專利名稱：一種水分散的錳摻雜磁性納米簇及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米材料領(lǐng)域，具體涉及一種水分散的錳摻雜磁性納米簇。本發(fā)明還涉及上述水分散的錳摻雜磁性納米簇的制備方法和表征。本發(fā)明還涉及上述水分散的錳摻雜磁性納米簇作為MRI造影劑在體內(nèi)外的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磁共振成像(MRI)作為目前臨床上最重要的無創(chuàng)診斷手段，能提供高分辨率的解剖信息、功能信息及更好的軟組織對比度，而造影劑的使用能幫助更好的區(qū)分病理組織與正常組織。目前一些可用于MRI的T2造影劑例如菲立磁(氧化鐵納米粒)磁性較低，導(dǎo)致弛豫率低和敏感性不足的問題，從而限制了其在臨床的應(yīng)用。因此，研制一種高弛豫率的造 影劑對于疾病診斷具有重大意義。將金屬M(fèi)摻雜到氧化鐵納米粒中(MFe204,M = Co、Mn、Ni、Cu、Zn)可明顯提高造影劑的弛豫率。與其它金屬相比，Mn的參雜(MnFe2O4)表現(xiàn)出更高的磁性和更好的MRI造影效果，極具潛力成為一種新型MRI探針。最新研究表明，將MnFe2O4造影劑做成簇，會(huì)進(jìn)一步提高磁性和弛豫率。許多研究將MnFe2O4 (Mn Fe = I 2)用不同配體通過自組裝方法制備而成的水分散的納米簇，弛豫率增加至270、345，甚至ATO(Mr^Fe)Iiir1 s_S遠(yuǎn)高于非簇納米粒的弛豫率。然而，由于錳與鐵的摩爾比(Mn : Fe = I : 2)相對較高，易導(dǎo)致潛在的神經(jīng)性毒性，故降低錳的含量但同時(shí)保持較高的弛豫性能是研發(fā)高敏感性造影劑急需解決的難題之一。迄今為止，微量錳參雜的磁性納米粒MnFe2O4用于造影劑的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種水分散的錳摻雜磁性納米簇。本發(fā)明的又一目的在于提供制備上述水分散的錳摻雜磁性納米的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的水分散的錳摻雜磁性納米簇，以MnxFe(1_x)Fe204為內(nèi)核，表面修飾娃燒化試劑，表達(dá)式為TETT-MnxFe (1_x)Fe2O4, x < I ；式中TETT為硅烷化試劑；本發(fā)明提供的制備上述水分散的錳摻雜磁性納米簇的方法，采用高溫分解法制備油酸包被的超順磁性MxFe(1_x)Fe2O4U < D納米粒，然后通過配體交換法用硅烷化試劑替換納米粒表面油酸獲得水分散的錳摻雜磁性納米簇，表達(dá)式為TETT-MxFe(1_x)Fe204(x < I)。本發(fā)明的水分散的錳摻雜磁性納米簇中，內(nèi)核的粒徑為4納米至20納米。本發(fā)明的水分散的錳摻雜磁性納米簇中，硅烷化試劑包括硅烷羧酸、硅烷氨基、硅烷巰基或硅烷聚乙二醇(硅烷PEG)。本發(fā)明的水分散的錳摻雜磁性納米簇可以應(yīng)用在作為藥物載體及基因轉(zhuǎn)染中、作為細(xì)胞示蹤藥物中以及作為磁共振造影劑中。
本發(fā)明首次將硅烷羧酸鍵合到錳摻雜磁性納米粒表面，制備出一系列水分散的錳摻雜磁性納米簇。其本身具備高弛豫性能，可作為MRI造影劑。該納米簇表面由于覆蓋硅烷羧酸，具有大量可供修飾的官能團(tuán)，可用于連接熒光分子或螯合劑，從而作為多模式造影劑的載體，也可用于負(fù)載藥物或基因而具有成為藥物和基因轉(zhuǎn)染載體的潛力。研究結(jié)果表明微量錳摻雜磁性納米簇[TETT-MnaO4]弛豫率高達(dá)528.，高于未摻雜的純鐵納米簇(TETT-Fe3O4)。其在高達(dá)200 μ g mL—1的濃度下仍然具有很低的細(xì)胞殺傷力，體內(nèi)HE染色以表明此納米簇在體內(nèi)具有良好的生物相容性。小鼠肝臟造影結(jié)果顯示此納米簇具備極好的MRI造影增強(qiáng)效果。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例I水分散的微量錳摻雜磁性納米簇[TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4U =0、0. 05、0. 09、0. 16,0. 40)]透射電子顯微鏡(TEM)圖；其中A 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4U = O)；
B 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4U = O. 05)；C 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4U = O. 09)；D 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4U = O. 16)；E 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe a_x)Fe204 (x = O. 40)。圖2是本發(fā)明實(shí)施例I中水分散的微量錳摻雜磁性納米簇[TETT-MnxFe (1_x)Fe2O4U=0,0. 05,0. 09,0. 16，O. 40)]X 射線衍射(XRD)圖；其中A 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4 (x = O)；B 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4(x = O. 05)；C 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4U = O. 09)；D 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4U = O. 16)；E 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe a_x)Fe204 (x = O. 40)。圖3是本發(fā)明實(shí)施例I中水分散的微量錳摻雜磁性納米簇[TETT-MnxFe (1_x)Fe2O4U=0,0. 05,0. 09,0. 16，O. 40)]粒徑分布(DLS)圖。圖4是本發(fā)明實(shí)施例I中水分散的微量錳摻雜磁性納米簇[TETT-MnxFe (1_x)Fe2O4U=0,0. 05,0. 09,0. 16，O. 40)]傅里葉紅外(FTRI)圖；其中a 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4 (x = O)；b 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4(x = O. 05)；c 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4U = O. 09)；d 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4U = O. 16)；e 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe (H)Fe2O4 (x = O. 40)。圖5是本發(fā)明實(shí)施例I中微量錳摻雜磁性納米裸核[MnxFe(1_x)Fe2O4 (x = 0,0. 05,O. 09,0. 16,0. 40)]飽和磁化強(qiáng)度(VSM)曲線圖。圖6是本發(fā)明實(shí)施例I中水分散的微量錳摻雜磁性納米簇[TETT-MnxFe (1_x)Fe2O4U=0,0. 05,0. 09,0. 16，O. 40)]在7T核磁共振儀上所測定的弛豫率值；其中a 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4 (x = O. 05)；b 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4U = O. 09)；
c 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe204 (x = O)；d 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4U = O. 16)；
e 是本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4(x = O. 40)；圖中的橫坐標(biāo)是TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4的濃度，縱坐標(biāo)為橫向弛豫時(shí)間(T2)的倒數(shù)，線性擬合后的斜率則為弛豫率(r2)。圖7 是C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞與本發(fā)明實(shí)施例 I 中 TETT-Mn(l.(l5Fe((l.(l5)Fe204在0、25、50、100、200μ g/mL濃度下共同孵育24小時(shí)和48小時(shí)后，細(xì)胞生存率的柱狀圖。圖8 是 ICR 小鼠尾靜脈注射前，與注射 TETT-Mntl. Q5Fe(Q. Q5)Fe204 (2. 5mg/kg) 30 分鐘與120分鐘后肝部的T2加權(quán)成像掃描圖。圖9是ICR正常小鼠與尾靜脈注射TETT-Mntl.Q5Fe((l.Q5)Fe204(5mg/kg) 5天后小鼠的心臟、肝臟、脾、肺、腎組織切片通過HE染色得到的病理組織分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的水分散的錳摻雜磁性納米簇，以粒徑約為4納米至20納米的TETT-MnxFe(1_x)Fe204(x < I)為內(nèi)核，表面修飾硅烷化試劑。為敘述上的方便，將本發(fā)明的水分散的微量錳摻雜磁性納米簇表示為TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4 (x < I)；TETT是指硅烷化試劑，包括硅烷羧酸、硅烷氨基、硅烷巰基或硅烷PEG。本發(fā)明的水分散的錳摻雜磁性納米簇，由于在MnxFe(1_x)Fe2O4納米粒外面修飾了硅烷羧酸，這類納米粒在水溶液中具有好的分散性、穩(wěn)定性和生物相容性，由于外部羧基可以共價(jià)或物理結(jié)合藥物、DNA等，因此可用作基因和藥物載體，而且由于去具有高磁性和良好的弛豫性能，能夠?qū)崿F(xiàn)高效、穩(wěn)定的體內(nèi)外組織或細(xì)胞的標(biāo)記和MRI造影。本發(fā)明的水分散的錳摻雜磁性納米簇，是在Fe3O4內(nèi)核中摻雜了不同比例的二價(jià)錳離子，由這些二價(jià)錳離子取代部分二價(jià)鐵離子。不同比例的錳摻雜量用來評估對成簇程度、磁化強(qiáng)度、弛豫性能的影響。本發(fā)明制備上述水分散的錳摻雜磁性納米簇的方法，是采用公知的高溫分解法先制備得到油酸包被的超順磁性MnxFe(1_x)Fe204(X< I)納米粒，然后通過配體交換法用硅烷化試劑替換納米粒表面油酸獲得水分散的微量錳摻雜磁性納米簇。以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明。實(shí)施例II) OA-MnxFe(1_x)Fe204 的制備采用Sun et al法合成油酸包被的微量猛摻雜的磁性納米粒(0A_MnxFe(1_x)Fe204)將 2mmolFe (acac) 3>BmmoI 油酸、6mmol 油胺、IOmmol I, 2_ 十六燒二醇分別與 0、0· 05、0· I、O. 5、ImmolMn (acac) 2混合,溶于20ml 二甲苯醚中，氮?dú)獗Ｗo(hù),機(jī)械攪拌條件下升溫至100 °C后進(jìn)行抽真空30min，充氮?dú)猓郎刂?00°C維持2h，升溫至300°C回流反應(yīng)Ih，冷卻至室溫，加入40ml無水乙醇，離心，所得黑色沉淀重新溶于正己烷，加入O. 05ml油酸和油胺，離心(6000rpm, IOmin),取上清液，加入40ml無水乙醇，離心(6000rpm, IOmin),棄上清液，將所得固體重新分散在正己烷中保存?zhèn)溆谩?) TETT-MnxFe(H)Fe2O4 的制備
采用配體交換法合成水分散的微量錳摻雜的磁性納米粒(TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4)將50mg步驟I制備的OA-MnxFe(1_x)Fe2O4溶于IOOml無水甲苯中，加入30 μ I醋酸，超聲15min，加入O. 6ml硅烷羧酸，70°C下磁力攪拌48小時(shí)。用永磁鐵從反應(yīng)液中分離出TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4固體，采用傾注法將所得固體用甲苯洗兩次，無水甲醇洗兩次,再分散于微量去離子水中，透析24小時(shí)，冷凍干燥得到純凈TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4固體。本發(fā)明制備的TETT-MnxFe(1_x)Fe204(x = 0 , 0 . 05 , 0 . 09 , 0. 16 , 0 . 40)的透射電鏡，X射線衍射，粒徑分布，傅里葉紅外及飽和磁化強(qiáng)度的表征見圖1、2、3、4、5。從圖I中可以看出，隨著錳含量的增加，TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4納米粒的成簇程度逐步降低。從圖2中可以看出，微量錳摻雜并未改變磁性納米粒的尖晶石結(jié)構(gòu)，另外，在19°C 至29°C的寬峰是硅烷羧酸的不定形峰，證明了硅烷羧酸的成功鍵和。從圖3中可以看出，隨著錳摻雜含量的增加，TETT-MnxFe(1_x)Fe204納米簇的水合粒徑逐漸減小。從圖4中可以看出，Si-O-Si鍵(11020^1)和N-C鍵(919(^1)的出現(xiàn)表明了硅烷羧酸成功鍵和到MnxFe (1_x)Fe2O4納米粒的表面。從圖5中可以看出，隨著錳摻雜量的增加，裸核MnxFe(1_x)Fe204的磁性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，表明微量錳摻雜(X = O. 05)時(shí)有助于提高納米粒的磁性。實(shí)施例2將實(shí)施例I中的硅烷羧酸分別換成硅烷氨基、硅烷巰基和硅烷聚乙二醇，其余條件同實(shí)施例1，制備得到的同實(shí)施例I的TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4納米簇。本發(fā)明提供的一系列微量錳摻雜磁性納米簇(TETT-MnxFe(1_x)Fe2O4)，由于在磁性納米粒表面共價(jià)鍵合了一層硅烷羧酸，有效提高了 MnxFe(3_x)04在水溶液中的分散性及穩(wěn)定性并且成簇，同時(shí)微量的金屬摻雜，較之MnFe2O4降低了猛毒性，保持了良好的生物相容性，更提高了納米粒的磁性，增強(qiáng)了其弛豫性能。本發(fā)明提供的摻雜磁性納米簇，在進(jìn)行尾靜脈注射后，能有效地提高M(jìn)RI信號強(qiáng)度，增強(qiáng)小鼠肝臟的組織對比度，有潛力成為一種新型的T2造影劑。實(shí)施例3弛豫率的測定實(shí)驗(yàn)稱取實(shí)施例I中任意一種的錳摻雜磁性納米簇(X = 0、0. 05、0. 09、O. 16、O. 40)，溶于1%的瓊脂糖凝膠，分別配制成濃度為O. 1,0. 05,0. 025,0.0125,0. 00625毫摩爾(Fe+Mn)/升的溶液。使用7T核磁共振儀，選定RARE-TI+T2_map序列，各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置如下TR = 800ms, TE = 11ms, 33ms, 55ms, 77ms,99ms, matrix size = 256X256, FOV =
4.0 X 4. Ocm2, flip angle (FA) = 180°C及 slice thickness = 1mm，對所配溶液進(jìn)行 T2 加權(quán)成像掃描，將所得橫向弛豫時(shí)間(T2)的倒數(shù)與濃度進(jìn)行線性擬合，所得斜率即為弛豫率。其擬合曲線見圖6。從圖6中可以看出，隨著錳摻雜含量的增加，r2值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與其磁性趨勢相符合，此外，納米粒成簇程度的減小亦是導(dǎo)致r2值驟然下降的原因。這表明，微量錳摻雜(X = O. 05)有助于獲得高弛豫性能的納米造影劑。實(shí)施例4
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)I)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素)，在37°C含有5% C02的保濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。2)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)首先將C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞以I X IO5的細(xì)胞密度接種于96孔板孵育24小時(shí)。而后將實(shí)施例I中錳摻雜磁性納米簇TETT-Mna05Fe(1_0.05)Fe2O4用培養(yǎng)基配制成濃度為25、50、100、150和200 μ g/mL的溶液，分別向96孔板不同孔內(nèi)加入含納米粒的培養(yǎng)基，共同孵育，24小時(shí)和48小時(shí)后，棄掉含納米粒的培養(yǎng)基，用PBS洗兩次，加入MTT (100 μ 1，O. 5mg/ml)，孵育4小時(shí)，棄掉MTT，加入150 μ I DMSO,避光震蕩5分鐘，用酶標(biāo)儀測定490nm波長下每孔的OD值。不同濃度下的細(xì)胞存活率見圖7。從圖7中可以看出，即使在高達(dá)200 μ g mL-1的濃度下孵育48小時(shí)候仍然具有很低的細(xì)胞殺傷力，表明此納米簇具有良好的生物相容性。
實(shí)施例5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)I)磁共振成像實(shí)驗(yàn)選取ICR小鼠(20g)，以6%水合氯醛O. lml/20g,腹腔注射麻醉。使用7T核磁共振儀，選定TurboRARE-T2序列，各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置如下TR = 3000. Oms,TE = 45. Oms, matrix size = 256X256, field of view = 3. 0X3. Ocm2, flip angle =180° , slice thickness = Imm 及 number of averages = 10,對小鼠肝臟部位進(jìn)行 T2 加權(quán)成像掃描。將實(shí)施例I中錳摻雜磁性納米簇TETT-MnaFe2O4通過尾靜脈以2. 5mg/kg的劑量注入小鼠內(nèi)，分別在注射30分鐘及120分鐘后，以同樣序列對小鼠進(jìn)行MRI掃描。所得T2加權(quán)圖像見圖8。2)取臟器組織及后固定選取ICR小鼠(20g)，將實(shí)施例I中錳摻雜磁性納米簇TETT-Mn0.05Fe(1_0.05)Fe204通過尾靜脈以5mg/kg的劑量注入小鼠內(nèi)，6天后，處死，仰臥固定，沿胸廓下沿打開胸腔，取出心臟，肝臟，脾，肺，腎內(nèi)臟置于10%甲醛溶液中，放置四天至組織沉于瓶底。3)石蠟包埋切片將組織從10%甲醛溶液中取出，蒸餾水洗凈，脫水后嵌入石蠟，快速冷凍，進(jìn)行石蠟切片，切片厚度為5 μ m，展于載玻片上。4)切片組織的HE染色將組織切片入蒸餾水后，放入Harris蘇木精染液中染色15min,自來水沖洗20min返藍(lán),后置于鹽酸酒精分色液中10秒進(jìn)行分色，自來水沖洗5min后如蒸餾水，然后置于I %伊紅染色10秒，自來水沖去浮色，依次入70^,95%, 100%酒精上行脫水lmin，后置入二甲苯中透明2min，以中性樹膠封片。5)分析于倒置顯微鏡下觀察各臟器組織切片，見圖9。從圖9中可以看出，本發(fā)明的錳摻雜磁性納米簇TET T-Mn0.05Fe(1_0.05)Fe204不具有明顯的組織毒性，表明其生物相容性良好。
權(quán)利要求
1.ー種水分散的錳摻雜磁性納米簇，以MnxFe(1_x)Fe204為內(nèi)核，表面修飾硅烷化試劑，表達(dá)式為 TETT-MnxFe (1_x) Fe2O4, x < I ； 式中 TETT為硅烷化試劑。
2.如權(quán)利要求I所述水分散的錳摻雜磁性納米簇，其中，內(nèi)核的粒徑為4納米至20納米。
3.如權(quán)利要求I所述水分散的摻雜磁性納米簇，其中，硅烷化試劑包括硅烷羧酸、硅烷氨基、硅烷巰基或硅烷聚こニ醇。
4.ー種制備權(quán)利要求I所述水分散的錳摻雜磁性納米簇的方法，采用高溫分解法制備油酸包被的超順磁性MnxFe(1_x)Fe204(x < I)納米粒,然后通過配體交換法用娃燒化試劑替換納米粒表面油酸獲得水分散的微量錳摻雜磁性納米簇，表達(dá)式為 TETT-MnxFe (1_x) Fe2O4 χ < I ； 式中 TETT為硅烷化試劑。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其中，內(nèi)核的粒徑為4納米至20納米。
6.如權(quán)利要求4所述的制備方法,其中,娃燒化試劑包括娃燒羧酸、娃燒氨基、娃燒巰基或硅烷聚こニ醇。
7.權(quán)利要求I所述水分散的錳摻雜磁性納米簇在作為藥物載體及基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求I所述水分散的錳摻雜磁性納米簇在制備作為細(xì)胞示蹤藥物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I所述水分散的錳摻雜磁性納米簇在制備作為磁共振造影剤中的應(yīng)用。
全文摘要
一種水分散的錳摻雜磁性納米簇，以MnxFe(1-x)Fe2O4為內(nèi)核，表面修飾硅烷化試劑，表達(dá)式為TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4，x＜1；式中TETT為硅烷化試劑。本發(fā)明的制備方法是采用高溫分解法制備具有較高磁性的油酸包被的超順磁性MnxFe(1-x)Fe2O4納米粒，然后通過配體交換法用硅烷羧酸替換納米粒表面油酸獲得水分散微量錳摻雜磁性納米簇(TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4)。本發(fā)明可以用于體內(nèi)外組織或細(xì)胞的標(biāo)記和MRI造影。
文檔編號A61K47/34GK102863026SQ20121034825
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者葉玲, 戚穎哲, 邵晨, 顧微, 李福英, 鄧云龍 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)