專利名稱：一種丹酚酸a凍干粉針及其制備藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丹酚酸A凍干粉針及其制備藥物用途。
背景技術(shù)：
缺血性心臟病(IHD)是由于冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起冠狀動(dòng)脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害，最常見(jiàn)的原因是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈血栓及冠狀動(dòng)脈痙攣，約占缺血性心臟病的90%左右。其共同點(diǎn)是由于心肌供血不足所致氧的供需矛盾而造成心肌缺血、缺氧，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作，從而發(fā)生一系列病理生理改變及癥狀，引起心絞痛發(fā)作，甚至發(fā)生心肌梗塞而危及生命。根據(jù)冠狀動(dòng)脈病變的部位、范圍及病變嚴(yán)重程度、心肌缺血程度，臨床分五類無(wú)癥狀型心肌缺血、心絞痛型、心肌梗死型、缺血性心肌病型、猝死型。以心絞痛、心肌梗死、心源性猝死較為常見(jiàn)。而這些因冠脈病理改變引起的心臟病統(tǒng)稱為冠狀動(dòng)脈性心臟病簡(jiǎn)稱冠心病。因此一般情況下所說(shuō)的缺血性心臟病主要指冠心病、心絞痛。心臟沒(méi)有“氧倉(cāng)庫(kù)”，完全依賴心肌血供，所以一旦缺血，立刻會(huì)引起缺氧。氧是心肌細(xì)胞活動(dòng)必不可少的物質(zhì)，正常心肌細(xì)胞攝取血液氧含量達(dá) 65 75 %，其它組織僅攝取10 25 %。心肌缺氧的直接后果是心肌細(xì)胞有氧代謝減弱，產(chǎn)能減小，使心臟活動(dòng)時(shí)必需的能量供應(yīng)不足，引起心絞痛、心徘失常、心功能下降。同時(shí)，代謝的廢物也不能被有效及時(shí)地清除，易產(chǎn)生不利影響。缺血、缺氧、缺能量，最終會(huì)影響心臟的收縮功能。若有20% 25%的心肌停止收縮，通常會(huì)出現(xiàn)左室功能衰竭；若有40%以上的心肌不能收縮，就會(huì)有重度心泵功能衰竭。如果這種情況突然發(fā)生，就會(huì)出現(xiàn)非常危險(xiǎn)的心源性休克?？傂孕募」Ｋ谰统Ｅc這種情況相關(guān)。心肌缺血還會(huì)損害舒張功能。收縮不良和舒張不良結(jié)合起來(lái)，可引起復(fù)雜的物質(zhì)代謝紊亂和心肌電活動(dòng)失常。
因此改善心臟血管功能，增加心肌的供血供氧、降低氧的消耗，改善心肌代謝，緩解心絞痛，減小心肌梗死面積是藥物治療的主要目的。目前治療缺血性心臟病主要包括藥物治療和介入(PICA)或搭橋等手術(shù)治療。心絞痛發(fā)作時(shí)一般用硝酸脂類藥物，如舌下含化硝酸甘油，起效快，但是只能用于救急，緩解癥狀，不能從根本上治療心肌缺血。緩解期用藥包括硝酸酯類、他汀類、ACE1、β受體阻滯劑、鈣離子拮抗劑、溶栓藥(尿激酶、鏈激酶等) 及中藥等。能量代謝障礙是心肌缺損傷的使動(dòng)因素之一，近年來(lái)，通過(guò)優(yōu)化調(diào)節(jié)心肌能量代謝發(fā)揮抗心絞痛的一類促代謝類藥物亦頗受關(guān)注，有望成為新的一類治療或輔助藥物。而目前主要以冠脈血運(yùn)重建術(shù)、盡快恢復(fù)血流灌注為原則的缺血性心臟病基礎(chǔ)治療方法，亦存在不可忽視的風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，隨著血運(yùn)的恢復(fù)，某些受損的心肌細(xì)胞功能及結(jié)構(gòu)破壞反而加重，即發(fā)生心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。再灌注損傷是在心肌缺血后，再灌注的早期，氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致心肌中產(chǎn)生大量氧自由基、超氧陰離子，連同細(xì)胞及線粒體內(nèi)鈣超載等因素加速心肌細(xì)胞凋亡及壞死， 使得心肌梗死范圍擴(kuò)大、心功能迅速惡化。臨床表現(xiàn)為在閉塞的冠狀動(dòng)脈再通及梗死區(qū)血液灌流重建后一段時(shí)間內(nèi)，有的患者發(fā)生血壓驟降、心功能不全、心律失常甚至猝死等一系列病情惡化的現(xiàn)象。臨床實(shí)踐中如心肌梗死溶栓再通后、冠脈搭橋、心臟移植、心臟驟停心臟復(fù)蘇后、體外循環(huán)心臟手術(shù)后等均存在再灌注損傷問(wèn)題。如何做到既保證盡早恢復(fù)缺血組織的血流，又減輕甚至解除再灌注損傷的發(fā)生便成為又一冠心病防治中的重要課題。
世界衛(wèi)生組織在《全球疾病負(fù)擔(dān)》報(bào)告中發(fā)出警告，心血管系統(tǒng)疾病已成為全球范圍的主要死因。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球每年近2000萬(wàn)人突發(fā)急性心血管病，致死亡數(shù)占全球死亡的30%以上，其中43%死于冠心病。在地域分布上，80%以上的心血管疾病死亡發(fā)生在低中等收入國(guó)家。據(jù)報(bào)道，美國(guó)每年約有45 50萬(wàn)人死于心臟性猝死，而其中以缺血性心臟病(冠心病)占猝死原因的80%以上。近幾十年，冠心病發(fā)病率在我國(guó)逐年增高，目前在各類心臟病中居首位。2010年中國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)超過(guò)40%的人死于心血管疾病。冠心病的有效防治已成為不容忽視的全球性公共健康問(wèn)題，這類疾病防治藥物的研制已連續(xù)被列為我國(guó)“十一五”、“十二五”創(chuàng)新藥物重大專項(xiàng)研究的重點(diǎn)內(nèi)容，且將成為今后很長(zhǎng)一段時(shí)間重點(diǎn)研究的藥物類別，有著重大的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根及根莖， 具有活血化瘀、涼血消痛及養(yǎng)血安神的功效。丹參作為中醫(yī)傳統(tǒng)活血化瘀的藥物，因療效確切，自70年代開(kāi)始廣泛用于臨床各科，成為臨床應(yīng)用最多最廣的藥物之一。因具有改善微循環(huán)、擴(kuò)張冠脈、抑制血栓形成、抑制血小板聚集、保護(hù)缺血心肌等藥理作用，其制劑的近代臨床實(shí)踐主要應(yīng)用于缺血性心、腦血管疾病。常用含丹參的治療心肌缺血的中成藥有丹參片、復(fù)方丹參片、心可舒、冠脈寧等；囊括了擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈流量、降低血黏度和血凝、抑制血小板聚集、保護(hù)缺血心肌和改善微循環(huán)等藥理作用。適用于血瘀癥的胸痹病人以及心絞痛急性發(fā)作等。
丹參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是其中的水溶性酚酸類化合物，包括丹酚酸A-G、迷迭香酸及其甲酯、丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸等，以抗氧化、抗凝和抗炎為特點(diǎn)、同時(shí)具有保護(hù)脈管內(nèi)皮細(xì)胞、降脂、升高HDL、抗凝、激活纖溶、抑制纖維蛋白原合成、螫合鈣鐵離子等多種有益的藥理作用；其中以丹酚酸A活性最強(qiáng)。丹酚酸A可以提高損傷后大鼠心肌H9c2細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞凋亡，并有很強(qiáng)的抗氧化作用，可明顯減輕線粒體損傷。因 此丹酚酸A可通過(guò)減輕心肌細(xì)胞凋亡、提高機(jī)體抗氧化能力和保護(hù)心肌線粒體等機(jī)制對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用。丹酚酸A對(duì)心肌缺血再灌注損傷亦具有明顯的保護(hù)作用，而且作用優(yōu)于丹酚酸B(林治榮等丹酚酸A與丹酚酸B抗大鼠心肌缺血再灌注損傷的比較研究[D].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2011，22(2) =412-424)。
但是，丹酚酸A的天然含量極低(約為丹參藥材的O. 01-0. 06% ),使得原藥材成本過(guò)高，分離純化難度過(guò)大，嚴(yán)重制約著藥物的開(kāi)發(fā)和研究，成為其產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。另外，現(xiàn)有技術(shù)中，也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹酚酸B通過(guò)酯水解脫羧和苯并二氫呋喃環(huán)開(kāi)環(huán)反應(yīng)進(jìn)行降解可轉(zhuǎn)化成丹酚酸A，但上述現(xiàn)有技術(shù)的轉(zhuǎn)化過(guò)程無(wú)法控制，轉(zhuǎn)化副產(chǎn)物多，主產(chǎn)物丹酚酸A的產(chǎn)率較低。
盡管現(xiàn)有技術(shù)中也有一些專利文獻(xiàn)提出試圖克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，但都僅僅是單純的嘗試升溫、改變PH值或提高轉(zhuǎn)化前丹酚酸類化合物的濃度等等，沒(méi)有任何一項(xiàng)專利或現(xiàn)有技術(shù)深入、全面地研究轉(zhuǎn)化反應(yīng)都包括哪些主要影響因素，更沒(méi)有任何一項(xiàng)專利或現(xiàn)有技術(shù)提出這些因素如轉(zhuǎn)化前丹酚酸類化合物的濃度、PH值、溫度、時(shí)間等彼此之間如何協(xié)同作用共同對(duì)丹酚酸A產(chǎn)率產(chǎn)生影響。
在此基礎(chǔ)上，更很少有其他發(fā)明人或現(xiàn)有技術(shù)提出嘗試在轉(zhuǎn)化中加入催化劑以使反應(yīng)更加充分，目前現(xiàn)有技術(shù)中涉及到了采用催化劑進(jìn)行轉(zhuǎn)化的相關(guān)內(nèi)容僅存于在2010 年4月6日同一日提交的兩份專利申請(qǐng)文件中，這兩份專利申請(qǐng)文件分別是申請(qǐng)?zhí)枮?2010101436787，發(fā)明名稱為“一種催化轉(zhuǎn)化丹酚酸B制備丹酚酸A的方法”的專利申請(qǐng)以及申請(qǐng)?zhí)枮?010101436876，發(fā)明名稱為“一種初步純化丹酚酸B轉(zhuǎn)化原料的方法”的專利申請(qǐng)。在這兩份專利申請(qǐng)的說(shuō)明書中，雖然公開(kāi)了催化轉(zhuǎn)化丹酚酸B制備丹酚酸A的技術(shù)內(nèi)容，但其催化劑為尿素，尿素與丹酹酸B的摩爾比為(O. 4 O. 6) I,要求消耗和加入尿素非常高，因此生產(chǎn)成本非常高。并且，在上述兩份專利申請(qǐng)文件中，也同樣并未關(guān)注PH值及其他相關(guān)因素協(xié)同對(duì)丹酚酸A產(chǎn)率產(chǎn)生的影響。再者，其轉(zhuǎn)化原料為經(jīng)聯(lián)合色譜法初步純化的丹參水提物，其中丹酚酸B > 50%，這對(duì)轉(zhuǎn)化原料的純度及提純工藝均要求較高，工藝也較為復(fù)雜，進(jìn)一步增加了生產(chǎn)成本。更為關(guān)鍵的是，盡管其申請(qǐng)文件中聲稱“使用本方法制備的丹酚酸A丹酚酸B定向轉(zhuǎn)化率> 10%，甚至達(dá)60 %”。但由于尿素實(shí)際上并沒(méi)有開(kāi)環(huán)、脫水、脫羧作用，僅有成酯作用，因此，其轉(zhuǎn)化率根本達(dá)不到60%，并且該申請(qǐng)文件的具體實(shí)施例中的轉(zhuǎn)化率最高僅為53%，而且多個(gè)實(shí)施例的轉(zhuǎn)化率僅為10%、20%和30%。這與實(shí)際產(chǎn)業(yè)化的要求仍有很大差距。
丹酚酸A是由丹參素和咖啡酸縮合而成，含有多個(gè)酚羥基、羥基、酯鍵等活潑基團(tuán)，其對(duì)光和熱不穩(wěn)定，暴露空氣易氧，由于丹酚酸A的上述理化特性，制成丹酚酸A制劑， 其穩(wěn)定性并保證丹酚酸A藥理作用成為制劑的關(guān)鍵技術(shù)。發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種丹酚酸A凍干粉針用于預(yù)防和或治療缺血性心臟病方面的用途。
本發(fā)明提供的一種丹酚酸A凍干粉針用于制備預(yù)防和治療缺血性心臟病藥物的用途，所述丹酚酸A凍干粉針其重量配比為丹酚酸AlOg 80g，填充劑IOg 80g，抗氧劑為制成總量的O. 01% O. 2% ；
所述丹酚酸A凍干粉針的制備方法為
(I)提取丹參用水或乙醇溶液提取得到水提取液或醇提取液；
(2)轉(zhuǎn)化將步驟(I)得到的提取液，調(diào)pH至3. 5 6. 5，加摩爾百分比為O. 1%~3.O %的催化劑，在100 140°C加熱I 6小時(shí);
(3)純化:
a.將步驟(2)得到的溶液，調(diào)pH至2. 5 4. 5，離心，上清液經(jīng)非極性或弱極性大孔樹(shù)脂柱層析分離，用水洗脫后，用洗脫劑洗脫，高效液相檢測(cè)丹酚酸A，收集含有丹酚酸A 的洗脫液；
b.將步驟a得到的洗脫液用葡聚糖凝膠LH-20或0DS-C18或聚酰胺層析柱分離， 用洗脫劑洗脫，高效液相檢測(cè)丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脫液；
c.將步驟b得到的洗脫液調(diào)pH至2.0 4.0，經(jīng)有機(jī)溶劑萃取，分離有機(jī)溶劑相；
d.將步驟c得到的溶液用硅膠層析柱分離，用洗脫劑洗脫，高效液相檢測(cè)丹酚酸 A，收集含有丹酚酸A的洗脫液；
(4)干燥將步驟d得到的洗脫液，減壓回收洗脫劑，再加水溶解，真空干燥、噴霧干燥或微波真空干燥，得所述丹酚酸A ;
(5)取所述丹酚酸AlOg 80g加注射用水1500 2800ml攪拌使溶解，用堿調(diào)pH 值4. O 5. 0，加入所述填充劑使其溶解，再加入所述抗氧劑，攪拌使溶解混勻，再加入活性炭O. 5 2g攪拌吸附，濾過(guò)除去活性炭，加注射用水后灌裝成瓶，送入凍干機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥；
(6)所述冷凍干燥包括如下步驟
A、冷凍以20°C 30 V /h速度降溫至-40 V -45 V，保溫冷凍10 16小時(shí)；
B、升華抽真空至O. 3mbar以下，在10 14小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A制劑溫度上升到-23°C -27°C，維持-23°C -27°C真空干燥6 8小時(shí)；
C、干燥繼續(xù)升溫，以O(shè). 5°C 1. (TC /min均勻升溫至40°C 45°C，維持40°C 45°C干燥2 5小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
優(yōu)選的，其重量配比為丹酚酸A20g 60g，填充劑20g 60g，抗氧劑為制成總量的 O. 02% O. 1%ο
優(yōu)選的，其重量配比為丹酚酸A20g 40g，填充劑20g 40g，抗氧劑為制成總量的 O. 03% O. 08%。
優(yōu)選的，其中所述填充劑選自甘露醇、葡萄糖、乳糖中的任意一種或幾種，用量為 20mg 40mg/2ml 3ml。
優(yōu)選的，其中所述抗氧劑選自維生素C、硫脲、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉中的任意一種或幾種。
優(yōu)選的，其重量配比為丹酚酸A20g，填充劑甘露醇20g，抗氧劑維生素CO. 8g ;其制備方法為
取所述丹酹酸A20g,加注射用水1900ml攪拌使溶解,用氫氧化鈉鈉調(diào)pH值4. O 5. 0，加入甘露醇20g使溶解，再加入O. 8g維生素C，攪拌使溶解混勻，加入活性炭O. 5g攪拌吸附，濾過(guò)除去活性炭；加注射用水至2000ml，灌裝成1000瓶，冷凍干燥；
所述冷凍干燥包括如下步驟
A、冷凍以25°C /h速度降溫至_45°C，保溫冷凍15小時(shí)；
B、升華抽真空至O. 3mbar以下，在12小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A制劑溫度上升到-25°C，維持-25°C真空干燥8小時(shí)；
C、干燥繼續(xù)升溫，以O(shè). 8°C /min均勻升溫至40°C，維持40°C干燥3小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
優(yōu)選的，其中步驟(I)中所述的水提取方法為取丹參藥材，切成飲片或粉碎成直徑約2_顆粒，每次加3 15倍量水提取，共提取I 3次，每次提取I 4小時(shí)；提取液減壓濃縮至相對(duì)密度1. 10 1. 25 (600C )，加入乙醇使含醇量在30% 80%，離心，上清液減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味，所述水提取采用煎煮提取或45 95°C水溫浸提取，同時(shí)以 10 50轉(zhuǎn)/分速度攪拌，得丹參提取液。
優(yōu)選的，其中步驟(I)中所述的醇提取方法為取丹參藥材，切成飲片或粉碎成直徑約2mm顆粒，每次加3 15倍量30% 60%乙醇回流提取，每次提取I 4小時(shí)，共提取I 3次；減壓回收乙醇，得丹參提取液。
優(yōu)選的，其中步驟(I)中的提取液中丹酚酸B濃度為lmg/ml 30mg/ml或加水稀釋至 lmg/ml 30mg/ml。
優(yōu)選的，其中提取液中丹酹酸B濃度為5mg/ml 20mg/ml或加水稀釋至5mg/ml 20mg/ml。
優(yōu)選的，其中步驟⑵中的催化劑是氯化鐵、三氯化釕、氯化鋁、氯化鋅、氯化鈀中的一種或幾種，催化劑與丹酚酸B的摩爾百分比為O. 1% 3. 0%。
優(yōu)選的，其中催化劑與丹酚酸B的摩爾百分比為O. 5% 2. 0%。
優(yōu)選的，其中步驟a中所述大孔樹(shù)脂柱為HPD-80、HPD-100, HPD-100B, HPD-200A、 HPD-300、HPD-450、HPD-722、HPD-826、ADS-5、ADS-8、ADS-21、或 D101、AB-8 ;所述洗脫劑為水及不同比例的水與乙醇，并且先用水、10 40%乙醇洗脫，再用20 60%乙醇洗脫，高效液相檢測(cè)丹酚酸A，收集含有丹酚酸A部分，洗脫液濃縮至無(wú)醇味。
優(yōu)選的，其中步驟b中的所述洗脫劑為水及不同比例的水與乙醇，并且先用水、 20 60%乙醇溶液洗脫除雜，再用40 90%乙醇溶液洗脫，高效液相檢測(cè)丹酚酸A，收集含有丹酚酸A部分，洗脫液濃縮至無(wú)醇味。
優(yōu)選的，其中步驟c中所述的有機(jī)溶劑為叔丁基甲基醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯或甲酸乙酯。
優(yōu)選的，其中步驟d中所述洗脫劑為石油醚、正戊烷、正庚烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、叔丁基甲基醚組成的兩相溶劑。
優(yōu)選的，其中步驟⑷中所述微波真空干燥的溫度20-100°C，回差溫度1_5°C，真空度-O. 07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分鐘。
優(yōu)選的，其中步驟⑷中所述真空干燥的溫度50°C 90°C，真空度-O. 07Mpa以上，功率1 60KW，干燥2 20小時(shí)。
優(yōu)選的，其中步驟(4)中所述噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)口溫度150°C 350°C，出風(fēng)口溫度70°C 95°C，噴霧速度1 300ml/min。
優(yōu)選的，其中pH調(diào)節(jié)劑為磷酸、鹽酸、硫酸或醋酸。
優(yōu)選的，其中所述的用于預(yù)防和治療缺血性心臟病的藥物可用于治療以下病癥的一種或幾種冠心病、心絞 痛、缺血性心肌病、心肌梗死、心肌缺血性卒中、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、冠狀動(dòng)脈狹窄、心肌缺血再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化。
優(yōu)選的，其中所述丹酚酸A凍干粉針用于改善缺血心臟血流動(dòng)力學(xué)的用途。
優(yōu)選的，其中所述丹酚酸A凍干粉針用于改善缺血性心臟心功能的用途。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于增加缺血性心臟的冠脈血流量的用途。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于減少缺血性心臟心肌梗死范圍的用途。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于縮小心肌缺血范圍的用途。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于減輕心肌缺血程度的用途。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于保護(hù)心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)心肌酶活性的用途。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于抑制缺血心肌組織炎癥反應(yīng)的用途。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于保護(hù)心肌線粒體損傷的用途。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于改善心肌代謝的用途。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于改善心肌代謝的用途包括用于改善以下心肌代謝的一種或幾種心肌氧自由基代謝、脂肪酸代謝、能量代謝。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于降低心肌耗氧量的用途。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于改善血液流變學(xué)的用途。
優(yōu)選的，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于抑制血栓形成的用途。
本發(fā)明提供的丹酚酸A凍干粉針主藥是丹酚酸A，本發(fā)明通過(guò)對(duì)丹參的提取、轉(zhuǎn)化、純化、干燥工藝，得到了丹酚酸A :經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的篩選和優(yōu)化，首先比較確定了起始原料丹酚酸B的提取溶劑和提取方法，由于丹酚酸B水溶性較好，確定了采用水提取或低濃度醇提取，又由于丹酚酸B熱穩(wěn)定性較差，確定了采用熱水溫浸提取并加攪拌提取方法，或用低濃度乙醇回流提取，使提取溶度低于100°C，保持丹酚酸B不被破壞，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了最佳溶劑用量和提取時(shí)間，得到了適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的丹酚酸B最佳提取工藝的。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比表明起始原料用丹參藥材直接提取即可進(jìn)行投料轉(zhuǎn)化， 不需對(duì)丹酚酸B進(jìn)行純化后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，即本發(fā)明催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，反應(yīng)原料丹酚酸B不需要高純度，例如不需要丹酚酸B的純度>50%。一般認(rèn)為反應(yīng)原料越純?cè)胶?，本發(fā)明的催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，丹酚酸B的純度高低對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)效果沒(méi)有影響。相反，實(shí)驗(yàn)證明，丹酚酸B純度> 50%時(shí)不但產(chǎn)生大量雜質(zhì)，且沒(méi)有提高轉(zhuǎn)化率。再者，本發(fā)明通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)比較，首先確定了對(duì)丹酚酸A產(chǎn)率產(chǎn)生重要影響的因素如轉(zhuǎn)化前丹酚酸類化合物的濃度、pH值、溫度、 時(shí)間等。在此基礎(chǔ)上，又通過(guò)付出大量的時(shí)間、物質(zhì)和精力反復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)溫度、PH值、時(shí)間、丹酚酸B的濃度及其他相關(guān)條件進(jìn)行了研究，以及這些因素彼此之間如何協(xié)同作用共同對(duì)丹酚酸A產(chǎn)率產(chǎn)生影響，從而確定了丹酚酸B轉(zhuǎn)化丹酚酸A的需要控制的最佳溫度、pH值、時(shí)間等，并將丹酹酸B起始濃度控制在lmg/ml 30mg/ml,從而使得本發(fā)明丹酹酸A轉(zhuǎn)化率更加明顯優(yōu)于其 他轉(zhuǎn)化條件?；瘜W(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)物的純度與濃度常常影響反應(yīng)的效果。一般情況下對(duì)反應(yīng)物有純度要求，且認(rèn)為濃度高比濃度低好。然而，本發(fā)明的催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)中， 丹酚酸B的濃度高低對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)效果沒(méi)有影響。相反，實(shí)驗(yàn)證明，丹酚酸B濃度高不但產(chǎn)生大量雜質(zhì)，且沒(méi)有提高轉(zhuǎn)化率。而且含丹酚酸B水溶液中丹酚酸B的濃度并非越高越好， 30mg/ml以上濃度轉(zhuǎn)化率反而低，效果更差。因此，本發(fā)明的生產(chǎn)工藝在節(jié)約成本和生產(chǎn)周期方面，具有預(yù)料不到的技術(shù)效果。在現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有給出任何技術(shù)啟示的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員如果僅從理論上推斷，是不可能得出在上述各條件參數(shù)下將丹酸B轉(zhuǎn)化成丹酚酸A 具有更好的轉(zhuǎn)化效果的結(jié)論。
更為重要的是，本發(fā)明通過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)，發(fā)現(xiàn)氯化鐵、三氯化釕、氯化鋁、氯化鋅或氯化鈀作為催化劑能顯著提高丹酚酸B轉(zhuǎn)化丹酚酸A的轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率非常穩(wěn)定的能達(dá)到接近60 %，多數(shù)情況都可以超過(guò)60 %，這在以往任何一項(xiàng)現(xiàn)有技術(shù)中都是不可能的，因此，取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果。
由于丹酚酸A含量較低，經(jīng)轉(zhuǎn)化后丹酚酸A含量大提高，但還含大量雜質(zhì)，因此， 分別選擇了弱極性和非極性大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行粗分離，再選擇聚酰胺等、溶劑萃取、硅膠分離，并對(duì)不同流份進(jìn)行測(cè)定，去除雜質(zhì)部分后，將丹酚酸A含量從10%左右提高到80%，至 90%，至 93%，至 96%。
進(jìn)一步，在顯著提高轉(zhuǎn)化率的同時(shí)，本發(fā)明通過(guò)適于實(shí)際產(chǎn)業(yè)應(yīng)用的純化步驟，尤其是通過(guò)一系列的分離、洗脫處理等步驟后，沒(méi)有采用傳統(tǒng)的常壓干燥，而是采用真空干燥、噴霧干燥、微波真空干燥，從而徹底克服了以往干燥溫度過(guò)高，干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)及對(duì)丹酚酸A的破壞大的缺陷；而冷凍干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，成本極高且冷凍干燥所得的的提取物無(wú)法完全去除溶劑殘留問(wèn)題。
本發(fā)明還可以將低純度與高純度的丹酚酸B直接混合，只需配成合適的起始轉(zhuǎn)化濃度，同樣可以達(dá)到轉(zhuǎn)化成丹酚酸A的目的，這種轉(zhuǎn)化原料的制備工藝非常簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本降低的同時(shí)非常適于實(shí)際產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的丹酚酸A凍干粉針，根據(jù)丹酚酸A的化學(xué)與物理特性，從影響藥物穩(wěn)定的附加劑，劑型、容器、外界如空氣、光線、水分，雜質(zhì)等產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)反而導(dǎo)致藥劑的分解進(jìn)行創(chuàng)造性的實(shí)驗(yàn)分析。通過(guò)篩選制劑處方，反復(fù)試驗(yàn)，選擇了甘露醇、葡萄糖、乳糖等， 制成凍干粉針，粉針成型良好，塊狀物疏松，孔隙、色澤均勻，并且穩(wěn)定性非常高，解決了由于空氣、光線、水分，雜質(zhì)等產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致的藥物分解。將丹酚酸A制成合適的制劑，解決了丹酚酸A制成注射劑穩(wěn)定性問(wèn)題，通過(guò)選擇合適的輔料與劑型，保證了丹酚酸A藥理作用，為臨床提供安全、有效的丹酚酸A注射制劑。
基于上述原因，我們根據(jù)丹酚酸A的理化特性，通過(guò)選擇合適的劑型，篩選了不同的輔料，優(yōu)選了不同的制備工藝及工藝參數(shù)，制備出了穩(wěn)定、安全、有效、質(zhì)量可控的丹酚酸 A凍干粉針。
本發(fā)明中的丹酚酸A通過(guò)堿液將pH值調(diào)整到適合范圍，再通過(guò)加入甘露醇等，使其更易于冷凍干燥，并且不影響藥性。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比表明本發(fā)明通過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)，最終確定了凍干速度降溫速度及冷凍時(shí)間，升華時(shí) 升溫速度與溫度，確定真空升華時(shí)間，明確了干燥升溫速度和溫度，及干燥時(shí)間；創(chuàng)造性的明確定了冷凍降溫速度與溫度、升華升溫速度與溫度干燥升溫速度與溫度及時(shí)間之間的復(fù)雜關(guān)系，以及適宜的數(shù)值范圍的確定等，從而才最終獲得了穩(wěn)定的凍干粉針劑。
更為重要的是，采用本發(fā)明制備方法制成的丹酚酸A凍干粉針完全可以不改變丹酚酸A原有的化學(xué)屬性；制成的丹酚酸A凍干粉針與丹酚酸A相比具有水溶性好、熱穩(wěn)定性高、復(fù)溶性好等特點(diǎn)。
另一方面，本發(fā)明還提供了其用于預(yù)防和或治療缺血性心臟病藥物的用途，并且通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證明
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知,模型組缺血再灌注60min,CBF、+dp/dt max、-dp/dtmax明顯下降，LVEDP顯著增高。與模型組比較，陽(yáng)性藥物組、丹酚酸A凍干粉針高、中、低劑量組上述指標(biāo)均有明顯改善，能抑制缺血再灌注引起的冠脈流量減少、左室舒張壓上升、左室內(nèi)壓最大上升速率下降、左室內(nèi)壓最大下降速率下降。且丹酚酸A凍干粉針組高劑量組與陽(yáng)性藥物組效果相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示丹酚酸A凍干粉針能減輕大鼠離體心臟缺血再灌注損傷程度，提示丹酚酸A凍干粉針能明顯改善冠脈血流量、改善離體心臟主動(dòng)脈舒張功能和受損心肌的舒縮功能、保護(hù)心臟缺血再灌注損傷。
經(jīng)對(duì)心肌缺血大鼠心電及心功能影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈致大鼠長(zhǎng)期心肌缺血模型大鼠心電圖ST段顯著提高，其HR、動(dòng)脈壓、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dt max均顯著下降，模型組大鼠心肌收縮功能明顯降低，靜脈給藥7d后，各藥物組大鼠ST段明顯下降；各項(xiàng)指標(biāo)綜合顯示，各藥物組中以丹酚酸A凍干粉針中、高劑量對(duì)長(zhǎng)期心肌缺血大鼠的心電及心功能指標(biāo)改善效果最為明顯，提示丹酚酸A凍干粉針能降低心肌缺血大鼠ST段的升高、改善心率、增高其動(dòng)脈壓、改善心肌舒縮力，對(duì)心肌缺血大鼠的心電及心臟功能有明顯的改善作用。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，丹酚酸A凍干粉針能使心肌缺血大鼠血清中SOD活性增高，抑制MDA的生成，降低血清內(nèi)AST、CK和LDH活性，說(shuō)明丹酚酸A凍干粉針能抑制氧自由基產(chǎn)生，提高心肌組織的抗氧化能力，保護(hù)心肌細(xì)胞膜，減少酶的溢出，改善心肌的能量供應(yīng)，降低缺血對(duì)心肌的損傷程度，從而起到心肌缺血保護(hù)作用。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，心肌缺血模型組大鼠出現(xiàn)明顯的心肌缺血梗死，梗死范圍達(dá)53 %左右；與模型組相比，不同劑量丹酚酸A凍干粉針注射給藥7d后，大鼠的心肌梗死范圍顯著降低，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。提示丹酚酸A凍干粉針能縮小心肌梗死范圍，減輕心肌缺血損傷及心梗程度，對(duì)心肌缺血具有明顯治療作用。
光鏡和電鏡結(jié)果提示，丹酚酸A凍干粉針能明顯改善心肌缺血大鼠的心肌病理改變，減輕心肌病理?yè)p傷，可用于缺血性心臟病的治療。
觀察大鼠心肌缺血-再灌不同時(shí)間心肌梗死范圍，模型組大鼠心肌缺血1. 5h，再灌注6h后心肌梗死嚴(yán)重，且在恢復(fù)灌注48h內(nèi)，梗死范圍逐步增大，心肌損傷加劇。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，與模型組比較，不同劑量丹酚酸A凍干粉針能明顯縮小心肌梗死范圍，減輕心肌缺血再灌損傷，且心肌梗死范圍并不隨缺血再灌時(shí)間延長(zhǎng)而擴(kuò)大；各劑量組之間存在一定劑效關(guān)系。提示丹酚酸A凍干粉針能縮小實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注大鼠的心肌梗死范圍，減輕心肌損傷程度，對(duì)心肌缺血-再灌注損傷具有較好的防治作用。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，大鼠在心肌缺血-再灌注24h，心肌組織SOD、GSH-Px、CAT 酶活顯著下降，MDA、XOD酶活顯著升高，提示大鼠心肌缺血-再灌注后，過(guò)氧化產(chǎn)物堆積嚴(yán)重，心肌清除過(guò)氧化產(chǎn)物能力顯著下降，缺血再灌引起大量氧自由基產(chǎn)生導(dǎo)致心肌損傷加 重。藥物組與模型組比較，心肌組織SOD、GSH-Px, CAT酶活不同程度升高，MDA、XOD酶活不同程度降低，丹酚酸A凍干粉針高、中劑量組效果最明顯。提示丹酚酸A能增強(qiáng)心肌清除自由基能力，抑制氧自由基產(chǎn)生，增強(qiáng)大鼠心肌抗氧化能力，抑制心肌缺血-再灌注損傷。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，結(jié)扎犬冠狀動(dòng)脈后60min到結(jié)扎后ISOmin期間(即給藥后45min到藥后165in期間)，各藥物組犬心外膜電圖ST段抬高總數(shù)(Σ -ST)持續(xù)下降，與模型組比較均有顯著性差異；恢復(fù)再灌注后，各藥物組Σ -ST與模型組比較亦顯著降低。丹酚酸A凍干粉針各劑量組之間存在一定量效關(guān)系，丹酚酸A凍干粉針中劑量組Σ -ST 下降幅度與O. 5mg/kg注射用鹽酸地爾硫卓組相當(dāng)。提示丹酚酸A凍干粉針能減輕實(shí)驗(yàn)缺血-再灌注犬的心肌缺血程度。提示其能保護(hù)心肌缺血損傷，對(duì)缺血性心臟病具有良好的治療作用。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，結(jié)扎犬冠狀動(dòng)脈后60min到結(jié)扎后ISOmin期間(即給藥后45min到藥后165in期間)，各藥物組犬心外膜電圖N-ST仍持續(xù)降低，且與模型組比較均有顯著性差異；恢復(fù)再灌注后，各藥物組N-ST與模型組比較亦顯著降低。丹酚酸A凍干粉針各劑量組之間存在一定量效關(guān)系，丹酚酸A凍干粉針中劑量組N-ST減少率與O. 5mg/kg 注射用鹽酸地爾硫卓組相當(dāng)。提示丹酚酸A凍干粉針能減少實(shí)驗(yàn)缺血-再灌注犬的心肌缺血范圍。提示其能保護(hù)心肌缺血損傷，對(duì)缺血性心臟病具有良好的治療作用。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)據(jù)對(duì)比可知，模型組犬心肌缺血-再灌注后，心肌梗死較重。丹酚酸A凍干粉針、注射用鹽酸地爾硫卓均能顯著減少實(shí)驗(yàn)犬心肌梗死范圍，且以丹酚酸A凍干粉針高劑量組犬心肌梗死比值最小。與模型組比較，丹酚酸A凍干粉針高、中劑量組能極顯著減少梗死心肌占心臟及心室的比重，丹酚酸A凍干粉針低劑量犬心肌梗死區(qū)占心臟及心室的比重亦明顯降低，提示丹酚酸A凍干粉針能劑量依賴性地縮小實(shí)驗(yàn)犬心肌梗死范圍，能保護(hù)心肌缺血-再灌注損傷，用于治療缺血性心臟病。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，結(jié)扎犬冠狀動(dòng)脈形成心肌缺血，給藥后45min至給藥后 225min(即結(jié)扎60min至240min)，各藥物治療組冠脈流量與給藥前比較，增加了 25. 3% 52. 6%之間；以丹酚酸A凍干粉針高、中劑量組、注射用鹽酸地爾硫卓組最為顯著，增幅分別為52. 6%,40. 2%,36. 7%。提示丹酚酸A凍干粉針能促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)開(kāi)放，增加心肌缺血時(shí)的冠脈血流量，從而對(duì)抗心肌缺血，保護(hù)心肌缺血損傷，提示其在防治缺血性心臟病方面有一定的用途。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，丹酚酸A凍干粉針給藥后15min(即缺血30min)能顯著抑制LVEDP升高、抑制土dp/dtmax下降、抑制犬LVW減少、降低TPR，給藥后45min(即缺血 60in后)能顯著抑制CO下降；呈劑量依賴性；提示丹酚酸A凍干粉針給藥后，能改善心肌缺血犬血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)犬的心肌收縮力、改善心肌舒縮功能，降低外周阻力，抑制心輸出量減少、提高心臟的泵血功能，改善心肌血液供應(yīng)，改善心肌缺血狀態(tài)及心功能， 發(fā)揮抗心肌缺血作用。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，心肌缺血模型組犬血清中CK、LDH、AST、CK-MB顯著升高， 說(shuō)明結(jié)扎冠脈缺血后，犬心肌線粒體破壞，心肌細(xì)胞損傷，心肌酶被釋放出來(lái)致血清中心肌酶活升高。丹酚酸A凍干粉針各劑量組與模型組比較，能不同程度地降低犬心肌缺血4h后血清中CK、LDH、AST、CK-MB活性，且呈劑量依賴性；說(shuō)明丹酚酸A凍干粉針能能穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜，減少心肌缺血損傷時(shí)心肌酶的溢出，對(duì)缺血心肌具有明顯保護(hù)作用。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，模型組犬在缺血4h后，血清中游離脂肪酸(FFA)、過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO)顯著升高，提示心肌缺血后心肌脂肪酸代謝出現(xiàn)障礙，將會(huì)抑制萄萄糖氧化主要酶的活性，從而增加心肌耗氧量，擴(kuò)大心肌梗塞范圍。而丹酚酸A凍干粉針各劑量組與模型組比較，能顯著降低心肌缺血犬血清中FFA、LP0含量，且呈劑量依賴關(guān)系。提示丹酚酸A 凍干粉針能顯著抑制血清中FFA水平升高，改善心肌脂肪酸代謝，降低乳酸的堆積，增加單位氧耗的產(chǎn)能量，降低心肌耗氧量，從而改善心功能，抑制心肌梗塞范圍，保護(hù)心肌缺血損傷。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，模型組犬心肌缺血4h后血清中MDA含量顯著升高，S0D、 GSH-Px活性顯著下降，提示犬心肌缺血后，氧自由基生成明顯增加，體內(nèi)清除氧自由基的酶活顯著降低，而氧自由基會(huì)通過(guò)一系列氧化反應(yīng)影響細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，加劇心肌缺血損傷程度。丹酚酸A凍干粉針各劑量組與模型組比較，能顯著降低心肌缺血犬血清中MDA 的含量，同時(shí)使血清中S0D、GSH-Px活性明顯增強(qiáng)，且呈一定的劑效關(guān)系；提示丹酚酸A凍干粉針能通過(guò)某種機(jī)制抑制脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程，減少氧自由基生成，同時(shí)又能提高內(nèi)源性抗氧化酶活性而減輕氧自由基對(duì)心肌的損傷，提高缺血心肌的抗氧化能力而發(fā)揮抗心肌缺血作用。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，不同劑量的丹酚酸A凍干粉針能不同程度地減少心肌耗氧量以及氧利用率，其中丹酚酸A凍干粉針高、中劑量組缺血120min (即給藥后105min)氧利用率較給藥前分別降低了近20%、16%。說(shuō)明丹酚酸A凍干粉針能降低心肌耗氧量及氧利用率，改善心肌氧的供需平衡，改善心室功能，發(fā)揮保護(hù)缺血心肌的作用，防治心肌缺血。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，不同劑量丹酚酸A凍干粉針能使心肌缺血犬血液粘度、 血漿粘度、紅細(xì)胞臟積及血小板粘附率不同程度地降低，明顯降低血漿中纖維蛋白含量；各劑量組之間呈一定劑效趨勢(shì)；提示丹酚酸A凍干粉針能降低血粘度，抑制血小板粘附聚集， 預(yù)防血管內(nèi)血栓形成，改善心肌缺血犬血液流變學(xué)，改善微循環(huán)，能用于防治缺血性心臟病。
經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，不同劑量的丹酚酸A凍干粉針能顯著減輕大鼠血栓濕、 干重，對(duì)血栓形成具有明顯的抑制作用；各劑量組之間呈一定的量效關(guān)系。
提示丹酚酸A凍干粉針具有抑制大鼠體內(nèi)血栓形成的作用，提示其可用于防治血栓所致的缺血性心臟病。
醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究人員無(wú)法預(yù)先在不做相關(guān)實(shí)驗(yàn)的前提下，預(yù)先得知丹酚酸A凍干粉針具有上述的良好用途。


圖1.
圖2.
圖3.
圖4.
圖5.
圖6.丹酚酸B對(duì)照品高效液相色譜圖；丹參提取液中丹酚酸B高效液相色譜圖；丹酚酸A對(duì)照品高效液相色譜圖；丹酚酸B催化轉(zhuǎn)化液 中丹酚酸A高效液相色譜圖。 丹酚酸A凍干粉針凍干曲線圖。丹酚酸A凍干粉針真空曲線圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
取丹參藥材，粉碎成6目顆粒，每次加7倍量92°C水，溫浸提取3次，同時(shí)以25轉(zhuǎn) /分速度攪拌，每次溫浸提取3小時(shí)；提取液減壓濃縮至相對(duì)密度1. 20 (600C )，加入乙醇使含醇量在70%，靜置，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸B20mg，水溶液用10%氫氧化鈉調(diào)pH至4. 0，加入O. 5% ZnCl2作為催化劑，120°C溫度加熱轉(zhuǎn)化4小時(shí)，轉(zhuǎn)化液用20%磷酸調(diào)pH值至2. 5，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸 A3mg，經(jīng)HPD-100大孔樹(shù)脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹(shù)脂比為1: 50，樹(shù)脂柱徑高比為1: 10，分別用3倍柱體積水、5倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質(zhì)，再用4倍柱體積40%乙醇洗脫，HPLC檢測(cè)，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；水溶液濃縮至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通過(guò)聚酚胺層析柱分離，丹酚酸 A上樣量與聚酰胺比為1: 10，樹(shù)脂柱徑高比為1: 8，分別用3倍柱體積水、12倍柱體積 40%乙醇溶液洗脫除雜，再用8倍柱體積60%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的60%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用20%磷酸調(diào) PH至2. 5，用水溶液3倍量的叔丁基甲基醚，分3次萃取，分離有機(jī)層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸AO. 5g的萃取液，加入I 3倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的15倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 10，以正戊烷-叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷叔丁基甲基醚(4 6)洗脫10倍柱體積，正戊烷叔丁基甲基醚出4)洗脫10倍柱體積，減壓回收洗脫劑，回收有機(jī)溶劑后的丹酚酸A加12倍量水溶解，用微波真空干燥(微波真空干燥溫度60°C，回差溫度3°C，真空度-O. 07Mpa以上， 微波功率20KW) 100分鐘，得丹酚酸A。
實(shí)施例2
取丹參藥材，切成飲片，每次加8倍量90°C水溫浸提取3次，同時(shí)以20轉(zhuǎn)/分速度攪拌，每次溫浸提取2. 5小時(shí)；提取液減壓濃縮至相對(duì)密度1. 15 (600C )，加入乙醇使含醇量在75%，靜置，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸 B15mg，水溶液用10%氫氧化鉀調(diào)pH至4. 0，加入O. 6% FeCl3作為催化劑，在120°C溫度加熱轉(zhuǎn)化3. 5小時(shí)，轉(zhuǎn)化液用15%鹽酸調(diào)pH值至2. 5，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A5mg，經(jīng)HPD-100大孔樹(shù)脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹(shù)脂比為1: 45，樹(shù)脂柱徑高比為1:8，分別用3. 5倍柱體積水、4倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質(zhì)，再用5 倍柱體積45%乙醇洗脫，HPLC檢測(cè)，收集含有丹酚酸A的45%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；水溶液濃縮至每ml含5mg丹酚酸A的溶液，通過(guò)聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 9，樹(shù)脂柱徑高比為1: 7，分別用4倍柱體積水、10倍柱體積 40%乙醇溶液洗脫除雜，再用8倍柱體積65%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用15%鹽酸調(diào) pH至2. 6，用4倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分離有機(jī)層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸AO. 8g的萃取液，加入2 3倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好13倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 8，以正庚烷-乙酸乙酯為洗脫劑，梯度洗脫， 分別用正庚烷-乙酸乙酯(4 6)洗脫8倍柱體積，正庚烷-乙酸乙酯(7 3)洗脫8倍柱體積，減壓回收洗脫劑，再加8倍量水溶解，真空干燥(干燥溫度65°C，真空度-O. 07Mpa 以上，功率10KW)3小時(shí)，得丹酚酸A。
實(shí)施例3
取丹參藥材，粉碎成直徑約2mm顆粒，每次加9倍量85°C水溫浸提取2次，同時(shí)以30轉(zhuǎn)/分速度攪拌，每次溫浸提取3. 5小時(shí)；提取液減壓濃縮至相對(duì)密度1. 10 (600C )， 加入乙醇使含醇量在75%，靜置，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；加水稀釋至每 Iml含丹酚酸B18mg，水溶液用10%碳酸鈉調(diào)pH至5. 2，加入O. 6% AlCl3作為催化劑，在 123°C溫度加熱轉(zhuǎn)化4. 5小時(shí)，轉(zhuǎn)化液用15%硝酸調(diào)pH值至2. 8，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A6mg，經(jīng)HPD-100B大孔樹(shù)脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹(shù)脂比為1: 40，樹(shù)脂柱徑高比為1: 7，分別用4倍柱體積水、4倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質(zhì)，再用5倍柱體積40%乙醇洗脫，HPLC檢測(cè)，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脫部分， 減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；水溶液濃縮至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通過(guò)聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 8，樹(shù)脂柱徑高比為1: 8，分別用4倍柱體積水、9倍柱體積40%乙醇溶液洗脫除雜，再用7倍柱體積65%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸AlOmg水溶液；水溶液用15%硝酸調(diào)pH至2. 6，用4倍量的乙酸甲酯，分4次萃取，分離有機(jī)層，減壓回收乙酸甲酯，制成每Iml含丹酚酸AO. 7g的萃取液，加入3倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的10倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 7，以石油醚、甲酸乙酯為洗脫劑，梯度洗脫，分別用石油醚-甲酸乙酯(4 6)洗脫8倍柱體積，石油醚-甲酸乙酯(6 4)洗脫9 倍柱體積，減壓回收洗脫劑，再加8倍量水溶解，噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)口溫度170°C，出風(fēng)口溫度 85°C，噴霧速度150ml/min)，得丹酚酸A。
實(shí)施例4
取丹參藥材，切成飲片，每次加IO倍量80°C水溫浸提取3次，同時(shí)以15轉(zhuǎn)/分速度攪拌，每次溫浸提取3小時(shí)；提取液減壓濃縮至相對(duì)密度1. 18(60°C)，加入乙醇使含醇量在 70%，靜置，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸B20mg， 水溶液用10%碳酸氫鈉調(diào)pH至5. 4，加入O. 8% RuCl3作為催化劑，在128°C溫度加熱轉(zhuǎn)化4.O小時(shí)，轉(zhuǎn)化液用20%硫酸調(diào)pH值至2. 6，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A5mg， 經(jīng)HPD-826大孔樹(shù)脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹(shù)脂比為1: 40，樹(shù)脂柱徑高比為1: 7，分別用4倍柱體積水、4倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質(zhì)，再用5倍柱體積 40%乙醇洗脫，HPLC檢測(cè)，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；水溶液濃縮至每ml含6mg丹酚酸A的溶液，通過(guò)ODS層析柱分離，丹酚酸A上樣量與ODS比為1: 10，樹(shù)脂柱徑高比為1: 15，分別用4倍柱體積水、7倍柱體積35%乙醇溶液洗脫除雜，再用6倍柱體積60%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的60%乙醇溶液部分， 減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用20%硫酸調(diào)pH至2. 8，用4 倍量的乙酸丁酯，分4次萃取，分離有機(jī)層，減壓回收乙酸丁酯，制成每Iml含丹酚酸AO. 5g 的萃取液，加入2. 5倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的9倍量干硅膠柱上， 硅膠柱徑高比為1: 8，以正戊烷、乙酸甲酯為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-乙酸甲酯 (4.5 5.5)洗脫8倍柱體積，正戊烷-乙酸甲酯￠.5 3.5)洗脫8倍柱體積，減壓回收洗脫劑，再加10倍量水溶解，用微波真空干燥(微波真空干燥溫度55°C，回差溫度2°C，真空度-O. 07Mpa以上，微波功率30KW) 120分鐘，得丹酚酸A。
實(shí)施例5
取丹參藥材，粉碎成直徑約2mm顆粒，每次加9倍量85 °C水溫浸提取3次，同時(shí)以20轉(zhuǎn)/分速度攪拌，每次溫浸提取2. 5小時(shí)；提取液減壓濃縮至相對(duì)密度1. 22 (600C )， 加入乙醇使含醇量在70%，靜置，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；加水稀釋至每 Iml含丹酚酸BlOmg，水溶液用20%檸檬酸鈉調(diào)pH至3. 5，加入O. 4% PdCl3作為催化劑，在 132°C溫度加熱轉(zhuǎn)化3. 5小時(shí)，轉(zhuǎn)化液用20%醋酸調(diào)pH值至2. 6，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A5mg，經(jīng)HPD-826大孔樹(shù)脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹(shù)脂比為1: 35，樹(shù)脂柱徑高比為1: 8，分別用3倍柱體積水、4. 5倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質(zhì)，再用6倍柱體積40%乙醇洗脫，HPLC檢測(cè)，收集含有丹酚酸A的40%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；水溶液濃縮至每ml含8mg丹酚酸A的溶液，通過(guò)ODS層析柱分離，丹酚酸A上樣量與ODS比為1: 12，樹(shù)脂柱徑高比為1: 18，分別用4倍柱體積水、8倍柱體積30%乙醇溶液洗脫除雜，再用5倍柱體積65%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸A15mg水溶液；水溶液用 20%醋酸調(diào)pH至2. 7，用5倍量的乙酸乙酯，分5次萃取，分離有機(jī)層，減壓回收乙酸乙酯， 制成每Iml含丹酚酸AO. 5g的萃取液，加入2倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的10倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 10，以正戊烷、乙酸甲酯為洗脫劑，梯度洗脫， 分別用正戊烷-乙酸甲酯(4.5 5.5)洗脫8倍柱體積，正戊烷-乙酸甲酯(6.5 3.5)洗脫8倍柱體積，減壓回收洗脫劑，再加12倍量水溶解，用微波真空干燥(微波真空干燥溫度65°C，回差溫度1°C，真空度-O. 07Mpa以上，微波功率30KW) 90分鐘，得丹酚酸A。
實(shí)施例6
取丹參藥材，粉碎成直徑約2mm顆粒，每次加9倍量88°C水溫浸提取3次，同時(shí)以22轉(zhuǎn)/分速度攪拌，每次溫浸提取3. 5小時(shí)；提取液減壓濃縮至相對(duì)密度1. 16 (600C )， 加入乙醇使含醇量在75%，靜置，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；加水稀釋至每 Iml含丹酚酸B13mg，水溶液用10%氫氧化鈉調(diào)pH至3. 6，加入O. 5% CuCl2作為催化劑，在 133°C溫度加熱轉(zhuǎn)化4. 5小時(shí)，轉(zhuǎn)化液用10%鹽酸調(diào)pH值至2. 7，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A5mg，經(jīng)HPD-DlOl大孔樹(shù)脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹(shù)脂比為1: 40，樹(shù)脂柱徑高比為1: 9，分別用4倍柱體積水、4倍柱體積22%乙醇洗脫，除去雜質(zhì)，再用6倍柱體積43%乙醇洗脫，HPLC檢測(cè)，收集含有丹酚酸A的43%乙醇洗脫部分， 減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；水溶液濃縮至每ml含IOmg丹酚酸A的溶液，通過(guò)ODS層析柱分離，丹酚酸A上樣量與葡聚糖凝膠LH-20比為1: 15，樹(shù)脂柱徑高比為1: 20，分別用4倍柱體積水、8倍柱體積30%乙醇溶液洗脫除雜，再用5倍柱體積60%乙醇溶液洗脫， 收集含有丹酚酸A的60%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸A12mg水溶液；水溶液用10%鹽酸調(diào)pH至2. 8，用5倍量的乙酸甲酯，分5次萃取，分離有機(jī)層，減壓回收乙酸甲酯，制成每Iml含丹酚酸AO. 5g的萃取液，加入3倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的12倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 10，以正戊烷、乙酸甲酯為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-乙酸甲酯(4 6)洗脫6倍柱體積，正戊烷-乙酸甲酯(6 4)洗脫7倍柱體積，減壓回收洗脫劑，再加10倍量水溶解，真空干燥(干燥溫度 600C，真空度-O. 07Mpa以上，功率15KW)干燥3. 5小時(shí)，得丹酚酸A。
實(shí)施例7
取丹參藥材，切成飲片，每次加9倍量90°C水溫浸提取3次，同時(shí)以25轉(zhuǎn)/分速度攪拌，每次溫浸提取3小時(shí)；提取液減壓濃縮至相對(duì)密度1. 12(60°C)，加入乙醇使含醇量在 75%，靜置，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；加水稀釋至每Iml含丹酚酸B20mg， 水溶液用10%碳酸鈉調(diào)pH至5. 0，加入1. 0% ZnCl2作為催化劑，在135°C溫度加熱轉(zhuǎn)化4. 5 小時(shí)，轉(zhuǎn)化液用15%硫酸調(diào)pH值至3. O,離心,上清液減壓濃縮至每Iml含丹酹酸A5mg,經(jīng) AB-8大孔樹(shù)脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹(shù)脂比為1: 36，樹(shù)脂柱徑高比為 1:9，分別用3倍柱體積水、4倍柱體積25%乙醇洗脫，除去雜質(zhì)，再用5倍柱體積45%乙醇洗脫，HPLC檢測(cè)，收集含有丹酚酸A的45%乙醇洗脫部分，減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味； 水溶液濃縮至每Iml含6mg丹酚酸A的溶液，通過(guò)聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 10，樹(shù)脂柱徑高比為1: 10，分別用4倍柱體積水、8倍柱體積45%乙醇溶液洗脫除雜，再用8倍柱體積65%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的65%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸AlOmg水溶液；水溶液用15%硫酸調(diào)pH至2. 7，用4 倍量的叔丁基甲基醚，分4次萃取，分離有機(jī)層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸AO. 6g的萃取液，加入3倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的10倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 8，以正戊烷、乙酸乙酯為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-乙酸乙酯(4 6)洗脫8倍柱體積，正戊烷-乙酸乙酯(6 4)洗脫8倍柱體積，減壓回收洗脫劑，再加8倍量水溶解，用微波真空干燥(微波真空干燥溫度70°C，回差溫度4°C，真空度-O. 07Mpa以上，微波功率25KW) 110分鐘，得丹酚酸A。
實(shí)施例8
取丹參藥材，粉碎成直徑約2mm顆粒，每次加9倍量85 °C水溫浸提取3次，同時(shí)以22轉(zhuǎn)/分速度攪拌，每次溫浸提取3小時(shí)；提取液減壓濃縮至相對(duì)密度1. 14(600C )， 加入乙醇使含醇量在70%，靜置，濾過(guò)，濾液減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；加水稀釋至每 Iml含丹酚酸B25mg，水溶液用10%檸檬酸鈉調(diào)pH至4. 2，加入O. 4% AlCl3作為催化劑，在 133°C溫度加熱轉(zhuǎn)化4. 5小時(shí)，轉(zhuǎn)化液用10%鹽酸調(diào)pH值至2. 8，離心，上清液減壓濃縮至每Iml含丹酚酸A5mg，經(jīng)HPD-300大孔樹(shù)脂柱層析分離，丹酚酸A上樣量與大孔吸附樹(shù)脂比為1: 45，樹(shù)脂柱徑高比為1: 10，分別用5倍柱體積水、6倍柱體積20%乙醇洗脫，除去雜質(zhì)，再用5倍柱體積45%乙醇洗脫，HPLC檢測(cè)，收集含有丹酚酸A的45%乙醇洗脫部分， 減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味；水溶液濃縮至每Iml含8mg丹酚酸A的溶液，通過(guò)聚酰胺層析柱分離，丹酚酸A上樣量與聚酰胺比為1: 12，樹(shù)脂柱徑高比為1: 8，分別用3倍柱體積水、6倍柱體積45%乙醇溶液洗脫除雜，再用8倍柱體積55%乙醇溶液洗脫，收集含有丹酚酸A的55%乙醇溶液部分，減壓回收乙醇并濃縮至每Iml含丹酚酸AlOmg水溶液；水溶液用15%鹽酸調(diào)pH至2. 9，用5倍量的叔丁基甲基醚，分5次萃取，分離有機(jī)層，減壓回收叔丁基甲基醚，制成每Iml含丹酚酸AO. 6g的萃取液，加入2. 5倍量硅膠，攪拌，揮干；把攪拌樣硅膠加到已裝好的12倍量干硅膠柱上，硅膠柱徑高比為1: 8，以正戊烷、叔丁基甲基醚為洗脫劑，梯度洗脫，分別用正戊烷-叔丁基甲基醚(4 6)洗脫8倍柱體積，正戊烷-叔丁基甲基醚出4)洗脫8倍柱體積，減壓回收洗脫劑，再加9倍量水溶解，用微波真空干燥(微波真空干燥溫度65°C，回差溫度5°C，真空度-O. 07Mpa以上，微波功率40KW) 120分鐘，得丹酚酸A。
實(shí)施例9
取實(shí)施例3制成的丹酚酸A80g，加注射用水2800ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調(diào)pH值4. 5，加入甘露醇60g使溶解，再加入維生素CO. 5g,攪拌使溶解，混勻,加入活性炭 2g攪拌吸附,濾過(guò),除去活性炭；加注射用水至3000ml，檢測(cè)中間體含量，pH值，檢測(cè)合格后用O. 22 μ m微孔濾膜濾過(guò)，濾液灌裝于無(wú)菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000 瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機(jī)，關(guān)閉箱門，開(kāi)啟凍干機(jī)，以20°C /h速度降溫至-40°C， 保溫冷凍16小時(shí)；抽真空至O. 3mbar以下，在10小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A制劑溫度上升到-25 °C，維持-25 °C真空干燥8小時(shí)；繼續(xù)升溫，以O(shè). 5°C /min均勻升溫至41°C，維持41°C 干燥3小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
實(shí)施例10
取實(shí)施例4制成的丹酚酸A20g，加注射用水1900ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調(diào)pH值4. 8，加入甘露醇20g使溶解，再加入維生素CO. 8g,攪拌使溶解，混勻，加入活性炭O. 5g攪拌吸附，濾過(guò)，除去活性炭；加注射用水至2000ml，檢測(cè)中間體含量，pH值，檢測(cè)合格后用O. 22 μ m微孔濾膜濾過(guò)，濾液灌裝于無(wú)菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機(jī)，關(guān)閉箱門，開(kāi)啟凍干機(jī)，以25 V /h速度降溫至_45°C，保溫冷凍15小時(shí)；抽真空至O. 3mbar以下，在12小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A制劑溫度上升到_25°C，維持_25°C真空干燥8小時(shí)；繼續(xù)升溫，以O(shè). 8°C /min均勻升溫至40°C， 維持40°C干燥3小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
實(shí)施例11
取實(shí)施例5制成的丹酚酸AlOg，加注射用水1500ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調(diào)pH值4. 6，加入甘露醇20g使溶解，再加入維生素CO. 8g,攪拌使溶解，混勻，加入活性炭1. 2g攪拌吸附，濾過(guò)，除去活性炭；加注射用水至2000ml，檢測(cè)中間體含量，pH值，檢測(cè)合格后用O. 22 μ m微孔濾膜濾過(guò)，濾液灌裝于無(wú)菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機(jī)，關(guān)閉箱門，開(kāi)啟凍干機(jī)，以25 V /h速度降溫至_42°C，保溫冷凍12小時(shí)；抽真空至O. 3mbar以下，在13小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A制劑溫度上升到_23°C，維持_23°C真空干燥7小時(shí)；繼續(xù)升溫，以O(shè). 8°C /min均勻升溫至42°C， 維持42°C干燥4小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
實(shí)施例12
取實(shí)施例6制成的丹酚酸A30g，加注射用水2000ml攪拌使溶解，用20%碳酸鈉調(diào) pH值4. 2，加入甘露醇20g、乳糖IOg使溶解，再加入硫脲O. 5g，攪拌使溶解，混勻，加入活性炭1. Og攪拌吸附，濾過(guò)，除去活性炭；加注射用水至2000ml，檢測(cè)中間體含量，pH值，檢測(cè)合格后用O. 22 μ m微孔濾膜濾過(guò)，濾液灌裝于無(wú)菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機(jī)，關(guān)閉箱門，開(kāi)啟凍干機(jī)，以29°C /h速度降溫至-44°C，保溫冷凍14小時(shí)；抽真空至O. 3mbar以下，在11小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A制劑溫度上升到_26°C，維持_26°C真空干燥6. 5小時(shí)；繼續(xù)升溫，以O(shè). 6°C /min均勻升溫至43°C， 維持43°C干燥3. 5小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
實(shí)施例13
取實(shí)施例7制成的丹酚酸A35g，加注射用水2500ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鉀調(diào)pH值4. 5，加入葡萄糖30g使溶解，再加入亞硫酸氫鈉3g，攪拌使溶解，混勻，加入活性炭1. 5g攪拌吸附，濾過(guò)，除去活性炭；加注射用水至3000ml，檢測(cè)中間體含量，pH值，檢測(cè)合格 后用O. 22 μ m微孔濾膜濾過(guò)，濾液灌裝于無(wú)菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機(jī)，關(guān)閉箱門，開(kāi)啟凍干機(jī)，以27V /h速度降溫至_43°C，保溫冷凍11小時(shí)；抽真空至O. 3mbar以下，在12. 5小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A制劑溫度上升到_24°C，維持_24°C真空干燥7. 5小時(shí)；繼續(xù)升溫，以O(shè). 7°C /min均勻升溫至 40°C，維持40°C干燥5小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
實(shí)施例14
取實(shí)施例8制成的丹酚酸A40g，加注射用水2700ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調(diào)pH值4. 3，加入葡萄糖20g、乳糖20g使溶解，再加入焦亞硫酸鈉4g，攪拌使溶解，混勻， 加入活性炭1. 5g攪拌吸附，濾過(guò)，除去活性炭；加注射用水至3000ml，檢測(cè)中間體含量，pH 值，檢測(cè)合格后用O. 22 μ m微孔濾膜濾過(guò)，濾液灌裝于無(wú)菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機(jī)，關(guān)閉箱門，開(kāi)啟凍干機(jī)，以28°C /h速度降溫至_41°C，保溫冷凍13小時(shí)；抽真空至O. 3mbar以下，在13. 5小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A 制劑溫度上升到-25. 5°C，維持-25. 5°C真空干燥6. 5小時(shí)；繼續(xù)升溫，以O(shè). 9V /min均勻升溫至44°C，維持44°C干燥3. 5小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
實(shí)施例15
取實(shí)施例1制成的丹酚酸A60g，加注射用水2700ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調(diào)pH值4. O,加入甘露醇40g使溶解，再加入維生素C2g，攪拌使溶解，混勻，加入活性炭2g攪拌吸附，濾過(guò)，除去活性炭；加注射用水至3000ml，檢測(cè)中間體含量，pH值，檢測(cè)合格后用O. 22 μ m微孔濾膜濾過(guò)，濾液灌裝于無(wú)菌的西林瓶中，部分塞上丁基橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機(jī)，關(guān)閉箱門，開(kāi)啟凍干機(jī)，以24. 5°C /h速度降溫至-42. 5°C，保溫冷凍11. 5小時(shí)；抽真空至O. 3mbar以下，在13. 5小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A 制劑溫度上升到-24. 50C，維持-24. 5°C真空干燥6. 5小時(shí)；繼續(xù)升溫，以O(shè). 55°C /min均勻升溫至42. 5°C，維持42. 5°C干燥2. 5小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
實(shí)施例16
取實(shí)施例2制成的丹酚酸A70g，加注射用水2800ml攪拌使溶解，用10%氫氧化鈉調(diào)pH值5. O,加入甘露醇40g使溶解，再加入維生素C2g，攪拌使溶解，混勻，加入活性炭2g攪拌吸附，濾過(guò)，除去活性炭；加注射用水至3000ml，檢測(cè)中間體含量，pH值，檢測(cè)合格后用O. 22 μ m微孔濾膜濾過(guò)，濾液灌裝于無(wú)菌的西林瓶中，部分塞上丁墓橡膠塞，共制成1000瓶，裝盤，灌裝完成后，送入凍干機(jī)，關(guān)閉箱門，開(kāi)啟凍干機(jī)，以28. 5°C /h速度降溫至-44. 5°C，保溫冷凍11. 5小時(shí)；抽真空至O. 3mbar以下，在13. 5小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A 制劑溫度上升到-24. 50C，維持-24. 5°C真空干燥6. 5小時(shí)；繼續(xù)升溫，以O(shè). 75°C /min均勻升溫至43. 5°C，維持43. 5°C干燥3小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
實(shí)驗(yàn)例1:丹酚酸A、丹酚酸B分析方法研究
1.儀器與試藥
儀器Waters e2695高效液相色譜儀，Empower2色譜工作站,2998 二極管陣列檢測(cè)器；Sartorius cp225D十萬(wàn)分之一電子天平。
色譜柱YMCC18 色譜柱(250 X 4. 6mm，5 μ m);
試劑甲醇為色譜純，水為Millipore制備的超純水，其他試劑均為分析純。
丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)111562-201009)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用；丹酚酸A對(duì)照品為自制，經(jīng)純度標(biāo)化含量為99. 52%。
2.對(duì)照品溶液及供試品溶液的制備
2.1對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取丹酚酸B、丹酚酸A對(duì)照品約10mg，置IOOml 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；再分別精密吸取上述各 lml，置同一 IOml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。
2. 3供試品溶液的制備精密稱取實(shí)施例1樣品(約相當(dāng)于丹酚酸AlOmg)以及下述“實(shí)驗(yàn)例2中1. 3 丹酚酸B原料制備”獲得樣品(約相當(dāng)于丹酚酸BlOmg)，置IOOml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
3.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流速1. Oml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)取混合對(duì)照品溶液，進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果在286nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為286nm ;柱溫30°C ； 理論板數(shù)按丹酚酸A峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。
0-10分鐘時(shí)，甲醇的比例由30%升至40%,O. 1-0. 5%磷酸水溶液的比例由70% 降至60% ;10-30分鐘時(shí)，甲醇的比例由40%升至55%，0. 1_0. 5%磷酸水溶液的比例由50%降至45% ；30-60分鐘時(shí)，甲醇的比例由55%升至80%,O. 1-0. 5%磷酸水溶液的比例由45%降至20%。
在上述條件下，丹酚酸A、丹酚酸B對(duì)照品和丹參提取液、丹酚酸催化轉(zhuǎn)化液的色譜峰保留時(shí)間見(jiàn)表1，HPLC圖譜見(jiàn)圖1、圖2、圖3、圖4。
表1.各對(duì)照品的色譜峰保留時(shí)間結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種丹酚酸A凍干粉針用于制備預(yù)防和治療缺血性心臟病藥物的用途，所述丹酚酸A凍干粉針其重量配比為丹酚酸AlOg 80g，填充劑IOg 80g，抗氧劑為制成總量的0.01% 0.2% ;所述丹酚酸A凍干粉針的制備方法為(1)提取丹參用水或乙醇溶液提取得到水提取液或醇提取液；(2)轉(zhuǎn)化將步驟⑴得到的提取液，調(diào)pH至3.5 6.5，加摩爾百分比為0.1% 3.O %的催化劑，在100 140°C加熱I 6小時(shí);(3)純化a.每步驟(2)得到的溶液，調(diào)pH至2.5 4. 5，離心，上清液經(jīng)非極性或弱極性大孔樹(shù)脂柱層析分離，用水洗脫后，用洗脫劑洗脫，高效液相檢測(cè)丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脫液；b.將步驟a得到洗脫液用葡聚糖凝膠LH-20或0DS-C18或聚酰胺層析柱分離，用洗脫劑洗脫，高效液相檢測(cè)丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脫液；c.將步驟b得到的洗脫液調(diào)pH至2.O 4. 0，經(jīng)有機(jī)溶劑萃取，分離有機(jī)溶劑相；d.將步驟c得到的溶液用硅膠層析柱分離，用洗脫劑洗脫，高效液相檢測(cè)丹酚酸A，收集含有丹酚酸A的洗脫液；(4)干燥將步驟d得到的洗脫液，減壓回收洗脫劑，再加水溶解，真空干燥、噴霧干燥或微波真空干燥，得所述丹酚酸A ;(5)取所述丹酚酸AlOg 80g加注射用水1500 2800ml攪拌使溶解，用堿調(diào)pH值4.O 5. 0，加入所述填充劑使其溶解，再加入所述抗氧劑，攪拌使溶解混勻，再加入活性炭O.5 2g攪拌吸附，濾過(guò)除去活性炭，加注射用水后灌裝成瓶，送入凍干機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥；(6)所述冷凍干燥包括如下步驟A、冷凍以20°C 30°C/h速度降溫至-40°C -45°C，保溫冷凍10 16小時(shí)；B、升華抽真空至O.3mbar以下，在10 14小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A制劑溫度上升到-23°C _27°C，維持-23°C -27°C真空干燥6 8小時(shí)；C、干燥繼續(xù)升溫，以O(shè).5°C 1. (TC /min均勻升溫至40°C 45°C，維持40°C 45°C 干燥2 5小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述填充劑選自甘露醇、葡萄糖、乳糖中的任意一種或幾種，用量為20mg 40mg/2ml 3ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述抗氧劑選自維生素C、硫脲、亞硫酸氫鈉、 焦亞硫酸鈉中的任意一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其重量配比為丹酚酸A20g，填充劑甘露醇20g，抗氧劑維生素CO. 8g ;其制備方法為取所述丹酚酸A20g，加注射用水1900ml攪拌使溶解，用氫氧化鈉鈉調(diào)pH值4. O 5. 0， 加入甘露醇20g使溶解，再加入O. 8g維生素C，攪拌使溶解混勻，加入活性炭O. 5g攪拌吸附，濾過(guò)除去活性炭；加注射用水至2000ml，灌裝成1000瓶，冷凍干燥；所述冷干燥包括如下步驟A、冷凍以25°C/h速度降溫至_45°C，保溫冷凍15小時(shí)；B、升華抽真空至O.3mbar以下，在12小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A制劑溫度上升至_25°C，維持-25°C真空干燥8小時(shí)；C、干燥繼續(xù)升溫，以O(shè). 8°C /min均勻升溫至40°C，維持40°C干燥3小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中步驟(I)中所述的水提取方法為取丹參藥材，切成飲片或粉碎成直徑約2mm顆粒，每次加3 15倍量水提取，共提取I 3次，每次提取 I 4小時(shí)；提取液減壓濃縮至相對(duì)密度1. 10 1. 25 (600C )，加入乙醇使含醇量在30% 80%，離心，上清液減壓回收乙醇并濃縮至無(wú)醇味，所述水提取采用煎煮提取或45 95°C 水溫浸提取，同時(shí)以10 50轉(zhuǎn)/分速度攪拌，得丹參提取液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中步驟(I)中所述的醇提取方法為取丹參藥材，切成飲片或粉碎成直徑約2mm顆粒，每次加3 15倍量30% 60%乙醇回流提取，每次提取 I 4小時(shí)，共提取I 3次；減壓回收乙醇，得丹參提取液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中步驟(I)中的提取液中丹酚酸B濃度為lmg/ml 30mg/ml或加水稀釋至lmg/ml 30mg/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途,其中提取液中丹酹酸B濃度為5mg/ml 20mg/ml或加水稀釋至5mg/ml 20mg/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中步驟(2)中的催化劑是氯化鐵、三氯化釕、氯化鋁、 氯化鋅、氯化鈀中的一種或幾種，催化劑與丹酚酸B的摩爾百分比為O. 1% 3. 0%。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中催化劑與丹酚酸B的摩爾百分比為O.5% 2.0%。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中步驟a中所述大孔樹(shù)脂柱為HPD-80、HPD-100、 HPD-100B、HPD-200A、HPD-300、HPD-450、HPD-722、HPD-826、ADS-5、ADS-8、ADS-21、或 D101、 AB-8 ;所述洗脫劑為水及不同比例的水與乙醇，丹且先用水、10 40%乙醇洗脫，再用20 60%乙醇洗脫，高效液相檢測(cè)丹酚酸A，收集含有丹酚酸A部分，洗脫液濃縮至無(wú)醇味。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中步驟b中的所述洗脫劑為水及不同比例的水與乙醇，并且先用水、20 60%乙醇溶液洗脫除雜，再用40 90%乙醇溶液洗脫，高效液相檢測(cè)丹酚酸A，收集含有丹酚酸A部分，洗脫液濃縮至無(wú)醇味。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中步驟c中所述的有機(jī)溶劑為叔丁基甲基醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯或甲酸乙酯。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中步驟d中所述洗脫劑為石油醚、正戊烷、正庚烷、 乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、叔丁基甲基醚組成的兩相溶劑。
15.根根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中步驟⑷中所述微波真空干燥的溫度 20-100°C，回差溫度1_5°C，真空度-O. 07Mpa以上，微波功率1-100KW，干燥10-200分鐘。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中步驟⑷中所述真空干燥的溫度50°C 90°C， 真空度-O. 07Mpa以上，功率I 60KW，干燥2 20小時(shí)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中步驟⑷中所述噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)口溫度 150°C 350°C，出風(fēng)口溫度70°C 95°C，噴霧速度1 300ml/min。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中PH調(diào)節(jié)劑為磷酸、鹽酸、硫酸或醋酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述的用于預(yù)防和治療缺血性心臟病的病癥包括以下一種或幾種冠心病、心絞痛、缺血性心肌病、心肌梗死、心肌缺血性卒中、急性冠狀動(dòng)脈20的用途，其中所述丹酚酸A凍干粉針用于改善缺血性心臟心功能 20的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于增加缺血性心臟的冠 I或19的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于減少缺血性心臟 23的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于縮小心肌缺血范圍的 23的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于減輕心肌缺血程度的綜合癥、冠狀動(dòng)脈狹窄、心肌缺血再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或19的用途，其中所述丹酚酸A凍干粉針用于改善缺血心臟血流動(dòng)力學(xué)的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求脈血流量的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求心肌梗死范圍的用途。
24.根據(jù)權(quán)利要求用途。
25.根據(jù)權(quán)利要求用途。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于保護(hù)心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)心肌酶活性的用途。
27.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于抑制缺血心肌組織炎癥反應(yīng)的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求23的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于保護(hù)心肌線粒體損傷的用途。
29.根據(jù)權(quán)利要求1或19的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于改善心肌代謝的用途。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于改善心肌代謝的用途包括用于改善以下心肌代謝的一種或幾種心肌氧自由基代謝、脂肪酸代謝、能量代謝。
31.根據(jù)權(quán)利要求1或19的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于降低心肌耗氧量的用途。19的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于改善血液流變學(xué)
32. 的用途。
33.用途。根據(jù)權(quán)利要求1或根據(jù)權(quán)利要求1或19的用途，其中所述的丹酚酸A凍干粉針用于抑制血栓形成的
全文摘要
本發(fā)明涉及一種丹酚酸A凍干粉針用于制備預(yù)防和治療缺血性心臟病藥物的用途，所述丹酚酸A凍干粉針其重量配比為丹酚酸A10g～80g，填充劑10g～80g，抗氧劑為制成總量的0.01％～0.2％，其中制備方法的冷凍干燥包括如下步驟A、冷凍以20℃～30℃/h速度降溫至-40℃～-45℃，保溫冷凍10～16小時(shí)；B、升華抽真空至0.3mbar以下，在10～14小時(shí)內(nèi)將凍結(jié)的丹酚酸A制劑溫度上升到-23℃～-27℃，維持-23℃～-27℃真空干燥6～8小時(shí)；C、干燥繼續(xù)升溫，以0.5℃～1.0℃/min均勻升溫至40℃～45℃，維持40℃～45℃干燥2～5小時(shí)后，將樣品溫度降至室溫，加蓋，即得丹酚酸A凍干粉針。
文檔編號(hào)A61K9/19GK102988307SQ20121048715
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者蔣春紅, 李志勇, 程帆, 歐陽(yáng)婷, 張功俊, 王振, 羅恒真 申請(qǐng)人:陳飛虹