專利名稱：靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應(yīng)用，屬于微生物學(xué)，分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2009年，美國(guó)ASCO主席在介紹腫瘤進(jìn)展時(shí)提到，癌癥的第一死亡原因是癌癥本身和癌癥復(fù)發(fā)，第二位死因就是血栓。癌癥與血栓的關(guān)系非常密切，重視癌癥血栓的預(yù)防和治療已成為臨床醫(yī)生今后工作的重點(diǎn)之一。1865年,法國(guó)醫(yī)生Armand Trousseau首次報(bào)道了胃癌患者容易形成靜脈血栓， 不久，Billroth又于1878年發(fā)現(xiàn)了血栓中存在癌細(xì)胞，進(jìn)一步提出癌變可引起凝血功能紊舌L。臨床上把腫瘤相關(guān)性血栓稱為Trousseau綜合癥。大量的病理、實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)了這一現(xiàn)象，而且還發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的癌癥患者都存在局部或全部高凝狀態(tài)。癌癥患者的血栓性疾病包括深靜脈血栓(deep venous thlmmbosis, DVT)、肺栓塞(pulmonary embolism, PE)、彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascularcoagulation, DIC)、門靜脈血栓(portal vein thmrnbosis, PVT)和動(dòng)脈血栓栓塞(arterial thromboembolism, AT)、游走性淺表血栓性靜脈炎(migratorythrombophlebitis superficial)等，其中下肢 DVT 最為常見(jiàn)。癌癥患者血栓形成的發(fā)病機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，至今尚未完全明確。多種因素通過(guò)不同途徑共同導(dǎo)致了癌癥患者的血栓易患傾向，主要包括抗癌治療、腫瘤細(xì)胞的表達(dá)物及釋放物和致癌基因等因素?？拱┲委煂?dǎo)致血栓形成，主要是手術(shù)治療期間形成血栓，化療藥物和放射治療誘發(fā)血栓形成以及患者在接受中心靜脈穿刺置管治療期間，管周纖維蛋白鞘導(dǎo)致血栓形成。癌癥患者所患的血栓性疾病與腫瘤細(xì)胞表達(dá)和釋放的物質(zhì)關(guān)系密切。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)釋放促凝因子或炎性因子來(lái)直接或間接地激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，另一方面，炎性因子亦可刺激腫瘤細(xì)胞釋放更多的促凝因子而加劇血液的高凝狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞表達(dá)和釋放的三種主要促凝物質(zhì)為組織因子(TF)、癌促凝物質(zhì)(cancer procoagulant CP)和絲氨酸蛋白酶(hepsin)。新近的研究表明，某些致癌基因在促進(jìn)細(xì)胞惡變的同時(shí)也能夠引起凝血功能紊舌L。如Yu J等證實(shí)，導(dǎo)致癌癥產(chǎn)生的某些基因病變?nèi)鏡as基因活化或p53基因失活能夠造成組織因子(TF)的過(guò)度表達(dá)，誘發(fā)凝血病變。最近的研究還顯示，血栓形成參與了腫瘤的進(jìn)展、血管生成和轉(zhuǎn)移等機(jī)制。除了癌癥治療形成血栓可視為外界因素外，其余兩種因素所形成的血栓都是應(yīng)機(jī)體癌變出現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，血栓的形成有利于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制可能是纖維蛋白沉積于腫瘤細(xì)胞周圍為腫瘤生長(zhǎng)提供了 2個(gè)便利條件一方面為腫瘤細(xì)胞附著提供了基質(zhì)，利于其局部擴(kuò)散和蔓延；另一方面，纖維蛋白凝血塊和相關(guān)的凝血因子能夠上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)(VEGF)，從而為新生血管創(chuàng)造了條件。目前，治療腫瘤及血栓的藥物都為單一功能的藥物，同時(shí)具有抗腫瘤及溶栓功能的藥物還未見(jiàn)報(bào)道。因此，構(gòu)建出一種既抗腫瘤又溶栓的雙功能嵌合蛋白，對(duì)于治療癌癥并發(fā)血栓的病例具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)癌癥患者易形成血栓的問(wèn)題，本發(fā)明基于SEC2的抗腫瘤活性和SAK的抗血栓作用，構(gòu)建一種靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，使抗腫瘤和抗血栓兩種作用得以體現(xiàn)的同時(shí)，還具有較精確的靶向作用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案一種靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，由序列表SEQ ID NO. I所示的生長(zhǎng)抑素類似物奧曲肽Oct序列、序列表SEQ IDNO. 2所示的截短SAK氨基酸序列和序列表SEQ ID NO. 3所示的截短SEC2氨基酸序列構(gòu)成， 將三者連接在一起，得到氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示的嵌合蛋白/Isee之或氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示的嵌合蛋白0ct-ASEC2-ASAK。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)上述靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白Oct-Δ sak-Δ sec2的方法如下
1)構(gòu)建嵌合基因Oct-Asak-Δ sec2,其DNA序列如SEQ ID NO. 9所示；
2)將得到的嵌合基因化i-Z sak- Δ sec2,經(jīng)酶切后，插入到載體質(zhì)粒pET28a (+)的AcoRI/ Xhol位點(diǎn)，構(gòu)建出表達(dá)嵌合蛋白Oct-Λ sak-Δ sec2的質(zhì)粒pET28a_Oct-Δ sak-Δ sec2 ；
3)將質(zhì)粒pET28a-化卜』似左-』轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌；
4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到O.6時(shí)，在30°C條件下用I mM IPTG誘導(dǎo)4 5小時(shí)，之后離心收集菌體細(xì)胞；
5)用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率400W;處理時(shí)間5X11 sec, 5 sec間隔；處理后，6000 rpm離心10 min，去除不溶性細(xì)胞碎片，收集上清液；
6)將上清液過(guò)Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白Oct-Λ SAK-Λ SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)上述的抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白0ct-ASEC2_ASAK的方法如下
1)構(gòu)建嵌合基因Oct-Λsec2-A似左，其DNA序列如SEQ ID NO. 10所示；
2)將得到的嵌合基因Oct-Λsec2~A sak,經(jīng)酶切后，插入到載體質(zhì)粒pET28a (+)的feoRI/ Xhol位點(diǎn)，構(gòu)建出表達(dá)嵌合蛋白Oct-Λ SEC2-Λ SAK的質(zhì)粒pET28a-Oct-Δ sec2~A sak ；
3)將質(zhì)粒pET28a-0ct-』似左轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌；
4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到O.6時(shí)，在30°C條件下用I mM IPTG誘導(dǎo)4 5小時(shí)，之后離心收集菌體細(xì)胞；
5)用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率400W ;處理時(shí)間5X11 sec, 5 sec間隔；處理后，6000 rpm離心10 min，去除不溶性細(xì)胞碎片，收集上清液；
6)將上清液過(guò)Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白Oct-ASEC2-ASAK，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。本發(fā)明，根據(jù)實(shí)際需要選擇嵌合蛋白Oct-Λ SAK-Λ SEC2或嵌合蛋白Oct- Δ SEC2- Δ SAK,當(dāng)藥物制劑以抗腫瘤為主時(shí)以嵌合蛋白Oct- Δ SEC2- Δ SAK為佳，當(dāng)藥物制劑以溶栓為主時(shí)以嵌合蛋白Oct- Δ SAK- Δ SEC2為佳。本發(fā)明的嵌合蛋白在制備抗腫瘤溶栓藥物中的應(yīng)用。以本發(fā)明的嵌合蛋白Oct- Δ SAK- Δ SEC2或嵌合蛋白Oct- Δ SEC2- Δ SAK為有效成分，添加藥學(xué)上常規(guī)的輔料，可制備具有抗腫瘤溶栓雙效的各種藥物制劑。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所構(gòu)建的抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白能夠在生物體內(nèi)通過(guò)奧曲肽靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，高效的發(fā)揮SEC2的抗腫瘤功能，又可以發(fā)揮SAK 的溶栓活性，是理想的溶栓抗癌雙效生物制劑。本發(fā)明采用重疊延伸剪接技術(shù)，構(gòu)建嵌合基因，通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)和Ni親和層析純化法，成功獲得了高蛋白純度的嵌合蛋白，并經(jīng)體外溶栓實(shí)驗(yàn)和體外抑瘤實(shí)驗(yàn)證明了，本發(fā)明的嵌合蛋白分別與SAK和SEC2具有相同的活性，成功實(shí)現(xiàn)了溶栓抗癌雙效生物制劑的構(gòu)建。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白Oct- Δ SAK- Δ SEC2的制備 (一)帶有嵌合基因Oct-Δ sak- Δsec2的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
通過(guò)重疊延伸剪接技術(shù)構(gòu)建嵌合基因，連接到表達(dá)載體pET28a(+)上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)。I、嵌合基因 Oct-Δ sak-AsecJ 的構(gòu)建
經(jīng)PCR方法分別克隆得到編碼截短SAK的基因Λ sak (其DNA序列如SEQ ID NO. 6所示)、編碼截短SEC2的基因Ksec2 (其DNA序列如SEQ ID NO. 7所示)，經(jīng)重疊延伸剪接技術(shù)(SOE-PCR)擴(kuò)增得到嵌合基因Asak-Awd，再通過(guò)引物設(shè)計(jì)，將編碼奧曲肽Oct的基因(其DNA序列如SEQ ID NO. 8所示)連接到嵌合基因Λ sak-前面，使其成為Oct-Λ sak-(其DNA序列如SEQ ID NO. 9所示)。同時(shí)，為了實(shí)現(xiàn)嵌合基因Oct- Δ sak- ΛmcJ 連接到表達(dá)質(zhì)粒pET_28a (+)上并能成功表達(dá)，通過(guò)PCR方法在嵌合基因Oct-Λ sak-A1SecJ的5’端加上酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，在嵌合基因Oct-Λ sak-A1Sed的3’端加上終止密碼子，XhoI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。2、構(gòu)建重組質(zhì)粒
將帶有酶切位點(diǎn)的嵌合基因Oct-Λ sak-AmcJ 經(jīng)限制性內(nèi)切酶及和ZAoI雙酶切后，插入到表達(dá)載體pET28(+)的及^PI/ Xhol位點(diǎn)，T4連接酶16°C連接過(guò)夜，得到連接反應(yīng)液。3、大腸桿菌的化學(xué)轉(zhuǎn)化
將連接反應(yīng)液加入到預(yù)先通過(guò)氯化鈣法制備的大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)化學(xué)方法轉(zhuǎn)化(42°C水浴熱激)，之后，將菌液涂布于LB平板上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，以篩選陽(yáng)性克隆。4、陽(yáng)性克隆的篩選在含有Kan抗性的LB平板培養(yǎng)基上，挑取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒經(jīng)及和ZAoI雙酶切驗(yàn)證，確定嵌合基因Oct-Λ sak-AmcJ 是否被插入到表達(dá)質(zhì)粒中。再由上海生工公司(Sangon, China)對(duì)得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。試驗(yàn)結(jié)果
經(jīng)雙酶切驗(yàn)證和測(cè)序分析綜合表明，表達(dá)Oct-Δ sak-Δ sec2的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。獲得帶有重組質(zhì)粒pET28a- /I SaA-Zl SecJ的重組大腸桿菌。(二)Oct-Λ sak-Δ sec2的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 I^Oct-Δ sak-Δ sec2 的誘導(dǎo)表達(dá)
將帶有重組質(zhì)粒pET28a- oct-Δ sak-Δ sec2的重組大腸桿菌接種于含有Kan(卡那霉素，Kanamycine, Kan) (40 Kg/ml)的10 ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 16小時(shí)，次日按2%的·接種量，將培養(yǎng)好的菌液接種到含有Kan (40 Pg/ml)的200 ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到0.6時(shí)，用I mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。為了避免在表達(dá)過(guò)程中出現(xiàn)包涵體，本發(fā)明·選擇在菌體生長(zhǎng)不是很活躍的30°C作為誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)4 一 5 h。2> Oct-Δ sak-Δ sec2 的純化
經(jīng)過(guò)4個(gè)小時(shí)的誘導(dǎo)表達(dá)后，通過(guò)8000 rpm離心5分鐘收集菌體細(xì)胞。零下20°C過(guò)夜凍存菌體，次日取出，室溫放置15分鐘。用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率400 W ;處理時(shí)間5Xllsec，5 sec間隔。處理后，6000 rpm離心10 min，去除不溶性細(xì)胞碎片，收集上清液。將上清液低速上樣于Ni-NTA親和層析柱，平衡緩沖液(30 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl pH7. 6)平衡至基線，洗脫緩沖液(30 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 50-300 mM 咪唑PH7. 6)梯度洗脫，收集洗脫峰，濃縮除鹽，SDS-PAGE分析純度。得到帶有組氨酸標(biāo)簽的重組Oct-Δ sak-Δ sed本發(fā)明中，載體質(zhì)粒pET28a(+)編碼了三個(gè)用于純化的標(biāo)簽，C端6XHistag，t7tag和N端6XHistag,本發(fā)明選擇了 N端6XHistag。利用Ni離子特異性螯合His的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)含有6 X Hi stag的Oct-Λ sak-Δ 與雜蛋白的分離，再通過(guò)咪唑競(jìng)爭(zhēng)6 XHistag與Ni離子的結(jié)合實(shí)現(xiàn)Oct- Δ SAK- Δ SEC2的洗脫。試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證，成功表達(dá)并純化出嵌合蛋白Oct- Δ SAK- Δ SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。(三)體外溶栓活性分析 具體實(shí)施如下
稱取125 mg瓊脂糖(電泳級(jí))，加入23 ml生理鹽水，煮沸溶解，60°C水浴平衡，加凝血酶 14 μ I (100 IU/ml)，人纖溶酶原 280 μ I (O. 5 mg/ml)，人纖維蛋白原 2. 2 ml (6 mg/ml)，倒入80 mm平板內(nèi)冷卻，制成人纖維蛋白平板，用前于4°C放置半個(gè)小時(shí)。打孔上樣，每個(gè)孔的直徑為2 mm,上樣量為10 μ I, SAK和Oct- Δ SAK- Δ SEC2的濃度為50μ g/ml，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，于37°C恒溫濕盒內(nèi)放置24 h后，測(cè)溶栓直徑并進(jìn)行活性比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
SAK的溶栓直徑平均為24. 68 mm, Oct- Δ SAK- Δ SEC2的溶栓直徑平均為24. 81 mm，二者的溶栓活性基本相同。
(四)體外淋巴細(xì)胞(PBMC)增殖活性分析 具體實(shí)施如下
取正常人新鮮外周血5 ml，抗凝后(肝素，終濃度O. 2 mg/ml)，與等量的D-Hanks液混勻，小心地加在等量的淋巴細(xì)胞分離液上面，3000 rpm離心15 min，取出中間的云霧層(PBMC),再加入等量D-Hanks液混勻,3000 rpm離心10 min,棄上清,然后用3_5 ml D-Hanks液重懸PBMC，3000 rpm離心10 min，重復(fù)一次，加入適量的含有10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)。將PBMC以I X IO5個(gè)/孔的量加入到96孔板中，于CO2含量為5%，37°C的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，次日用含有10%血清的DNEM培養(yǎng)基將待測(cè)樣品稀釋至20 ng/ml和200 ng/ml兩個(gè)濃度，加入到96孔板中，以BSA陰性作為對(duì)照，PHA-P作為陽(yáng)性對(duì)照，每樣3個(gè)復(fù)孔；5% CO2, 37°C培養(yǎng)72 h ;取出96孔板，按50 μ I/孔加入MTT，5% CO2, 37°C培養(yǎng)4h ；3000 rpm 離心 10 min，加入 DMSO 120 μ I/孔，37°C溶解 20 min ;酶標(biāo)儀上 570 nm 測(cè)定各孔的吸光值。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從鼠脾淋巴細(xì)胞的增值情況可以看出，無(wú)論是較低濃度的20 ng還是較高濃度的200ng，Oct- Δ SAK- Δ SEC2和腸毒素SEC2的增值率是相同的。結(jié)果見(jiàn)表I表I鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
SSC2 SAZ-im.yr-SE SEC2 SAK-ls hir-S￡ PHA-P BSA C (2Ckg) (200fg} C2 ftWng) i雜,f {WffM
増殖車 50Al 37% 52 63% 52.6熱 112.2S% 5 30%
(五)體外抑瘤活性分析 具體實(shí)施如下
取正常人新鮮外周血5 ml，抗凝后(肝素，終濃度O. 2 mg/ml)，與等量的D-Hanks液混勻，小心地加在等量的淋巴細(xì)胞分離液上面，3000 rpm離心15 min，取出中間的云霧層(PBMC),加入等量D-Hanks液混勻，3000 rpm離心10 min,棄上清,用3-5 mlD-Hanks液重懸PBMC，3000 rpm離心10 min，重復(fù)一次，加入適量的含有10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)。將PBMC以2X IO5個(gè)/孔的量加入到96孔板中；倒掉Hella細(xì)胞培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，力口入2-3 ml D-Hanks液洗去殘留的培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一次，加入1-2 ml胰酶，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，將胰酶倒掉，加入少量含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，計(jì)數(shù)。將Hella細(xì)胞以I X IO4個(gè)/孔的量加入到96孔板中，用含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基將待測(cè)樣品稀釋至20 ng/ml和200 ng/ml兩個(gè)濃度，加入到96孔板中，僅加Hella細(xì)胞作為腫瘤細(xì)胞對(duì)照孔，僅加與實(shí)驗(yàn)孔等量的PBMC和待測(cè)樣品作為本底釋放孔，每樣3個(gè)復(fù)孔，5% C02，37°C培養(yǎng) 36 h ;取出 96 孔板，加入 50 yl/^LMTT，5% C02，37°C培養(yǎng) 4 h ；3000rpm離心10 min，W；VDMS0 120 μ I/孔，37°C溶解20 min，酶標(biāo)儀上570 nm測(cè)定各孔的吸光值。并按照下面的公式計(jì)算抑瘤率
權(quán)利要求
1.一種靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，其特征在于由序列表SEQ ID NO. I所示的生長(zhǎng)抑素類似物奧曲肽Oct序列、序列表SEQ ID NO. 2所示的截短的SAK氨基酸序列和序列表SEQ ID NO. 3所示的截短的SEC2氨基酸序列構(gòu)成，三者連接在一起，得到氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示的嵌合蛋白Oct- Δ SAK- Δ SEC2或氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示的嵌合蛋白0ct-ASEC2_ASAK。
2.一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)權(quán)利要求I所述的靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白的方法，其特征在于步驟如下 1)構(gòu)建嵌合基因Oct-ΛsaA-Δ ，其DNA序列如SEQ ID NO. 9所示； 2)將得到的嵌合基因Oct-Λsak-Δ sec2,經(jīng)酶切后，插入到載體質(zhì)粒pET28a (+)的AcoRI/ Xhol位點(diǎn)，構(gòu)建出表達(dá)嵌合蛋白Oct-Λ sak-Δ sec2的質(zhì)粒pET28a_Oct-Δ sak-Δ sec2 ; 3)將質(zhì)粒pET28a-ifci-Zsak-Δ mcJ 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌； 4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到O.6時(shí)，在30°C條件下用I mM IPTG誘導(dǎo)4 5小時(shí)，之后離心收集菌體細(xì)胞； 5)用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率400W;處理時(shí)間4X11 sec, 5 sec間隔；處理后，6000 rpm離心10 min，去除不溶性細(xì)胞碎片，收集上清液； 6)將上清液過(guò)Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白Oct-Λ SAK-Λ SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
3.一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)權(quán)利要求I所述的抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白的方法，其特征在于步驟如下 1)構(gòu)建嵌合基因Oct-Λsec2-A似左，其DNA序列如SEQ ID NO. 10所示； 2)將得到的嵌合基因Oct-Λsec2~A sak,經(jīng)酶切后，插入到載體質(zhì)粒pET28a(+)的&oRI/ Xhol位點(diǎn)，構(gòu)建出表達(dá)嵌合蛋白Oct-Λ SEC2-Λ SAK的質(zhì)粒pET28a_6fci-/l sec2~A sak ; 3)將質(zhì)粒pET28a-ifci-Zsec2~A轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌； 4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到O.6時(shí)，在30°C條件下用I mM IPTG誘導(dǎo)4 5小時(shí)，之后離心收集菌體細(xì)胞； 5)用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率400W;處理時(shí)間5X11 sec, 5 sec間隔；處理后，6000 rpm離心10 min，去除不溶性細(xì)胞碎片，收集上清液； 6)將上清液過(guò)Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白Oct- Δ SEC2- Δ SAK,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
4.權(quán)利要求I所述的嵌合蛋白在制備抗腫瘤溶栓藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及靶向腫瘤細(xì)胞抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或如SEQ ID NO.5所示。嵌合蛋白的制備方法如下構(gòu)建嵌合基因；將嵌合基因經(jīng)酶切后，插入到載體質(zhì)粒pET28a(+)的EcoRI/XhoI位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌；將重組大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)，超聲波破碎，將收集的上清液過(guò)Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白。本發(fā)明的嵌合蛋白，可使靶向腫瘤，抗腫瘤并抗血栓兩種作用得以同時(shí)體現(xiàn)。
文檔編號(hào)A61K38/16GK102924606SQ20121046587
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者胡風(fēng)慶, 林家?guī)?申請(qǐng)人:遼寧大學(xué)