專利名稱：促進骨缺損修復(fù)的可降解三維纖維支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種促進骨缺損修復(fù)的可降解三維纖維支架的制備方法，屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
骨是一種令人訝異而又真實的納米復(fù)合體，是一種復(fù)雜的高度分化的結(jié)締組織。 它不僅為機體提供機械支撐，也是機體各種礦物質(zhì)的源泉，尤其是鈣和磷。骨是一種動態(tài)組織的代表，擁有獨特的自我再生和重塑能力，在人的一生中骨可以生長到一定的長度而沒有任何傷疤產(chǎn)生。雖然骨有再生和重塑能力，但是其再生能力僅在缺損部位很小時發(fā)揮作用，大尺寸的骨重建仍然是臨床面臨的一個難題。當(dāng)缺損非常大，骨不能自愈，那么就需要骨移植物來幫助修復(fù)骨功能。臨床上治療骨缺損的方法主要是骨移植，包括自體骨移植、 同源異體骨移植、異種骨移植，但是這些方法均存在一定的局限性，不能達到滿意的治療效果O
自體骨移植被視為治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)，原則上包括骨再生所需的所有關(guān)鍵因素一種骨引導(dǎo)性的支架，骨誘導(dǎo)性和血管化的生長因子，成骨潛能的細(xì)胞。然而，骨移植物移植在臨床中的應(yīng)用體現(xiàn)出一些極大的不便。首先自體骨移植需要從患者非負(fù)荷區(qū)域(尤其是容易獲取部位如髂骨嵴)收集供體骨，移植到缺損部位，成功率雖有提高，但是自體骨移植獲取的移植物遠(yuǎn)不能滿足骨移植的需求。此外，患者自身所能提供給受損部位的替代物經(jīng)常不能達到滿意的效果，會導(dǎo)致隨后的骨移植物發(fā)生骨折，10年內(nèi)的骨折率高達60%， 這與一系列的生物學(xué)過程有關(guān)，例如破骨細(xì)胞引起的骨吸收、微骨折的增加、皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨中骨密度的下降。加之獲取自體骨會導(dǎo)致嚴(yán)重的供體部位病變，病變程度取決于取材部位以及手術(shù)技術(shù)。
同源異體骨和異種骨移植雖然避免了供體部位病變，但是也存在一系列的安全隱患。目前的同源異體骨和異種骨移植物主要來源于骨庫中的人類尸體或動物提供的骨移植物，容易引發(fā)病毒或細(xì)菌感染、移植后受體部位的免疫反應(yīng)等。
一些無機的生物活性材料也被臨床上用來填充骨缺損部位，以期達到骨再生的效果。例如磷酸鈣陶瓷以及生物活性玻璃等。此類骨替代物來源廣泛，避免了供體不足及病變，也不存在免疫反應(yīng)，且這些材料本身有很好的骨傳導(dǎo)性，常用于小缺損填充以及整形外科手術(shù)。但是這種材料由于自身的缺點，如物理機械性能不理想、脆性大、不易被吸收，骨誘導(dǎo)作用弱等，在大尺寸骨缺損治療上應(yīng)用比較少，存在一定的局限性。
靜電紡絲技術(shù)得到的超細(xì)纖維比表面積大，孔隙率高，連通性好，形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然細(xì)胞外基質(zhì)類似，可以為細(xì)胞生長提供良好的環(huán)境。聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)作為一種可降解，無免疫源性，生物相容性良好的生物材料受到廣泛關(guān)注，PHBV電紡纖維更是被用做組織工程支架來研究細(xì)胞成骨、成軟骨特性。但是目前的研究中，PHBV電紡纖維直徑一般在微米級，降解速率不高，難以與成骨速率匹配，并且膜狀電紡纖維缺乏足夠的強度，因此電紡纖維應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的研究仍停留在體外細(xì)胞實驗階段。發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種促進骨缺損修復(fù)的可降解三維纖維支架的制備方法，是以PHBV為基質(zhì)，摻雜聚氧乙烯(PEO)和納米級羥基磷灰石(nHA)的可降解三維纖維支架材料的制備方法，并成功應(yīng)用于骨缺損修復(fù)中。此可降解三維纖維支架具有高孔隙率和連通性，與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)類似，有利于細(xì)胞的粘附和增殖。nHA均勻地分散在PHBV 納米纖維中，PEO的摻入促進了整個支架的降解速率，與成骨速率相匹配，該三維支架用于骨缺損修復(fù)效果顯著。
技術(shù)方案本發(fā)明的促進骨缺損修復(fù)的可降解三維纖維支架的制備方法，首先選取生物材料聚羥基丁酸戊酸共聚酯PHBV、水溶性可促進支架降解的聚氧乙烯PEO和具有骨傳導(dǎo)能力但需要載體的納米級羥基磷灰石nHA為原料，在三氟乙醇TFE溶劑中分別溶解PHBV、PEO和nHA，將PHBV、PEO溶液和nHA溶液充分混合得到PHBV-PE0_nHA靜電紡絲溶液，通過靜電紡絲方法制備PHBV/PEO-nHA復(fù)合納米纖維膜，然后通過裁剪和折疊得到多層棒狀三維支架，用做大尺寸骨缺損修復(fù)的植入材料；其中，PHBV、PEO、nHA的比例為 6:4:1 I. 5。
所述PHBV/PEO-nHA靜電紡絲溶液的質(zhì)量百分濃度為2%，最佳摻雜比為 PHBV:PE0=6:4, nHA添加量的質(zhì)量百分含量為PHBV-PEO混合物的10 15%。
nHA的摻入是通過超聲和攪拌的方法實現(xiàn)的，首先將PHBV和PEO與溶劑TFE用磁力攪拌器攪拌90 120分鐘至溶解，同時nHA加入三氟乙醇TFE中超聲90 120分鐘至完全分散，然后兩者混合，磁力攪拌30飛0分鐘，得到均勻的靜電紡絲溶液。
三維支架的獲得是通過將PHBV-PEO-nHA納米纖維薄膜裁剪成等腰梯形，其中等腰梯形的高度和下底寬度由骨缺損的尺寸決定，以金屬棒為軸，金屬棒直徑的選取根據(jù)手術(shù)對象的骨髓腔直徑而定，沿下底將薄膜卷起，形成仿天然骨結(jié)構(gòu)的多層棒狀三維支架。
有益效果本發(fā)明優(yōu)點在于用簡便易行的方法得到降解速率與成骨速率相匹配的三維纖維支架PHBV/PEO-nHA，且成本低廉；材料表現(xiàn)出良好的生物相容性，在動物實驗中無免疫排斥反應(yīng)；仿生的三維纖維支架結(jié)構(gòu)和成分與天然骨類似，有效促進骨缺損部位的愈合。
具體實施方式
本發(fā)明提供的以PHBV為基質(zhì)的促進骨缺損修復(fù)的可降解三維纖維支架的制備方法包括以下步驟
首先選取生物材料聚羥基丁酸戊酸共聚酯PHBV，其水溶性好，可促進支架整體降解速率的聚氧乙烯PEO和具有骨傳導(dǎo)能力但需要載體的納米級羥基磷灰石nHA為原料，通過靜電紡絲方法制備PHBV復(fù)合納米纖維膜，然后通過裁剪和折疊得到多層棒狀三維纖維支架，用做大尺寸骨缺損修復(fù)的植入材料。
可降解納米纖維薄膜的獲得是將PHBV和PEO以一定比例混合，溶解于三氟乙醇 (TFE)溶劑中，通過靜電紡絲的方法實現(xiàn)的，PHBV和PEO比例的選取是通過制備不同配比 (PHBV:PE0=9:1,8:2,7:3,6:4,5:5)的納米纖維，經(jīng)過降解實驗和細(xì)胞相容性實驗，從而得到降解速度適宜細(xì)胞相容性好的最佳配比。
nHA的摻入是通過超聲和攪拌的方法實現(xiàn)的，首先將PHBV和PEO與溶劑TFE用磁力攪拌器攪拌90分鐘至溶解，同時nHA加入TFE中超聲90分鐘至完全分散，然后兩者混合， 磁力攪拌30分鐘，得到均勻的靜電紡絲溶液。
可降解三維纖維支架的獲得是通過將PHBV/PEO-nHA納米纖維薄膜裁剪成所需大小的等腰梯形，以一定直徑的金屬棒為軸，沿下底將薄膜卷起，形成中空多層棒狀三維纖維支架，與骨結(jié)構(gòu)類似。
本發(fā)明提供的可降解三維纖維支架用于骨缺損修復(fù)包括以下步驟
⑴靜電紡絲得到的PHBV/PEO-nHA納米纖維膜經(jīng)過加工得到三維棒狀支架；
⑵建立兔橈骨臨界缺損模型，植入步驟I得到的可降解三維纖維支架。
實例
I. PHBV加入溶劑三氟乙醇(TFE)中，通過磁力攪拌器攪拌至完全溶解，為了得到納米級纖維，獲得與骨再生速率相匹配的降解速率，加入了另一種生物材料聚氧乙烯 (PEO)，PHBV 與 PEO 質(zhì)量比為 9:1,8:2,7:3,6:4,5:5 ；
2. nHA加入TFE中，超聲90分鐘，使nHA均勻分散在TFE中，nHA添加量為PHBV/ PEO的10% (質(zhì)量百分含量)；
3.步驟I，2得到的溶液混合攪拌均勻，得到終濃度為2%的靜電紡絲溶液；
4.將紡絲溶液加入20毫升的注射器中，注射器針頭為平口，內(nèi)徑為O. 5毫米，注射器固定在推進泵上，推進速度設(shè)為5毫升/小時，高壓直流電源正極接注射器針頭，負(fù)極接收集器(滾軸轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘)，電壓為12千伏，收集距離為25厘米，2小時后將得到的PHBV納米纖維膜取下，30度真空干燥24小時得到可降解PHBV/PEO-nHA復(fù)合電紡纖維
5.將得到的五種不同配比的PHBV/PE0纖維膜浸泡在模擬體液中進行降解實驗， 每2周稱重測量質(zhì)量損失，掃描電鏡(SEM)拍照觀察形貌變化，發(fā)現(xiàn)隨PEO量的增加降解速率加快。
6.將得到的五種不同配比的PHBV/PE0纖維膜進行細(xì)胞培養(yǎng)實驗，通過檢測細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)隨PEO的量增加細(xì)胞增殖減慢，結(jié)合步驟5得到的數(shù)據(jù)，選定PHBV = PEO質(zhì)量比為 6:4的纖維薄膜為降解和細(xì)胞相容性最佳的材料。
7.將所制備的6:4的PHBV/PEO-nHA纖維膜裁剪成上底I. 5厘米，下底2. 5厘米， 高10厘米的等腰梯形，以直徑2毫米的金屬棒為軸沿下底將薄膜卷起，形成中空多層棒狀三維支架，支架長2. 5厘米，直徑約O. 3厘米，碘伏浸泡滅菌備用，
8.在新西蘭大白兔左前肢建立橈骨缺損模型，將PHBV材料植入骨缺損處。
9.每4周拍X片查看骨缺損部位修復(fù)效果。
權(quán)利要求
1.一種促進骨缺損修復(fù)的可降解三維纖維支架的制備方法，其特征在于首先選取生物材料聚羥基丁酸戊酸共聚酯PHBV、水溶性可促進支架降解的聚氧乙烯PEO和具有骨傳導(dǎo)能力但需要載體的納米級羥基磷灰石nHA為原料，在三氟乙醇TFE溶劑中分別溶解PHBV、PEO和nHA，將PHBV、PEO溶液和nHA溶液充分混合得到PHBV-PE0_nHA靜電紡絲溶液，通過靜電紡絲方法制備PHBV/PEO-nHA復(fù)合納米纖維膜，然后通過裁剪和折疊得到多層棒狀三維支架，用做大尺寸骨缺損修復(fù)的植入材料；其中，PHBV、PE0、nHA的比例為6:4:1 1. 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進骨缺損修復(fù)的可降解三維纖維支架的制備方法，其特征在于所述PHBV/PEO-nHA靜電紡絲溶液的質(zhì)量百分濃度為2%，最佳摻雜比為PHBV:PE0=6:4,nHA添加量的質(zhì)量百分含量為PHBV-PEO混合物的10 15%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進骨缺損修復(fù)的可降解三維纖維支架的制備方法，其特征在于nHA的摻入是通過超聲和攪拌的方法實現(xiàn)的，首先將PHBV和PEO與溶劑TFE用磁力攪拌器攪拌90 120分鐘至溶解，同時nHA加入三氟乙醇TFE中超聲90 120分鐘至完全分散，然后兩者混合，磁力攪拌30飛0分鐘，得到均勻的靜電紡絲溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進骨缺損修復(fù)的可降解三維纖維支架的制備方法，其特征在于三維支架的獲得是通過將PHBV-PEO-nHA納米纖維薄膜裁剪成等腰梯形，其中等腰梯形的高度和下底寬度由骨缺損的尺寸決定，以金屬棒為軸，金屬棒直徑的選取根據(jù)手術(shù)對象的骨髓腔直徑而定，沿下底將薄膜卷起，形成仿天然骨結(jié)構(gòu)的多層棒狀三維支架。
全文摘要
促進骨缺損修復(fù)的可降解三維纖維支架的制備方法涉及一種基于靜電紡絲技術(shù)的納米纖維支架材料的制備方法。它是將可降解、無免疫源性，但不能誘導(dǎo)成骨的生物材料聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)、水溶性好，可促進支架更快降解的聚氧乙烯(PEO)和具有骨傳導(dǎo)能力但需要一定載體的納米級羥基磷灰石(nHA)結(jié)合起來，通過靜電紡絲的方法，得到直徑為納米級的電紡纖維薄膜，通過裁剪和折疊最終得到多層棒狀可降解三維支架材料。經(jīng)動物實驗證實該支架生物相容性好，降解速度適宜，可實現(xiàn)大尺寸骨缺損的修復(fù)。
文檔編號A61L27/18GK102973981SQ20121040064
公開日2013年3月20日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者黃寧平, 呂蘭欣, 張曉峰 申請人:東南大學(xué)