一種fsh融合蛋白及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種FSH融合蛋白及其制備方法和用途，本發(fā)明的FSH融合蛋白的β亞基直接或者間接通過鏈接元件融合在FC片段上，F(xiàn)SH的α亞基則通過α亞基和β亞基的親和力或者鏈接元件與FSH的β亞基結(jié)合在一起，本發(fā)明的FSH融合蛋白為異二聚體或同二聚體，本發(fā)明的FSH融合蛋白的制備方法包括FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體的質(zhì)粒構(gòu)建，F(xiàn)SH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白瞬時表達及純化，本發(fā)明提供提高對象生育力的方法和治療具有對FSH治療有反應(yīng)的疾病狀態(tài)的方法。
【專利說明】一種FSH融合蛋白及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人類生殖領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及促性腺激素及其制備方法及其在輔助生殖中的作用。
【背景技術(shù)】
[0002]促卵泡激素(Follicle Stimulating Hormone,簡稱FSH),是一種由腦垂體前葉嗜喊性細胞合成與分泌的高度糖基化蛋白，與腦垂體分泌的其他糖蛋白激素如促黃體激素(LH)、促甲狀腺激素(TSH)，還有胎盤分泌的促絨毛膜激素(HCG)共同組成糖蛋白家族。都由α亞基和β亞基所組成，α亞基相同，而β亞基具有激素各自的特異性，是激素生物活性和免疫活性的決定因素。FSH的α亞基由92~96個氨基酸組成，β亞基由109-115個氨基酸組成。兩亞基通過內(nèi)部二硫鍵維持自身正確的三級結(jié)構(gòu)，C端殘基的位置決定其折疊的三維空間結(jié)構(gòu)。糖基是以N-糖苷鍵的方式連接在α和β兩個亞基各自的區(qū)域。根據(jù)Qing R.Fan等人在nature上發(fā)表的FSH與其受體的三維結(jié)構(gòu),FSH主要通過β亞基的C端與其受體結(jié)合，同時β亞基的C端通過內(nèi)部二硫鍵的固定與α亞基緊密結(jié)合，其中真正與受體的結(jié)合位點是β亞基的C端第89-105位氨基酸，它像三明治一樣，夾在α亞基的L2環(huán)和C端中間。女性卵泡顆粒細胞上含有FSH的特異性受體，F(xiàn)SH與受體結(jié)合后產(chǎn)生兩種作用，一方面活化芳香化酶，另一方面誘導(dǎo)LH受體生成。內(nèi)膜細胞在LH作用下提供19-雄烯二酮或睪酮，這些底物通過基底膜進入顆粒細胞，活化的芳香化酶把它們轉(zhuǎn)變?yōu)?7-β雄二醇。雌激素協(xié)同F(xiàn)SH使顆粒細胞增生，內(nèi)膜細胞分化，卵泡液形成，卵泡腔擴大，從而促進卵泡生長和發(fā)育成熟。卵泡在生長過程中會釋放抑制素以阻斷卵泡刺激素的進一步合成，并呈劑量依賴關(guān)系。這一機制保證了排卵的選擇性。男性曲細胞精管內(nèi)的支持細胞是FSH的靶細胞，F(xiàn)SH與支持細胞上的特異性受體結(jié)合后將刺激曲細精管上皮和次級精母細胞的發(fā)育，在LH和雄激素的協(xié)同下促進精子發(fā)育成熟。因為FSH對女性的卵泡成熟和男性的精子發(fā)育有非常重要意義，因而可以單獨使`用FSH或聯(lián)合LH應(yīng)用治療不育不孕癥。
[0003]FSH可以從腦垂體或絕經(jīng)后婦女尿液中分離得到(ΕΡ322，438)，也可以重組生產(chǎn)(US5, 639，640、US5, 156，957、US4, 923，805、US4, 840，896、EP211, 894)。通常為了獲得治療效果需要長期治療，刺激女性卵泡發(fā)生需要連續(xù)8-10天，有時高達21天，而對于低促性腺激素的男性，誘導(dǎo)精子發(fā)生需要高達18個月。重組hFSH通常是每天肌肉注射或皮下注射給藥，這樣的給藥方案經(jīng)常伴有局部反應(yīng)和不適。根據(jù)Bishop等人的總結(jié)，半衰期似乎是FSH體內(nèi)活性的主要決定因素，因此開發(fā)長效rhFSH，減少給藥頻率具有實際臨床應(yīng)用價值。
[0004]近年來有多篇專利及文章報道開發(fā)長效FSH，基本思路是通過增加FSH的糖基化位點來達到提高半衰期的目的。一種是在FSH分子內(nèi)部增加糖基化修飾位點。W001/58493公開了可以在FSH的a亞基進行的77種突變和可以在FSH的b亞基進行的51種突變。只是該專利沒有公開通過定點突變而引入糖基化位點的任何FSHa或b亞基的生產(chǎn)或測定情況。US7，740,862公開了在FSH a_亞基的氨基酸殘基第3和4位之間插入GNFT或GNRT序列，在大鼠體內(nèi)半衰期約為17h，體外刺激重組表達FSH受體的CHO細胞產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的能力與天然FSH相當(dāng)。另外一種是在序列末端添加額外序列來增加糖基化修飾位點。目前開發(fā)比較成功的是2010年由德國默克公司上市的elonva，該類似物具有天然FSH的生物活性，但卻具有較長的循環(huán)半衰期，在人體內(nèi)的半衰期約69h。蛋白具體序列在專利US5, 338，835和US5, 585，345中公開，是一種改造的FSH b_亞基，其C-末端谷氨酸以hCG的羧基末端肽(CTP)基團延長。根據(jù)Pieter Verbost等人的實驗結(jié)果:該類似物在大鼠和狗體內(nèi)的半衰期分別為17.3，46.9h，比重組FSH提高了 1.5_2倍。Signe Perlman等人報道一種改造的FSH a-亞基，其N-末端添加“ANITVNITV”氨基酸序列。該類似物在大鼠體內(nèi)半衰期為22h，比重組FSH提高了 3-4倍。
[0005]IgG類免疫球蛋白為人體血液中最豐富的蛋白之一，半衰期達到21d，其穩(wěn)定性是由于IgG的Fe片段可與新生Fe受體(FcRn)結(jié)合，避免IgG進入溶酶體中被降解(5_7)。因此，IgG的Fe片段被用來與活性蛋白連接構(gòu)成融合蛋白，以提高活性蛋白的體內(nèi)半衰期，達到長效的目的。根據(jù)鉸鏈區(qū)的長短及Fe片段氨基酸序列的不同，人IgG分為4個亞型，其中IgG Fe Y 2具有較低的誘導(dǎo)細胞毒性作用，而IgG Fe Y I最強。IgG融合蛋白的構(gòu)建方式大多是將IgG的Fe (Hinge-CH2-CH3)片段或CH(CH1-Hinge-CH2_CH3)片段的N端與活性蛋白的C端相連，以避免構(gòu)建融合蛋白可能對活性蛋白生物活性造成的影響。此外，IgG的融合蛋白可以通過ProteinA親和層析得到高效便捷的純化。因此已有多篇專利報道將IgGFe片段與其他蛋白融合可顯著延長目的蛋白的半衰期，提高體內(nèi)生物活性(US5，155,027,5，428，130，5，480，981 和 5，808，029)
[0006]專利US0，186,662公布了通過構(gòu)建FSH-FC融合蛋白同二聚體、異二聚體，在大鼠體內(nèi)半衰期提高至60h?；钚詫嶒?大鼠單次給藥后，72小時后測定卵巢重量，結(jié)果顯示FSH-FC融合蛋白相比重組FSH卵巢重量增加，從14.3mg提高至26.9mg,陰性對照為
12.1mg0前面提到過，重組FSH半衰期很短，通常需要每天給藥，如果按照該實驗方案三天給藥一次，F(xiàn)SH基本已經(jīng)代謝完畢，沒有活性。所以構(gòu)建的FSH-FC融合蛋白在保證半衰期的前提下，活性還有待于提高。
[0007]臨床上需要一種產(chǎn)品，能夠提供FSH的部分或全部治療相關(guān)的效果，可以比現(xiàn)有的FSH產(chǎn)品更低頻率給藥，并且和現(xiàn)有治療達到的FSH活性相比，可以提供更穩(wěn)定的活性水平。
[0008]本發(fā)明旨在提供這類產(chǎn)品以及這類產(chǎn)品的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供了一種FSH的融合蛋白及其制備方法和用途，本發(fā)明的FSH融合蛋白，其特征在于，所述的FSH融合蛋白的β亞基直接或者間接通過鏈接元件融合在FC片段上，F(xiàn)SH的α亞基則通過α亞基和β亞基的親和力與FSH的β亞基結(jié)合在一起。
[0010]本發(fā)明的主要特征在于:本發(fā)明的FSH融合蛋白的的β亞基直接或者間接通過鏈接元件(linker)融合在FC片段上，F(xiàn)SH的α亞基則通過α亞基和β亞基的親和力與FSH的β亞基結(jié)合在一起(見附圖1)。通過這些FSH的融合蛋白，本發(fā)明實現(xiàn)了在盡量保留FSH的親和力的前提下，增強FSH的體內(nèi) 半衰期，在某種意義上說提供了一種通過減少有效劑量、有效地增強生育能力的方法。
[0011]本發(fā)明同US20050186662的FSH-FC融合蛋白的最大區(qū)別在于，US20050186662的融合蛋白通過間接或者直接的方法將α亞基固定在FC鏈上，而本發(fā)明的專利在于將α亞基游離出來，通過自身的親和力結(jié)合在β亞基上。本發(fā)明的原理是基于FSHa亞基的C端參與了 FSH的β和α亞基與FSH受體(FSHR)的相互作用，而US20050186662的FSH-FC融合蛋白將α亞基的C端直接連在了 FC的N端或者將之與β亞基串聯(lián)，使α亞基C端被FC或者β亞基遮蔽，最終造成了 FSH與FSH受體親和力的丟失。本發(fā)明將α亞基游離出來，使α亞基的C端暴露出來，克服了 US20050186662的缺點，使FSH能夠正常與FSH的受體結(jié)合，在增強FSH的體內(nèi)半衰期的同時，最大程度的保留FSH的體內(nèi)活性。
[0012]在一個方面，本發(fā)明的FSH融合蛋白包括三條肽鏈，為異二聚體(附圖1a)，其特征符合以下方程:
[0013]a FSH @ ^FSH-L-FC: FC
[0014]其中a FSH指的是FSH的α亞基；@代表了 FSHa亞基和β亞基兩條鏈之間的關(guān)系；β FSH指的是FSH的β亞基；L代表了連接FSHii亞基和FC之間的直接或者間接鏈接元件，代表了將FSHii亞基連接到了 FC上；FC指的是免疫球蛋白的FC片段；冒號(:)指的是融合蛋白β FSH-L-FC和FC兩條鏈之間的關(guān)系。
[0015]在一個方面，本發(fā)明的FSH融合蛋白包括兩條肽鏈，為同二聚體(附圖1b)，其特征符合以下方程:
[0016]( a FSH @ β FSH-L-FC) 2
[0017]其中a FSH指的是FSH的α亞基；@代表了 FSHa亞基和β亞基兩條鏈之間的關(guān)系；β FSH指的是FSH的β亞基；L代表了連接FSHii亞基和FC之間的直接或者間接鏈接元件，代表了將FSH β亞基連接到了 FC上；FC指的是免疫球蛋白的FC片段；括號內(nèi)下標(biāo)2代表著此蛋白為二價同二聚體。`
[0018]本發(fā)明還涉及一種載體，該載體含有編碼SEQ ID NO:3的序列的FSHa亞基的DNA。該載體可以是表達載體。
[0019]本發(fā)明還涉及一種載體，該載體含有編碼SEQ ID N0:6的序列的FSH0亞基的DNA。該載體可以是表達載體。
[0020]本發(fā)明還涉及一種載體，該載體含有編碼SEQ ID N0:8的序列的FC片段的DNA。該載體可以是表達載體。
[0021]本發(fā)明還涉及一種載體，該載體含有第一 DNA、第二 DNA及第三DNA，其中第一 DNA編碼含有編碼SEQ ID NO:3的序列的FSHa的DNA，第二 DNA編碼含有編碼SEQ ID NO:6的序列的FSHii的DNA，該載體可以是表達載體，第三DNA編碼含有編碼SEQ ID NO:8的序列的FC的DNA該載體可以是表達載體。
[0022]所述的FC包括人免疫球蛋白FC。
[0023]本發(fā)明涉及的FSH-FC融合蛋白可以用標(biāo)準(zhǔn)的實驗手段從宿主細胞中純化。例如，F(xiàn)SH-FC融合蛋白包含了 FC，蛋白則可以用蛋白A來純化。純化方法包括但不限于色譜技術(shù)如體積排阻、離子交換、親和色譜法及超濾法。本發(fā)明涉及的融合蛋白的分離純化方法也包括上述各種方法的適當(dāng)組合。
[0024]所述的FSH-FC融合蛋白包括FC，優(yōu)選人免疫球蛋白FC。在一般情況下，人免疫球蛋白FC區(qū)域的CH3區(qū)域多肽來源于野生型的人免疫球蛋白FC區(qū)域。野生型的人免疫球蛋白FC指發(fā)生在人群中的氨基酸序列，當(dāng)然FC序列在個體中會有一些細微的差異。本發(fā)明中人免疫球蛋白FC也包括對于野生型人免疫球蛋白FC序列的氨基酸個別的改變，比如，F(xiàn)C區(qū)域局部某些氨基酸的改變，如包括某些在糖基化位點突變的氨基酸，或者其他無義的突變；也包括根據(jù)“把手-孔洞”模型突變的個別氨基酸的改變。[0025]本發(fā)明的人免疫球蛋白FC指的是人免疫球蛋白鏈恒定區(qū)，特別是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的羧基端或其中的一部分。例如，免疫球蛋白FC區(qū)可包括重鏈CH1、CH2、CH3、CH4的兩個或更多結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的組合。根據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類，主要有5類免疫球蛋白:IgA，IgD, IgE, IgG和IgM，其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG-1, IgG-2，IgG-3，IgG-4，IgA-1和IgA-2。從特定的免疫球蛋白類別和亞類中選擇特定的免疫球蛋白FC區(qū)在本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的范圍之內(nèi)。
[0026]在【具體實施方式】中，本發(fā)明所用的人免疫球蛋白FC包括至少一個免疫球蛋白絞鏈區(qū)，一個CH2結(jié)構(gòu)域和一個CH3結(jié)構(gòu)域，具體為人IgGl FC0
[0027]本發(fā)明涉及的哺乳動物宿主細胞包括但不限于CH0，293，骨髓瘤細胞。宿主細胞也可以是酵母或者原核細胞如E.Coli。
[0028]本發(fā)明涉及的治療領(lǐng)域包括，通過FSH治療降低任意對治療有反應(yīng)的生殖障礙或疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性；預(yù)防與這些障礙或疾病狀態(tài)相關(guān)的一種或多種癥狀；減少FSH異常的疾病過程的治療時間；給患有這些異常的對象提供有益效果(例如:增強生育力)，治愈FSH異?；蛏痴系K。
[0029]本發(fā)明提供了一個在不丟失FSH的體內(nèi)活性的基礎(chǔ)上增強FSH的體內(nèi)半衰期的FSH-FC片段的融合的方法。具體方式是將FSH的β亞基融合于FC片段上，并利用FSHa亞基與β亞基的自身親和力的特性，單獨表達FSH α亞基。本發(fā)明將提供FSH的部分或全部治療相關(guān)的效果，可以比現(xiàn)有的FSH產(chǎn)品更低頻率給藥，并且和現(xiàn)有治療達到的FSH活性相比，可以提供更穩(wěn)定的活性水平。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0031]圖1為FSH-FC融合蛋白異二聚體及同二聚體示意圖。
[0032]圖2為FSH-FC同二聚體重組質(zhì)粒。
[0033]圖3為FSH-FC/FC異二聚體重組質(zhì)粒。
[0034]圖4為FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體經(jīng)一步純化后SDS-PAGE圖譜。
[0035]FSH-FC同二聚體SDS-PAGE圖譜1，非還原膠樣品不煮沸；2，非還原膠樣品煮沸；M, Marker ;3,還原膠。
[0036]FSH-FC/FC異二聚體SDS-PAGE圖譜1，非還原膠樣品不煮沸；2，非還原膠樣品煮沸；M, Marker ;3，還原膠。
[0037]圖5為FSH-FC/FC異二聚體平均C-T曲線。
[0038]圖6為FSH-FC/FC單克隆篩選還原SDS-PAGE圖譜。
【具體實施方式】
[0039]下面給出一種根據(jù)本發(fā)明制備的非限定性的實施例。[0040]實施例一 FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體的質(zhì)粒構(gòu)建
[0041]1.FSH-FC同二聚體的質(zhì)粒構(gòu)建
[0042]商業(yè)化哺乳動物細胞表達載體pcDNA4/myc-HisA的改造。商業(yè)化載體pcDNA4/myc-HisA(Invitrogen, V863-20)含有兩個PvuII酶切位點，分別在大約1411,3160bp的位置。對質(zhì)粒定點突變，將3106bp位置的堿基C突變?yōu)镚，去除在該位置的PvuII酶切位點，只保留在大約1411bp處的一個酶切位點，新的載體命名為pcDNA4m。
[0043]根據(jù)基因庫中搜索到的人FSH α亞基基因序列(Gene bank N0.NP_000726.1),人工合成方法獲得人的FSHa基因(SEQ ID NO:1)，合成好的FSH α基因經(jīng)Takara公司的HindIII與EcoRI雙酶切亞克隆到改造的載體pcDNA4m中，測序驗證構(gòu)建質(zhì)粒的準(zhǔn)確性，獲得重組質(zhì)粒DNA即:pcDNA4m-FSHa。
[0044]人的FSHa序列見SEQ ID NO:1，信號肽序列見(SEQ ID NO:2)，編碼該序列的核苷酸序列見SEQ ID NO:3o
[0045]根據(jù)基因庫中搜索到的人FSHP亞基基因序列(Gene bank N0.NP_000501.1),人IgGl的Fe片段(hing-CH2-CH3)基因序列，人工合成方法獲得人的FSHP-Fc融合蛋白基因(SEQ ID NO:4)，合成好的FSHP-Fe基因經(jīng)Takara公司的HindIII與EcoRI雙酶切亞克隆到改造的載體pcDNA4m，測序驗證構(gòu)建質(zhì)粒的準(zhǔn)確性，獲得重組質(zhì)粒DNA即:pcDNA4m-FSHP -Fe。
[0046]人的FSH^-Fc融合蛋白基因序列見SEQ ID NO:4，信號肽序列見SEQ ID N0:5，編碼該序列的核苷酸序列見SEQ ID N0:6。
[0047]取上述構(gòu)建成功的單基因 表達載體pcDNA4m_FSH α用Takara公司的Bgl II,PvuII雙酶切。酶切產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖電泳分離純化，并回收約1.6kb大小含有FSHa基因的DNA片段；pcDNA4m-FSHP -Fe經(jīng)BglII，NruI雙酶切回收約6kb大小含有FSHP -Fe基因的DNA片段。隨后將酶切處理過的DNA片段進行連接，整合FSH α和FSHi^-Fc外源基因表達原件于一個表達載體上，獲得重組質(zhì)粒pcDNA4m-FSH-Fc，即FSH-FC同二聚體重組質(zhì)粒(見附圖2)。
[0048]2.FSH-FC/FC異二聚體的質(zhì)粒構(gòu)建
[0049]以pcDNA4m-FSH β -Fe為模板，設(shè)計引物進行PCR擴增獲得FC基因，通過PCR弓丨物在基因N端添加IgGl信號肽(5’ METDTLILWRLLLWVPGSTLGSA3’)，在基因兩端分別添加酶切位點Hindlll，EcoRI, PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切亞克隆到改造的載體pcDNA4m中，獲得重組質(zhì)粒pcDNA4m-Fc。用Takara公司的Nru I，Pvu II對重組質(zhì)粒進行雙酶切，酶切產(chǎn)物通過0.8%的瓊脂糖電泳分離純化，回收約1.8kb大小含有Fe的DNA片段。通過平末端連接，將其連入經(jīng)Nru I單酶切，并經(jīng)過CIAP去磷酸化處理的pcDNA4m-FSH_Fc質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pcDNA4m-FSH mono,即FSH-FC/FC異二聚體重組質(zhì)粒。質(zhì)粒圖譜如附圖3所示，基因FSHa，F(xiàn)SHP-FC，F(xiàn)C以摩爾比1:1:1的方式構(gòu)建至同一個質(zhì)粒，最終表達的蛋白FSH-FC，F(xiàn)C以三種方式存在=FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體和FC同二聚體，理論上三者之間的摩爾比為1:2:1。
[0050]采用Qiagen的中抽試劑盒，按照說明書操作，獲得去除內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒pcDNA4m-FSH_Fc，pcDNA4m_FSH mono。
[0051]實施例二 FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白表達和純化[0052]1.FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白瞬時表達
[0053]轉(zhuǎn)染前兩天，準(zhǔn)備500ml經(jīng)懸浮馴化的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)細胞用于瞬時轉(zhuǎn)染，接種密度為0.8X106cells/ml。兩天后對待轉(zhuǎn)染細胞懸液進行計數(shù)細胞密度為3.5~4X 106cells/ml,取細胞懸液1000rpm離心5min,棄上清液。用100ml的新鮮的Freestyle293培養(yǎng)基重新懸浮細胞，再次1000rpm離心5min,棄上清液。用500ml Freestyle293培養(yǎng)基重新懸浮293細胞。分別用2.5ml Freestyle293培養(yǎng)基稀釋 250ug pcDNA4m-FSH-Fc, pcDNA4m-FSH mono 質(zhì)粒，5ml Freestyle293 培養(yǎng)基稀釋
1.5mlPEI (Polyethylenimine)，分別將 2.5ml 質(zhì)粒和 2.5ml 的 PEI 混勻，室溫 5 分鐘。將質(zhì)粒/PEI混合物分別加入250ml細胞懸液中，放置在37度，10% C02,90rpm中培養(yǎng)；同時補加50ug/L IGF-10四小時后分別補加250ml EX293培養(yǎng)基，2mM Glutamine和50ug/LIGF-1，135rpm培養(yǎng)。二十四小時后加3.8mM VPA，培養(yǎng)5~6天收集500mlSH_FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體上清液準(zhǔn)備純化。
[0054]2.FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白純化
[0055]首先,FcRn蛋白交聯(lián)至NHS-activated agrose resin (Thermo),細胞液經(jīng)離心，取上清0.22um過濾后上載到FcRn柱子上，然后用20mM PB,50mMNaCl, pH6.2漂洗后，最后用20mM PB，50mMNaCl，pH7.4洗脫目的蛋白。經(jīng)一步純化后，SDS-PAGE結(jié)果如下圖所示。Fe融合蛋白是通過Fe之間二硫鍵結(jié)合的，在非還原膠即不加入DTT強還原劑的情況下，F(xiàn)e的鏈接二硫鍵沒有被破壞，融合蛋白以二聚體的形式存在。而FSH的兩個亞基α、β是以非共價鍵的方式結(jié)合，在非還原膠樣品不經(jīng)過煮沸的情況下，非共價鍵沒有遭到破壞；在非還原膠煮沸的情況下，兩個亞基之間的二硫鍵斷裂。所以電泳分別采取還原、非還原樣品煮沸及不煮沸的方式進行檢測。經(jīng)一步純化后，F(xiàn)SH-FC同二聚體蛋白純度達90%以上；FSH-FC/FC異二聚體重組質(zhì)粒，蛋白表達后以混合物的形式存在:FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體和FC同二聚體，摩爾比大致為1: 2: `1，與理論推測相符合(見附圖4)。
[0056]實施例三FSH-FC同二聚體，F(xiàn)SH-FC/FC異二聚體大鼠體內(nèi)藥效動力學(xué)研究
[0057]評價FSH-FC同二聚體，F(xiàn)SH-FC/FC異二聚體蛋白體內(nèi)生物學(xué)活性的模型是大鼠卵巢重量增加法。使用FSH或具有FSH活性的分子，治療未成熟的21日齡雌性大鼠，觸發(fā)卵巢卵泡生長和卵細胞產(chǎn)生。這種生長通過測量治療末期卵巢重量很容易探測。該方法作為給臨床產(chǎn)品標(biāo)定FSH活性已經(jīng)使用了數(shù)十年，它能衡量FSH的相關(guān)生理學(xué)作用，與臨床產(chǎn)品的表現(xiàn)有明確的相關(guān)性。
[0058]取健康合格，出生21天左右的Sprague-Dawley雌鼠，按照中國藥典附錄121的實驗方案進行FSH-FC同二聚體，F(xiàn)SH-FC/FC異二聚體蛋白動物體內(nèi)研究。給藥劑量分高、中、低三組(依次為2.5、1.25,0.5U)，對照品Gonal-F(比活預(yù)估10，000U/mg)每日給藥一次，樣品FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白(比活預(yù)估1，000U/mg)只給藥一次，72小時后進行卵巢稱重，運用《中檢所藥典生物檢定統(tǒng)計BS2000程序3.3法》計算，結(jié)果顯示Gonal-F比活為11，000IU/mg，樣品FSH-FC/FC異二聚體蛋白比活為1，300IU/mg，樣品FSH-FC同二聚體蛋白比活100U/mg。結(jié)果表明:相對于Gonal-F連續(xù)三天每日給藥一次，F(xiàn)SH-FC/FC異二聚體蛋白在只給藥一次的情況下，仍然具有一定的FSH活性。根據(jù)Gonal-F的產(chǎn)品說明書，臨床推薦給藥劑量為75IU，即可以推算FSH-FC/FC異二聚體蛋白的臨床給藥劑量約為17微克，在合理給藥劑量范圍內(nèi)。[0059]實施例四FSH-FC/FC異二聚體大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究
[0060]將具有一定FSH活性的FSH-FC/FC異二聚體蛋白進行大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究。具體方案如下:采用16只出生21天左右的Sprague-Dawley雌鼠,接受靜脈注射FSH-FC/FC異二聚體蛋白，注射劑量10U。選擇未成熟雌性大鼠是基于使用該年齡、性別來進行FSH體內(nèi)活性測定。采用眼眶采血的方式，給藥0，1,2,4,12，24，48，72，96，144，192小時采血，每次采血體積IOOul，離心后取血清凍存與-80度待ELISA分析。使用FSH ELISA試劑盒進行檢測，每個血清樣品重復(fù)分析三次。結(jié)果如下圖所示:FSH-FC/FC異二聚體蛋白的半衰期為30-40小時(文獻報道標(biāo)準(zhǔn)品重組FSH為12h)(見附圖5)。
[0061]實施例五FSH-FC/FC異二聚體高表達穩(wěn)定細胞株的獲得
[0062]根據(jù)前期實驗結(jié)果，F(xiàn)SH-FC/FC異二聚體蛋白具有一定的FSH活性，同時在大鼠體內(nèi)的半衰期約30-40h，是對照品Gnoal-F的3倍多，具有很好的臨床應(yīng)用前景，因此試圖獲得FSH-FC/FC異二聚體穩(wěn)定細胞株，為后期工藝開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化做準(zhǔn)備。穩(wěn)定細胞株獲得的具體方案:將對數(shù)生長期的HEK293(ATCC，CRL-1573TM)細胞以IX 105cell/孔濃度接種于24孔板，用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)24h，第二天使細胞匯合度達到 75%~85%。使用 Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen，P/N52887)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA4m-FSH mono。轉(zhuǎn)染5h后換液，每孔加入400ul完全培養(yǎng)基，24小時后將細胞以I: 10比例傳代到含有IOml新鮮完全培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)皿中，24小時后更換篩選培養(yǎng)基(含200ug/ml zeocin的完全培養(yǎng)基)，每隔3_4天更換一次篩選培養(yǎng)基。4_6周以后挑取單克隆傳代到24孔板，約4-5天至匯合度達到80% -100%時進行單克隆篩選。單克隆篩選策略:第一輪檢測用Fe ELISA試劑盒檢測，共篩選了 309個克隆。根據(jù)ELISA結(jié)果，結(jié)合菌落大小情況，選取102個Fe表達水平相對較高的克隆，傳代培養(yǎng)至6孔板，使用FSH ELISA試劑盒(DRG，E1A-1288)檢測FSH表達量，篩選陽性克隆。選取FSH表達水平相對較高的克隆進行非還原SDS-PAGE電泳。`
[0063]前面已提到過，基因FSHa，F(xiàn)SHb-FC, FC以摩爾比1:1:1的方式構(gòu)建至質(zhì)粒pcDNA4m-FSH-Fc mono，最終表達的蛋白FSH-FC，F(xiàn)C以三種方式存在:FSH_FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體和FC同二聚體，一般情況下三者之間的摩爾比為1: 2: I。我們最終的目的產(chǎn)物是FSH-FC/FC，蛋白具有FSH活性且半篩期在大鼠體內(nèi)是FSH的3_4倍，另外，考慮到后續(xù)的蛋白純化工藝，F(xiàn)SH-FC/FC異二聚體和FC同二聚體蛋白的分離，比其與FSH-FC同二聚體的蛋白分離要容易的多。所以我們的蛋白電泳篩選標(biāo)準(zhǔn)是FSH-FC/FC異二聚體蛋白占主要部分，F(xiàn)SH-FC同二聚體含量較低。最終篩選到的部分非還原SDS-PAGE電泳圖譜如附圖6所示，根據(jù)電泳情況最終選取第2、3、6和9泳道的克隆進行后續(xù)細胞培養(yǎng)及純化工藝的開發(fā)。其中值得一提的是第6泳道的克隆，表達產(chǎn)物基本是以FSH-FC/FC異二聚體的形式存在，F(xiàn)SH-FC同二聚體蛋白含量很低，使后續(xù)的蛋白純化工藝開發(fā)變得簡單。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書的保護范圍為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種FSH融合蛋白，其特征在于，所述的FSH融合蛋白的β亞基直接或者間接通過鏈接元件融合在FC片段上，F(xiàn)SH的α亞基則通過α亞基和β亞基的親和力或者鏈接元件與FSH的β亞基結(jié)合在一起。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FSH融合蛋白，其特征在于所述的FSH融合蛋白包括三條肽鏈，為異二聚體，符合以下方程:aFSH@ β FSH-L-FC:FC，其中a FSH指的是FSH的α亞基；@代表了 FSHa亞基和β亞基兩條鏈之間的關(guān)系，PFSH指的是FSH的β亞基；L代表了連接FSHii亞基和FC之間的直接或者間接鏈接元件，代表了將FSHii亞基連接到了 FC上；FC指的是免疫球蛋白的FC片段；冒號指的是融合蛋白β FSH-L-FC和FC兩條鏈之間的關(guān)系O
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FSH融合蛋白，其特征在于所述的FSH融合蛋白包括兩條肽鏈，為同二聚體，符合以下方程:UFSH@ PFSH-L-FC) 2，其中a FSH指的是FSH的α亞基；@代表了 FSHa亞基和β亞基兩條鏈之間的關(guān)系，PFSH指的是FSH的β亞基；L代表了連接FSHii亞基和FC之間的直接或者間接鏈接元件，代表了將FSHii亞基連接到了 FC上；FC指的是免疫球蛋白的FC片段；括號內(nèi)下標(biāo)2代表著此蛋白為二價同二聚體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一所述的FSH融合蛋白，其所述的FSH為人FSH。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一所述的FSH融合蛋白，其所述的FC片段包含氨基酸序列，其與SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少具有80%的一致性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一所述的FSH融合蛋白，其特征在于所述的FC為人免疫球蛋白鏈恒定區(qū)。
7.制備權(quán)利要求1所述的FSH融合蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟:I)FSH-FC同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體的質(zhì)粒構(gòu)建；FSH-FC同二聚體的質(zhì)粒構(gòu)建步驟:對表達載體pcDNA4進行改造，消除其中的 一個PvuII酶切位點；人工合成方法獲得人的FSH α基因SEQID NOdJfFSHa基因克隆到表達載體pcDNA4m中，獲得重組質(zhì)粒即:pcDNA4m-FSHα，將人工合成方法獲得人的FSHi1-Fe融合蛋白基因SEQ IDN0:4，克隆到表達載體pcDNA4m中，獲得重組質(zhì)粒即:pcDNA4m_FSH β-Fe ;取 pcDNA4m_FSH a、pcDNA4m_FSH β-Fe,分別酶切，分離純化回收pcDNA4m-FSH α中含有FSH α基因的DNA片段；pcDNA4m_FSH β -Fe含有FSH β -Fe基因的DNA片段，隨后將FSH α和FSH β -Fe外源基因表達原件整合于一個表達載體上，獲得重組質(zhì)粒pcDNA4m-FSH-Fc，即FSH-FC同二聚體重組質(zhì)粒；以pcDNA4m_FSH β -Fe為模板，PCR擴增獲得FC基因，通過PCR引物在基因N端添加IgGl信號肽，在基因兩端分別添加酶切位點HindIII，EcoRI ；PCR產(chǎn)物亞克隆到質(zhì)粒pcDNA4m中，獲得重組質(zhì)粒pcDNA4m_FC，質(zhì)粒pcDNA4m-FC含有FC基因部分經(jīng)酶切克隆到已構(gòu)建好的pcDNA4m-FSH-Fc，獲得重組質(zhì)粒pcDNA4m-FSH-Fc mono,即 FSH-FC/FC異二聚體重組質(zhì)粒；2) FSH-FC 同二聚體、FSH-FC/FC異二聚體蛋白瞬時表達，純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FSH融合蛋白的應(yīng)用，是通過FSH治療降低任意對治療有反應(yīng)的生殖障礙或疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性；預(yù)防與這些障礙或疾病狀態(tài)相關(guān)的一種或多種癥狀；減少對FSH異常的疾病過程的治療時間；提高對象生育力的同時降低給藥頻率；給患有這些異常的對象提供有益幫助。
【文檔編號】A61P15/08GK103509121SQ201210476665
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月22日
【發(fā)明者】徐霆, 郭康平, 汪皛皛, 吳杰, 季劍蕓, 黃艷, 須濤 申請人:蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司