖譜見圖11 17。表1.各對照品的色譜峰保留時間結果
權利要求
1.丹酚酸A凍干粉針用于制備保護腦血管內皮細胞藥物的用途，其中，所述丹酚酸A凍干粉針包括含丹酚酸A主份原料，填充劑和抗氧劑；其中所述凍干粉針的各成份按下列重量配比制成:含丹酚酸A主份原料20g 60g，填充劑20g 60g，抗氧劑為制成總量的0.02 % 0.1 %，其中所述含丹酚酸A主份原料中:丹酚酸A94 % 97 %，紫草酸0.2 % 1.5%，迷迭香酸0.2% 1.5%，丹酚酸B0.2% 1.5%，丹酚酸C0.4% 2.0% ； 所述丹酚酸A凍干粉針采用如下制備方法獲得: 取丹參藥材，切成飲片或粉碎成直徑約Imm 5mm顆粒，每次加3 15倍量、45 95°C水溫浸提取，同時以10 50轉/分速度攪拌，或加3 15倍量水煎煮提取，共提取I 3次，每次提取I 4小時；提取液減壓濃縮至相對密度1.0 1.25 (600C )，加入乙醇使含醇量在50% 85%，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無醇味，得丹參提取液；或者 取丹參藥材，切成飲片或粉碎成直徑約Imm 5mm顆粒，每次加3 15倍量30% 60%乙醇回流提取，每次提取I 4小時，共提取I 3次；減壓回收乙醇并濃縮至無醇味，得丹參提取液； 上述丹參提取液加水稀釋至每Iml含丹酚酸BI 30mg，水溶液用堿調pH至3.5 `6.5，加入與丹酚酸B摩爾百分比0.1 3%氯化鋅作為催化劑，在100 140°C溫度加熱轉化I 6小時； 轉化液調PH值至2.5 4.5，靜置、離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸Al 10mg，經(jīng)HPD-100大孔樹脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹脂比為1: 35 I: 70，樹脂柱徑高比為1: 4 1: 30，分別用I 8倍柱體積水、I 10倍柱體積10% 40%乙醇洗脫，除去雜質，再用2 10倍柱體積20% 60%乙醇洗脫，HPLC檢測，收集含有丹酚酸A的20% 60%乙醇洗脫 部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味； 水溶液濃縮至每Iml含1-1Omg丹酚酸A的溶液，通過聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 5 1: 25，樹脂柱徑高比為1: 4 1: 25，分別用I 10倍柱體積水、5 20倍柱體積20% 60%乙醇溶液洗脫除雜，再用4 15倍柱體積40% 90%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的40% 90%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至無醇味水溶液； 水溶液濃縮，調酸pH至2.0 4.0，用水溶液1-8倍量的叔丁基甲基醚，分2 6次萃取，分離有機層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酹酸Alg IOg的萃取液,加入I 3倍量硅膠，攪拌，揮干； 把攪拌樣硅膠加到已裝好的5 20倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 4 1: 25，以正戊烷-叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-叔丁基甲基醚(4: 6)洗脫6 30倍柱體積，正戊烷-叔丁基甲基醚出:4)洗脫6 30倍柱體積，減壓回收洗脫劑，回收有機溶劑后的丹酚酸A加5 20倍量水溶解，微波真空干燥，得所述含丹酚酸A主份原料， 取含丹酚酸A主份原料IOg 80g加注射用水1500 2800ml攪拌使溶解，用堿調pH值4.0 5.0，再加入所述填充劑使其溶解，再加入所述抗氧劑，攪拌使溶解混勻，再加入活性炭0.5 2g攪拌吸附，濾過除去活性炭，加注射用水灌裝成瓶，送入凍干機再進行冷凍干燥， 其中所述冷凍干燥包括如下步驟:A、冷凍:以20°C 30°C/h速度降溫至-40°C -45°C，保溫冷凍10 16小時； B、升華:抽真空至0.3mbar以下，在10 14小時內將凍結的丹酚酸A丹酚酸A制劑溫度上升到_23°C -27°C，維持-23°C -27°C真空干燥6 8小時； C、干燥:繼續(xù)升溫，以0.5°C 1.(TC /min均勻升溫至40°C 45°C，維持40°C 45°C干燥2 5小時后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
2.根據(jù)權利要求1所述的用途，還包括用于保護腦微血管內皮細胞損傷的用途。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的用途，其中所述填充劑用量為20mg 40mg/2ml 3ml。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的用途，其中微波真空干燥溫度:20-100°C，回差溫度1_5°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分鐘。
5.根據(jù)權利要求4所述的用途，其中微波真空干燥溫度:50-85°C，回差溫度2-4°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率10-80KW，干燥100-150分鐘。
6.根據(jù)權利要求5所述的用途， 其中微波真空干燥溫度:55-80°C，回差溫度2-3°C，真空度-0.07Mpa以上，微波功率25-60KW，干燥120-140分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種丹酚酸A凍干粉針用于制備保護腦血管內皮細胞藥物的用途，所述丹酚酸A凍干粉針包括含丹酚酸A主份原料，填充劑和抗氧劑；其中所述凍于粉針的各成份按下列重量配比制成含丹酚酸A主份原料20g～60g，填充劑20g～60g，抗氧劑為制成總量的0.02％～0.1％，其中所述含丹酚酸A主份原料中丹酚酸A94％～97％，紫草酸0.2％～1.5％，迷迭香酸0.2％～1.5％，丹酚酸B0.2％～1.5％，丹酚酸C0.4％～2.0％。
文檔編號A61P25/28GK103142576SQ20121048717
公開日2013年6月12日 申請日期2012年11月20日 優(yōu)先權日2012年11月20日
發(fā)明者呂武清, 歐陽婷, 崔剛, 蔣春紅, 張功俊, 劉艷紅 申請人:呂武清