專(zhuān)利名稱(chēng)：伏立諾他在制備治療自身免疫及炎癥性疾病藥物方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物化學(xué)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域,涉及藥物伏立諾他(Vorinostat)在制備作為治療多發(fā)性硬化及其動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)，好發(fā)于青壯年，發(fā)病年齡多在20 40歲，可引起各種癥狀，包括感覺(jué)改變、視覺(jué)障礙、肌肉無(wú)力、憂郁、協(xié)調(diào)與講話困難、嚴(yán)重的疲勞、認(rèn)知障礙、平衡障礙、體熱和疼痛等，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致活動(dòng)性障礙和殘疾。多發(fā)性硬化癥的病因不清，多被認(rèn)為是自身免疫性疾病。迄今尚無(wú)肯定有效的治愈辦法。 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental AutoimmuneEncephalomyelitis, EAE)是由同種型、同種異型、異種異型致腦炎抗原如髓鞘脂蛋白(PLP)、髓鞘堿性蛋白(MBP)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)和髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)誘導(dǎo)的、實(shí)驗(yàn)敏感動(dòng)物產(chǎn)生的、由細(xì)胞免疫反應(yīng)介導(dǎo)的、以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為特征的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)性自身免疫疾病。根據(jù)致敏原的組成、致敏的方法和動(dòng)物的遺傳背景的不同，可誘導(dǎo)出超急性、急性、慢性臨床和病理特點(diǎn)的EAE。其中慢性復(fù)發(fā)性EAE的病程呈遷延復(fù)發(fā)者，其病理特征和MS相似，均表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘改變，與MS極相似，是MS的理想模型?？烧T導(dǎo)出慢性復(fù)發(fā)性EAE作為多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型。雖然其病理發(fā)生還沒(méi)有被完全了解，但是普遍認(rèn)為自身免疫性腦脊髓炎是由輔助型T細(xì)胞(THl和TH17)介導(dǎo)的自身免疫性炎癥引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥疾病。越來(lái)越多的研究表明，TH17細(xì)胞反應(yīng)的異常與多發(fā)性硬化及實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎有關(guān)，并在自身免疫性疾病和感染性疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。因此，對(duì)伏立諾他調(diào)節(jié)EAE發(fā)生過(guò)程中對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用及其作用靶點(diǎn)，將有助于為人類(lèi)多發(fā)性硬化癥的治療提供新思路。伏立諾他中文別名N-羥基-N’ -苯基辛二酰胺，是一種組蛋白去乙?；敢种苿?HDACIs)。核小體的組蛋白乙?；娇捎绊懩承┺D(zhuǎn)錄因子接近其所在部位的基因序列，影響特定基因的轉(zhuǎn)錄。組蛋白的乙?；接上嗷マ卓沟慕M蛋白乙酰化酶(HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)調(diào)節(jié)。組蛋白去乙?；敢种苿?HDACIs)則通過(guò)抑制HADs而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控。組蛋白去乙?；敢种苿?suberoylanilidehydroxamic acid, SAHA)已被批準(zhǔn)用于臨床治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，有多種HDACIs處于臨床試驗(yàn)階段。除了明確的抗腫瘤活性，HDACIs還顯示出免疫調(diào)節(jié)活性。本發(fā)明體外實(shí)驗(yàn)表明HDACIs可抑制T淋巴細(xì)胞的活化、增殖及分泌細(xì)胞因子；利用自身免疫性疾病動(dòng)物模型進(jìn)行的研究也證實(shí)了其免疫抑制活性。但是伏立諾他對(duì)炎癥反應(yīng)的輔助性T細(xì)胞THl和TH17亞群介導(dǎo)的EAE的調(diào)節(jié)作用及對(duì)多發(fā)性硬化的治療作用尚無(wú)報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開(kāi)了伏立諾他在制備治療自身免疫性和神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病藥物方面的應(yīng)用。其中自身免性疾病指的是多發(fā)性硬化癥(圖1-11)、自身免疫性視網(wǎng)膜炎(圖8-11)、視神經(jīng)脊髓炎(圖8-11)、橋本氏甲狀腺炎(圖8-11)、自身免疫性溶血性貧血(圖8-11)、自身免疫性血小板減少癥(圖8-11)、重癥肌無(wú)力(圖8-11)、原發(fā)性膽汁性肝硬變(圖8-11)、侵襲性慢性肝炎(圖8-11)、慢性腎小球炎(圖8-11)、肌炎(圖8-11)、系統(tǒng)性硬化癥(圖8-11)(哪個(gè)圖或?qū)嶒?yàn)代表可以治療這些疾??？)。神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病指的是多發(fā)性硬化癥(圖1-11)、視神經(jīng)脊髓炎(圖8-11)和急性播散性腦脊髓炎(圖6-11)。本發(fā)明典型的治療效果是伏立諾他在制備治療自身免疫腦脊髓炎藥物方面的應(yīng)用；其中伏立諾他在治療多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的有效劑量?jī)?yōu)選為100 mg/Kg體重/天。折算成人按照50-60Kg體重的使用劑量為5_6g/天。本發(fā)明運(yùn)用治療多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎進(jìn)行了大量的藥理實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明伏立諾他可以降低小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)病率、臨床評(píng)分平均分、臨床評(píng)分最高分和臨床評(píng)分總分；可以減輕脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脊髓脫髓鞘；并且可以減輕脾臟中IFN- y分泌相關(guān)Thl細(xì)胞和IL-17A分泌相關(guān)Thl7細(xì)胞占⑶4陽(yáng)性T 細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎是多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎密切相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，因此，本發(fā)明有望在臨床上成為治療多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎等疾病的藥物。本發(fā)明公開(kāi)的伏立諾他(Vorinostat)在制備作為治療多發(fā)性硬化及其動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎藥物方面的應(yīng)用，通常是以藥物組合物的形式服用的，可口服或非口服給藥，或者以和藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑及其它添加劑形成的化合物(如片劑、緩釋制劑、膠囊劑、注射劑、溶液劑)安全的口服或非口服給藥。當(dāng)口服給藥時(shí)，組合物可配制成片劑、糖衣劑或膠囊。為制備口服藥物組合物可采用乳糖或淀粉做載體，明膠，羧甲基纖維素鈉，甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等是合適的結(jié)合劑或成顆劑。作為崩解劑可選用淀粉或微晶纖維素，常以滑石粉，膠體硅膠，硬脂酸甘油酯，硬脂酸鈣或鎂等作為合適的抗粘合劑和潤(rùn)滑劑。例如，可通過(guò)壓制濕顆粒來(lái)制備片劑。活性成分與載體以及選擇性的與一份崩解添加劑組成混合物，該混合物與粘合劑的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合適的設(shè)備中進(jìn)行顆?；?，干燥顆粒隨后加入其它的崩解劑，潤(rùn)滑劑和抗粘劑將此混合物壓片。本發(fā)明的系列化合物可以注射劑形式給藥，雖然劑量依治療對(duì)象、給藥方式、癥狀及其它因素而改變。實(shí)際服用的伏立諾他(Vorinostat)化合物的劑量應(yīng)該由醫(yī)生根據(jù)有關(guān)的情況來(lái)決定，這些情況包括被治療者的身體狀態(tài)，選者的給藥途徑、年齡、體重、患者對(duì)藥物的個(gè)體反應(yīng)，患者癥狀的嚴(yán)重程度等等。


圖I為伏立諾他(vorinostat)化學(xué)結(jié)構(gòu)式 圖2為口服伏立諾他(vorinostat, 100mg/kg)降低小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)病率圖；說(shuō)明伏立諾他可以降低多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎的發(fā)病率；
圖3為口服伏立諾他(vorinostat, 100mg/kg)降低小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的臨床評(píng)分平均分圖；說(shuō)明伏立諾他可以治療多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎；圖4為口服伏立諾他(vorinostat, 100mg/kg)降低小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的臨床評(píng)分最高分圖；說(shuō)明伏立諾他可以減輕多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎的發(fā)病程度；
圖5為口服伏立諾他(vorinostat，100mg/kg)降低小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的臨床評(píng)分總分圖；說(shuō)明伏立諾他可以治療多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎；
圖6為口服伏立諾他(vorinostat, 100mg/kg)減輕小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)圖(H&E染色);說(shuō)明伏立諾他抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，可以治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫炎癥性疾病多發(fā)性硬化、神神經(jīng)脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎；
圖7為口服伏立諾他(vorinostat, 100mg/kg)減輕小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的脊髓脫髓鞘(Luxol fast blue染色)；說(shuō)明伏立諾他可以治療以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)的疾病多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎； 圖8為口服伏立諾他(vorinostat，100mg/kg)降低小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的脾臟中IFN- y分泌相關(guān)Thl細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)典型代表圖);說(shuō)明伏立諾他可以治療以輔助性T細(xì)胞THl和TH17亞群介導(dǎo)為特點(diǎn)的疾??；
圖9為口服伏立諾他(vorinostat，100mg/kg)降低小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的脾臟中IFN-Y分泌相關(guān)Thl細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)柱狀圖);說(shuō)明伏立諾他可以治療以輔助性T細(xì)胞THl和TH17亞群介導(dǎo)為特點(diǎn)的疾病；
圖10為口服伏立諾他(vorinostat, 100mg/kg)降低小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的脾臟中IL-17A分泌相關(guān)Thl7細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)典型代表圖)；說(shuō)明伏立諾他可以治療以輔助性T細(xì)胞THl和TH17亞群介導(dǎo)為特點(diǎn)的疾??；
圖11為口服伏立諾他(vorinostat, 100mg/kg)降低小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的脾臟中IL-17A分泌相關(guān)Thl7細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)的柱狀圖)；說(shuō)明伏立諾他可以治療以輔助性T細(xì)胞THl和TH17亞群介導(dǎo)為特點(diǎn)的疾??；
(n=8,圖表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，*p〈0. 05, ** p〈0. 01, *林p〈0. 001, t檢驗(yàn))。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來(lái)限定，其中伏立諾他(vorinostat)有市售,其它所用的試劑，除特別標(biāo)注外均有市售。實(shí)施例I
I. I實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE)小鼠模型的構(gòu)建原理本實(shí)驗(yàn)選用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(mog35_55)mevgwyrspfsrvvhlyrngk作為抗原免疫C57BL/6小鼠，建立M0G35_55-EAE (實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎)小鼠模型。實(shí)驗(yàn)室常用致敏原多為腦或脊髓組織勻漿、髓鞘堿性蛋白成分或其多肽片段等，免疫對(duì)象多為嚙齒類(lèi)動(dòng)物來(lái)構(gòu)建EAE模型，不同的致敏原可產(chǎn)生發(fā)病癥狀不同的EAE模型，可根據(jù)其要建立的EAE模型的類(lèi)型選擇不同的致敏原，以及不同的被免疫對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)中用到的髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白雖然在髓鞘蛋白中含量很少，只占髓鞘蛋白成分的0. 01%-0. 05%，但由于MOG存在于髓鞘膜和少突膠質(zhì)細(xì)胞的最外層，具有高度免疫原性，且在構(gòu)建EAE過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，MOG是即能引起脫 髓鞘抗體反應(yīng)又能引起T細(xì)胞反應(yīng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘蛋白成分。因此，用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白去免疫小鼠可以建立發(fā)病機(jī)理以及臨床癥狀跟多發(fā)性硬化癥(MS)極其相似的EAE模型?，F(xiàn)在，許多證據(jù)證明MOG和抗MOG抗體在MS的發(fā)病過(guò)程中起很重要的作用，本實(shí)驗(yàn)參考近年國(guó)內(nèi)外相關(guān)方法，建立MOG誘導(dǎo)的穩(wěn)定的慢性的EAE理想模型。在利用MOG免疫小鼠時(shí)，應(yīng)制備抗原佐劑乳化物，國(guó)內(nèi)的乳化劑一般都選擇福氏佐劑，抗原佐劑是非特異性免疫增強(qiáng)劑，加入佐劑可以改變抗原的物理性狀，并延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)停留的時(shí)間，也可刺激抗原提呈細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答的效果，它還能引起遲發(fā)型血腦屏障通透性增加和自身免疫反應(yīng)，CFA (福氏佐劑)是當(dāng)今作用最強(qiáng)的佐劑，它是由人型結(jié)核桿菌制備的，提高結(jié)核桿菌的濃度，可提高EAE的發(fā)生率和復(fù)發(fā)率，但也容易引起注射部位壞死，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)也有利用卡介苗來(lái)代替人型結(jié)核桿菌來(lái)制備福氏佐劑的。本實(shí)驗(yàn)采用人型結(jié)核桿菌制備福氏佐劑。免疫動(dòng)物兩天后可注射白日咳毒素，注入白日咳毒素的目的是為了增加血管壁的通透性和血管表面粘附分子的變得，有利于致敏的T細(xì)胞透過(guò)血腦屏障，攻擊神經(jīng)髓鞘，造成腦脊髓組織的免疫損傷。在免疫動(dòng)物之后，再加用白日咳毒素后，小鼠的潛伏期縮短，臨床表現(xiàn)更加嚴(yán)重，最嚴(yán)重時(shí)頻臨死亡或者死亡，加和不加白日咳毒素的小鼠的EAE的潛伏期以及臨床癥狀相差很大，加了百日咳毒素可成功的誘導(dǎo)急性EAE模型。I. 2 EAE小鼠模型的構(gòu)建方法 I. 21實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及來(lái)源
雌性野生型C57BL/6無(wú)病原體(SPF級(jí))小鼠30只，6_8周齡，體重18_20g，購(gòu)自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20-25°C，相對(duì)濕度為40%-60%。I. 22抗原佐劑乳化物的制備
100 Ii gM0G35_55 多妝和 500 u g 滅活的分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,結(jié)核桿菌，購(gòu)自Difco公司)與100 ill生理鹽水和100 ill Freund’s佐劑(購(gòu)自SIGMA公司)完全混合，乳化。I. 23實(shí)驗(yàn)分組
為研究伏立諾他在小鼠EAE動(dòng)物模型中的藥物作用，小鼠隨機(jī)分四組，每組8只小鼠，分別為兩個(gè)生理鹽水對(duì)照組和兩個(gè)100 mg/kg/天伏立諾他給藥組。一個(gè)對(duì)照組和一個(gè)伏立諾他給藥組每天檢查記錄小鼠EAE發(fā)病情況和臨床神經(jīng)功能分級(jí)至免疫誘導(dǎo)后30天；另一個(gè)對(duì)照組和一個(gè)伏立諾他給藥組在小鼠EAE發(fā)病高峰期即免疫誘導(dǎo)后第15天處死，取脊髓和脾臟。I. 23實(shí)驗(yàn)方法和步驟
I. 231小鼠后背皮下分2個(gè)點(diǎn)注射乳化劑(100 u I/點(diǎn))。I. 232同時(shí)在當(dāng)天尾靜脈注射200ng的百日咳毒素。I. 233免疫48小時(shí)后每只小鼠再次尾靜脈注射200ng百日咳毒素(pertussistoxin,購(gòu)自 List Biological Laboratories)。I. 234伏立諾他給藥組從免疫誘導(dǎo)后第7天開(kāi)始每天用伏立諾他灌胃給藥，劑量為 100 mg/kg/ 天。1.235 7-14天后小鼠開(kāi)始發(fā)生EAE。每天檢查記錄小鼠EAE發(fā)病情況和臨床神經(jīng)功能分級(jí)。
I. 24 EAE小鼠模型臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)
小鼠經(jīng)MOG免疫后，隔日采用盲法由兩名觀察者，采用國(guó)際通用的5分評(píng)分制對(duì)小鼠進(jìn)行臨床評(píng)分，每天檢查并記錄疾病的臨床神經(jīng)功能分級(jí)，直至MOG免疫后30天。小鼠EAE動(dòng)物模型神經(jīng)功能評(píng) 分具體標(biāo)準(zhǔn)如下0分，無(wú)明顯異常，沒(méi)有明顯的臨床癥狀；0. 5分，部分尾巴無(wú)力松弛；1分，完全尾巴癱瘓可見(jiàn)輕度笨拙；2分，后肢無(wú)力，行動(dòng)遲緩，輕度共濟(jì)失調(diào)；2. 5分，一條后肢癱瘓；3分，雙側(cè)后肢癱瘓，被動(dòng)翻身后不能恢復(fù)，但給予刺激后可挪動(dòng)；3. 5分，雙側(cè)后肢癱瘓，前肢無(wú)力；4分，雙側(cè)后肢癱瘓伴前肢癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或死亡。1.3 EAE小鼠模型發(fā)病高峰期處理 I. 31取脊髓組織作石蠟切片
I. 311脊髓固定
在免疫誘導(dǎo)后第十五天取脊髓組織，將組織置于包埋盒中，4%中性多聚甲醛固定，30min以上或過(guò)夜。I. 312組織脫水
流水沖洗脊髓組織中的甲醛30min — 75%酒精30min — 85%酒精30min — 95%酒精
IIh — 95%酒精I(xiàn)I 2h — 95%酒精I(xiàn)II過(guò)夜或2h —無(wú)水酒精I(xiàn) 30min —無(wú)水酒精I(xiàn)I 30min —無(wú)水酒精I(xiàn)II 30min
I. 313組織透明(低溫)二甲苯I 15 min—二甲苯II 10 min—二甲苯III 10 minI. 314組織浸蠟(60°C ):石(熔)蠟I 90 min —石(熔)蠟II 60 min —打開(kāi)包埋盒，取出組織，放入預(yù)熱的模具(包含溶蠟)中，包埋盒置頂一繼續(xù)添加石(熔)蠟，直至包埋盒底部浸沒(méi)于石(熔)蠟中。I. 315冷卻取出模具，置于4°C冰箱過(guò)夜，充分冷卻后，常溫貯藏備用 I. 316石蠟切片
脊髓切片厚度為10um，將蠟片放入45°C溫水中，使其自然展開(kāi)。持防脫玻片撈取蠟片，然后60°C烘片彡4h。I. 32脊髓組織石蠟切片染色
I. 321石臘切片脫臘石臘切片一二甲苯I 10 min—二甲苯II 10 min—二甲苯III 10
min
I. 322石蠟切片水化100%酒精2min — 95%酒精2min — 85%酒精2min — 75%酒精2min —蒸懼水沖洗Imin
I. 323石蠟切片HE染色蘇木精10 min —自來(lái)水漂洗I 3s —鹽酸酒精迅速分化(I滴濃鹽酸加入70%乙醇IOOml中)I 3s — 0. 1%氨水/PBS (7. 4 8. 0)返藍(lán)30s Imin —自來(lái)水沖洗2-5min —蒸餾水漂洗I 3s - 0. 5%伊紅染色I(xiàn)min —蒸餾水漂洗I 3s — 75%酒精10 30s — 85%酒精10 30s — 95%酒精30s Imin —無(wú)水酒精2 3min —透明封藏二甲苯I 3_5min — 二甲苯II 3-5 min — ( 二甲苯濕潤(rùn))滴樹(shù)膠一加蓋玻片。I. 324石蠟切片Luxol fast blue染色石蠟切片脫蠟一脫水至95%酒精一置于Luxol固藍(lán)溶液中，在60°C溫度下，孵育過(guò)夜(16-24 h)—取出切片，于95%乙醇溶液中浸洗，洗去過(guò)多染液一取出切片，于去離子水中浸洗一切片于0. 05%碳酸鋰溶液中快速浸洗3-10s —立即取出切片，置于70%乙醇溶液中分化，直到灰質(zhì)和白質(zhì)能夠清晰辨別一取出切片，于去離子水中沖洗一切片于0. 05%碳酸鋰溶液中輕輕浸洗數(shù)次，然后置于70%乙醇溶液中浸洗數(shù)次，直到白質(zhì)顏色轉(zhuǎn)變成藍(lán)綠色，灰質(zhì)幾無(wú)顏色時(shí)，停止分化一切片去離子水中沖洗完全95%酒精30s Imin —無(wú)水酒精2 3min —透明封藏二甲苯I 3_5min — 二甲苯
II3-5 min — (二甲苯濕潤(rùn))滴樹(shù)膠一加蓋玻片。I. 33取脾臟做細(xì)胞內(nèi)染色 I. 331細(xì)胞準(zhǔn)備
1.3311麻醉小鼠，無(wú)菌分離脾臟。
I. 3312用注射器活栓輕輕研磨脾臟完全破碎，加入I. 8ml無(wú)菌超純水，迅速混勻后加入200 u I無(wú)菌的IOxPBS迅速混勻。I. 3313細(xì)胞懸液用40 iim篩網(wǎng)過(guò)濾。I. 3314并加2_3ml無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基沖洗篩網(wǎng)兩次。I. 3315 1500rpm/minx5min離心收集細(xì)胞，棄上清，重懸細(xì)胞。I. 3316用6mlRPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。I. 3317調(diào)整細(xì)胞密度為5xl06/ml I. 332刺激細(xì)胞因子分泌
I. 3321 每孔加入濃度為 Brefeldin A(BFA) I u 1/ml，100ng/ml 佛波醇酯(PMA)和終濃度I U g/ml I丐離子霉素(Ionomycin) , 37°C, 5% CO2刺激5小時(shí)。I. 333收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子染色
I. 3331 1500rpm/min離心收集細(xì)胞,棄上清。I. 3332充分重懸細(xì)胞后加入熒光標(biāo)記表面抗體⑶4，4°C避光反應(yīng)30分鐘。I. 3333 每管加入 staining buffer (SB) 1ml, 1500rpm/min 洗兩次，棄上清。I. 3334 每管加入 BD cytofix/prem 試劑 250 U 1，4°C避光反應(yīng) 30 分鐘 1.3335 每管加入 BD cytoprem/wash 試劑，1800rpm/min 洗一次,棄上清。I. 3336每管加入封閉液25 ill (其中包括20 ill 10%BSA和5 大鼠血清)，4°C避光反應(yīng)30分鐘。I. 3337加入熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體IFN-Y和IL-17A (及同型對(duì)照)，4°C避光反應(yīng)30分鐘。I. 3338 每管加入 BD cytoprem/wash 試劑，1800rpm/min 洗一次，棄上清。I. 3339 每管加入 SB lml, 1800rpm/min 洗一次，棄上清，細(xì)胞用 2%PFA 200 yl 重懸。I. 334上流式細(xì)胞儀檢測(cè) I. 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎是人多發(fā)性硬化癥的典型動(dòng)物模型，本發(fā)明每天每公斤體重灌胃IOOmg的伏立諾他可以顯著降低小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)病率(圖2)，抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎發(fā)病的臨床評(píng)分平均分(圖3)、臨床評(píng)分最高分(圖4)和臨床評(píng)分總分(圖5);減輕脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖6)和脊髓脫髓鞘(圖7);并且可以減輕小鼠脾臟中IFN- y分泌相關(guān)Thl細(xì)胞(圖8、圖9)和IL-17A分泌相關(guān)Thl7細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(圖10、圖11)。
伏立諾他對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎具有明顯的治療作用。綜合上述結(jié)果，說(shuō)明伏立諾他可以抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，可以治療自身免疫性炎癥性疾病多發(fā)性硬化癥。實(shí)施例2
伏立諾他原料50g與280g淀粉混合均勻，用淀粉漿(取淀粉220g用水制成淀粉漿)制顆粒，過(guò)篩，干燥，裝膠囊。實(shí)施例3
伏立諾他原料80g與淀粉340g混合均勻，用淀粉漿(取淀粉210g用水制成淀粉漿)制顆粒，過(guò)篩，干燥，加6%。硬脂酸鎂，混勻，壓制成片，包薄膜衣即得。實(shí)施例4
伏立諾他原料100g、淀粉400g和纖維素適量過(guò)篩，并充分混合，將適量聚乙烯吡咯烷酮溶液與上述的粉混合，過(guò)篩，制得濕顆粒于60°C干燥，將羧甲基淀粉鈉鹽，6%。硬脂酸鎂和滑石粉預(yù)先過(guò)篩，然后加入到上述的顆粒中壓片。
權(quán)利要求
1.伏立諾他在制備治療自身免疫性和神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病藥物方面的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中自身免疫性疾病指的是多發(fā)性硬化癥、自身免疫性視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)脊髓炎、橋本氏甲狀腺炎、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少癥、重癥肌無(wú)力、原發(fā)性膽汁性肝硬變、侵襲性慢性肝炎、慢性腎小球炎、肌炎、系統(tǒng)性硬化癥。
3.權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病指的是多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎。
4.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述的多發(fā)性硬化癥指的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)的疾病。
5.伏立諾他在制備治療自身免疫腦脊髓炎藥物方面的應(yīng)用；其用量為5-6g。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了伏立諾他(Vorinostat)在制備治療自身免疫性疾病藥物方面的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明伏立諾他可以降低小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的發(fā)病率、臨床評(píng)分平均分、臨床評(píng)分最高分和臨床評(píng)分總分；可以減輕脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脊髓脫髓鞘；并且可以減輕脾臟中IFN-γ分泌相關(guān)Th1細(xì)胞和IL-17A分泌相關(guān)Th17細(xì)胞占CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。因此，本發(fā)明涉及制備抑制動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎藥物，有望在臨床上成為治療多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎和急性播散性腦脊髓炎等相關(guān)疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102793693SQ20121033272
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者張榮信, 葛禛禛, 薛振毅, 張凱 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)