犬融合干擾素的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明關(guān)于一種犬融合干擾素，包含一犬干擾素以及一犬免疫球蛋白Fc片段。該犬干擾素以及該犬免疫球蛋白Fc片段進一步可由一連接子所連接。本發(fā)明并關(guān)于一種編碼該犬融合干擾素的多核苷酸以及該犬融合干擾素的用途。
【專利說明】犬融合干擾素
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明關(guān)于動物保健領域，特別是關(guān)于一種具有抗病毒活性的犬融合干擾素。
【背景技術(shù)】
[0002]干擾素最早是在1957年由英國學者Alick Isaacs和Jean Lindenmann在進行流感病毒試驗中所發(fā)現(xiàn)，當細胞遭受病毒感染后，會立即制造一種細胞激素，誘發(fā)鄰近細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，干擾病毒的復制。該細胞激素隨后被命名為干擾素(Interfeixm，IFN)。
[0003]干擾素為一種醣蛋白，主要有干擾素α、β、Y三種，可經(jīng)由不同的病原進行誘發(fā)產(chǎn)生，例如:病毒、細菌、立克次體、原蟲及雙股核苷酸等；誘發(fā)后的干擾素不會與病原直接作用，而是經(jīng)由誘導產(chǎn)生抗病毒蛋白以達到抗病毒的功能，這些抗病毒蛋白包括依賴雙股RNA 的蛋白激活酶(dsRNA-dependent protein kinase,PKR)、Mx 蛋白(Mx protein)及 2’，5’ -寡腺苷酸合成酶(2，，5，Oligoadenylate synthetase/RNase L, 0AS)等。其中 PKR 為一種蛋白質(zhì)激酶，可使eIF2磷酸化，使宿主細胞停止轉(zhuǎn)譯病毒蛋白；Mx蛋白則是一種三磷酸鳥苷酸水解酶(GTPase)，可與病毒蛋白結(jié)合而干擾病毒的復制及蛋白質(zhì)的運輸；而OAS則可將病毒的雙股RNA進行水解。另一方面，干擾素也會誘導鄰近細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白阻礙病毒感染其他細胞，并讓細胞建立抗病毒狀態(tài)，達成干擾病毒感染的效用。除了具有抗病毒作用外，干擾素還具有抗腫瘤、促進細胞分化和免疫調(diào)節(jié)等功用。
[0004]目前市面上的干擾素制劑，多為針對人類所開發(fā)設計，例如:用來治療人類B型與C型肝炎等病毒性疾病以及卡波西氏瘤(Kaposi’ s sarcoma, KS)、黑色素腫瘤(malignantmelanoma)等腫瘤疾病上的干擾素。
[0005]近年來,受到高齡化、少子化的社會趨勢所影響，寵物數(shù)量越來越多，也連帶帶動許多寵物相關(guān)行業(yè)的發(fā)展，其中最普遍的寵物-狗，也逐漸在人類工作上扮演重要角色，根據(jù)美國寵物商品制造協(xié)會(APPMA)調(diào)查顯示，美國寵物相關(guān)行業(yè)的產(chǎn)值在2009年已達520億美元，其中寵物醫(yī)療約占40% (約208億美元)，寵物藥品約占24% (約124.8億美元)，而在寵物藥品中，抗生素制劑及皮膚照護用品約占70 %，其余30 %則為疫苗及治療性藥物，其中治療性藥物種類少但是價格高，是一個極具有發(fā)展?jié)摿Φ氖袌觥１景l(fā)明即是針對犬只開發(fā)專用之干擾素作為治療性藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明于第一部分中提供一種犬融合干擾素。由于干擾素屬于小分子蛋白質(zhì)，在體內(nèi)半衰期短(約2~8小時)且不穩(wěn)定，因此本發(fā)明所提供的犬融合干擾素是將犬干擾素蛋白與半衰期較長的犬免疫球蛋白IgG Fe片段融合，而形成較穩(wěn)定的犬融合干擾素。于一較佳實施例中，該犬干擾素蛋白以及該犬免疫球蛋白IgG Fe片段是以由甘胺酸(Glycine，G)及絲胺酸(Serine, S)組成的連接子(linker)所連接起來的。于一實施例中，該犬干擾素蛋白為犬干擾素α 2,具有 如SEQ ID No:2所示之胺基酸序列；該犬免疫球蛋白IgG Fe片段具有如SEQ ID No:4所示之胺基酸序列；而該連接子具有如SEQ ID No:6所示之胺基酸序列；該犬融合干擾素具有如SEQ ID No:8所示之胺基酸序列。
[0007]本發(fā)明于第二部分中提供一種編碼上述犬融合干擾素的多核苷酸。本發(fā)明所提供之犬融合干擾素是藉由基因轉(zhuǎn)殖技術(shù)而得。首先將編碼犬干擾素蛋白的DNA序列，以及編碼犬免疫球蛋白IgG Fe片段的DNA序列選殖到表現(xiàn)載體系統(tǒng)中，形成含有編碼犬融合干擾素之DNA序列的質(zhì)體，再將該質(zhì)體轉(zhuǎn)殖到表現(xiàn)系統(tǒng)中，經(jīng)誘導蛋白質(zhì)表現(xiàn)后而得到犬融合干擾素。
[0008]于一較佳實施例中，除了將編碼犬干擾素蛋白的DNA序列以及編碼犬免疫球蛋白IgG Fe片段的DNA序列選殖到表現(xiàn)載體系統(tǒng)中，并將編碼由甘胺酸及絲胺酸組成的連接子(linker)的DNA序列選殖到該表現(xiàn)載體系統(tǒng)中，以連接該編碼犬干擾素蛋白的DNA序列以及編碼犬免疫球蛋白IgG Fe片段的DNA序列。于一實施例中，該編碼犬干擾素蛋白的DNA序列具有如SEQ ID No:1所示之序列，該編碼犬免疫球蛋白IgG Fe片段的DNA序列具有如SEQ ID No:3所示之序列，而該編碼由甘胺酸及絲胺酸組成的連接子(linker)的DNA序列具有如SEQ ID No:5所示之序列；該編碼犬融合干擾素的DNA序列具有如SEQ ID No:7所示之序列。
[0009]該表現(xiàn)載體可為原核生物表現(xiàn)載體或真核生物表現(xiàn)載體。該原核生物表現(xiàn)載體包含但不限于PET系列表現(xiàn)載體以及pGEX系列表現(xiàn)載體。該真核生物表現(xiàn)載體包含但不限于pcDNA系列表現(xiàn)載體。
[0010]該表現(xiàn)系統(tǒng)可為原核生物表現(xiàn)系統(tǒng)(如:細菌)或真核生物表現(xiàn)系統(tǒng)(如:酵母菌、昆蟲細胞、植物細胞和哺乳動物細胞等)。于一實施例中，該表現(xiàn)系統(tǒng)為大腸桿菌(Escherichia coli)。于另一實施例中，該表現(xiàn)系統(tǒng)為哺乳動物細胞?？捎糜诒景l(fā)明犬融合干擾素表現(xiàn)的哺乳動物細胞包含但不限于3T3細胞、中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamsterovary cells,CHO cells)、幼鼠腎細胞(baby hamster kidney cells,BHK cells)、人類子宮頸癌細胞(HeLa cells)，以及人類肝癌細胞0fepG2Cells)等。
[0011]本發(fā)明于第三部分中提供一種犬融合干擾素在制備犬抗病毒藥物中的用途。經(jīng)試驗證明，本發(fā)明所提供之犬融合干擾素具有誘導細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，以達到抗病毒的效果。于一實施例中，以本發(fā)明之犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)誘導狗腎臟細胞(MDCK)產(chǎn)生抗病毒蛋白，并分別以西方墨點法以及即時定量PCR(real-time RT-PCR)分析抗病毒蛋白及其基因的表現(xiàn)量，結(jié)果顯示，本發(fā)明之犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)可誘導MDCK細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白Mx蛋白，并誘導MDCK細胞增加抗病毒蛋白Mx蛋白、PKR蛋白、OAS蛋白的基因表現(xiàn)量。因此，本發(fā)明所提供之犬融合干擾素可誘導抗病毒蛋白的產(chǎn)生并用來制備犬抗病毒藥物。 [0012]術(shù)語“預防、保護、對抗”意謂，相較于未使用本發(fā)明犬融合干擾素的動物或細胞樣本，使用本發(fā)明犬融合干擾素的動物或細胞樣本，具有較高的存活率，且該樣本內(nèi)的病毒數(shù)量較低。
[0013]術(shù)語“治療”意謂，預防或部分預防疾病、癥狀、病況，及/或部分或完全治愈或緩解疾病、癥狀、病況、或因疾病所造成的不利影響。
[0014]術(shù)語“抑制”意謂，與基線相比，在質(zhì)量或數(shù)量上的減少。例如，在本發(fā)明的背景下，抑制病毒的復制，是指與基線相比，病毒復制減少。同理，抑制病毒感染，是指與基線相比，減少病毒感染。[0015]本說明書中所述之所有技術(shù)性及科學術(shù)語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同了解的意義。
[0016]本發(fā)明以下面的實施例予以示范闡明，但本發(fā)明不受下述實施例所限制。
【專利附圖】

【附圖說明】[0017]圖1:為以西方墨點法分析帶有pET24a_CIFNa 2-1gG Fe質(zhì)體的大腸桿菌所表現(xiàn)的犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe) ;M:蛋白質(zhì)分子量標準(Protein Marker);第I道:以mouse anti 6x His抗體分析；第2道:以rabbit anti canine IFN抗體分析；第3道:以rabbit anti canine IgG 抗體分析；第 4 道:以 mouse anti canine IFN 抗體分析。
[0018]圖2A:為pcDNA3載體轉(zhuǎn)染至CHO細胞后，以Zeocin抗生素篩選后以IFA分析之結(jié)果；圖2B:為帶有編碼犬融合干擾素基因(CIFNa 2-1gG Fe)的質(zhì)體轉(zhuǎn)染至CHO細胞后，以Zeocin抗生素篩選后以IFA分析之結(jié)果。
[0019]圖3:為以西方墨點法分析帶有pcDNA3_CIFNa 2-1gG Fe質(zhì)體的CHO細胞所表現(xiàn)的犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe) ;M:蛋白質(zhì)分子量標準(Protein Marker);第I道:以mouse anti canine IFN抗體分析；第 2道:以 rabbit anti canine IFN抗體分析；第 3道:以 rabbit anti canine IgG 抗體分析；第 4 道:以 mouse anti 6x His 抗體分析。
[0020]圖4:為以西方墨點法分析犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)所誘導之抗病毒蛋白；A為以rabbit anti Mx protein抗體偵測抗病毒蛋白Mx蛋白；B為α微管蛋白(a -tubulin)(內(nèi)對照組)；第I道:未處理的MDCK細胞(負對照組)；第2道:以干擾素誘導劑polyl: C處理的MDCK細胞；第3道:以犬融合干擾素(CIFN a 2-1gG Fe)處理的MDCK細胞。
[0021]圖5:為以即時定量PCR(real-time PCR)分析犬融合干擾素(CIFNa 2_IgG Fe)誘導MDCK細胞表現(xiàn)抗病毒蛋白Mx蛋白的基因表現(xiàn)量。
[0022]圖6:為以即時定量PCR(real-time PCR)分析犬融合干擾素(CIFNa 2_IgG Fe)誘導MDCK細胞表現(xiàn)抗病毒蛋白PKR蛋白的基因表現(xiàn)量。
[0023]圖7:為以即時定量PCR(real-time PCR)分析犬融合干擾素(CIFNa 2_IgG Fe)誘導MDCK細胞表現(xiàn)抗病毒蛋白OAS蛋白的基因表現(xiàn)量。
【具體實施方式】
[0024]實施例一犬干擾素a 2基因(CIFN a 2)選殖及其表現(xiàn)載體的構(gòu)筑
[0025]取4xl05 個狗腎臟細胞(Madin-Darby Canine Kidney, MDCK)接種于 6 孔細胞培養(yǎng)盤內(nèi)，培養(yǎng)24小時后轉(zhuǎn)染干擾素誘導劑-聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid, polyl:C) 2 μ g/well,接著每隔24小時收集細胞一次,并以異硫氰酸胍(guanidine thiocyanate,GTC)法萃取總RNA(total RNA)。接著將萃取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(reverse polymerase chain reaction, RT-PCR);先將 20 μ I 萃取之總RNA以70°C作用3分鐘后，取15μ I總RNA、1 μ I正向引子、I μ I反向引子以及3μ I蒸餾水及AMV反轉(zhuǎn)錄試劑(AMV RT Kit)，合計總體積為20 μ 1，混合均勻后放入PCR反應器中(Applied Biosystems GeneAmp PCRsystem 2400),反應條件為先以 42°C 30秒進行 cDNA合成，接著進行PCR反應增殖犬干擾素α2基因片段，以93°C30秒、53°C30秒、72°C I分鐘進行35個循環(huán)，最后以72°C 5分鐘完成PCR反應。其中，犬干擾素α 2基因(CIFNa 2)的特異性引子序列如下:
[0026]正向引子(CIFNa2/F1):
[0027]5’ -CGGAATTCATGGCCCTGCCCTGCTCC-3，(SEQID NO:9)
[0028]EcoRI
[0029]反向引子(CIFNa2/R1):
[0030]5J -CCG ^CTCGAG1 TTTCCTCCTCCTGAT-3J (SEQ ID NO: 10)。
[0031]XhoI
[0032]將PCR反應產(chǎn)物以洋菜膠電泳(agarose electrophoresis)分析確認產(chǎn)物片段大小，接著以核酸提取試劑盒(Gel/PCR DNA Fragments Extraction kit, Geneaid 公司，臺灣)進行PCR產(chǎn)物純化。接著以載體試劑盒(yT&A Cloning Vector Kit,Yeastern Biotech公司，臺灣)選殖RT-PCR產(chǎn)物之DNA片段，分別取8 μ I PCR產(chǎn)物、3 μ I蒸餾水、2 μ I yT&Acloning vector> 1 μ l T4 ligase buffer、I μ lT41igase,混合均勻后置于 14°C水浴槽進行接合作用(ligation) 12小時,再轉(zhuǎn)形(transformation)至宿主大腸桿菌(E.coli)中，過夜培養(yǎng)后，挑選出帶有CIFN a 2/yT&A質(zhì)體的大腸桿菌，并進行定序確認增殖的PCR產(chǎn)物序列確實為犬干擾素α 2基因(CIFNa 2)，犬干擾素a 2基因序列如SEQ ID No:1所示，其胺基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0033]接著以快速質(zhì)粒抽提試劑盒(High-Speed Plasmid Mini Kit, Geneaid公司，臺灣)自上述帶有CIFN a 2/yT&A質(zhì)體的大腸桿菌中進行CIFN a 2/yT&A質(zhì)體的萃取及純化。再將上述CIFN a 2/yT&A質(zhì)體、表現(xiàn)載體pET24a以及表現(xiàn)載體pcDNA3分別以限制酶EcoRI以及XhoI進行酶切反應，并以核酸提取試劑盒(Geneaid公司，臺灣)純化酶切后的犬干擾素基因(CIFNa 2)及表現(xiàn)載體，接著進行接合反應，將犬干擾素基因(CIFNa 2)分別選殖到pET24a載體與pcDNA3載體中形成pET24a_CIFN α 2質(zhì)體與pcDNA3_CIFN α 2質(zhì)體，并將pET24a-CIFNa 2質(zhì)體與pcDNA3-CIFNa 2質(zhì)體分別轉(zhuǎn)形至表現(xiàn)宿主大腸桿菌(E.coli)與轉(zhuǎn)染(transfection)至中國倉鼠卵巢細胞株(CH0 cells)中，選出帶有pET24a_CIFNa 2質(zhì)體的大腸桿菌及帶有pcDNA3-CIFNa 2質(zhì)體的中國倉鼠卵巢細胞株(CH0 cells)。
[0034]實施例二犬免疫球蛋白IgG Fe片段基因選殖
[0035]取新鮮狗脾臟，并以GTC法萃取總RNA。接著將萃取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR);先將20 μ I萃取之總RNA以70°C作用3分鐘后，取15 μ I總RNA、I μ I正向引子、Ιμ?反向引子以及3μ1蒸餾水及AMV反轉(zhuǎn)錄試劑(AMV RT Kit)，合計總體積為20 μ I,混合均勻后放入 PCR 反應器中(Applied Biosystems GeneAmp PCR system 2400),反應條件為先以42°C 30秒進行cDNA合成，接著進行PCR反應增殖犬免疫球蛋白IgG Fe片段基因，以93 °C 30秒、53°C 30秒、72°C I分鐘進行35個循環(huán)，最后以72 °C 5分鐘完成PCR反應。其中，犬免疫球蛋白IgG Fe片段基因(Canine IgG Fe)的特異性引子序列如下:
[0036]正向引子(CanineIgG Fc/Fl):
[0037]5，-CGGGATCCACTAAAGTAGACAAGCCAGTG-3，(SEQ ID NO:11)
[0038]BamHI
[0039]反向引子(CanineIgG Fc/Rl):
[0040]5，-CCG rCTCGAG' CGTTTACCCGGAGAATGGGAGAG-3 ’ (SEQID NO:12)。[0041]將PCR反應產(chǎn)物以洋菜膠電泳分析確認產(chǎn)物片段大小，接著以核酸提取試劑盒(Geneaid 公司，臺灣)進行 PCR 產(chǎn)物純化。接著以 yT&A Cloning Vector Kit (YeasternBiotech公司，臺灣)選殖RT-PCR產(chǎn)物之DNA片段，分別取8 μ IPCR產(chǎn)物、3 μ I蒸餾水、2 μ I yT&A cloning vector、I μ lT41igase buffer、I μ lT41igase,混合均勻后置于 14°C水浴槽進行接合作用12小時，再轉(zhuǎn)型至宿主大腸桿菌(E.coli)中，過夜培養(yǎng)后，挑選出帶有Canine IgG Fc/yT&A質(zhì)體的大腸桿菌，并進行定序確認增殖的PCR產(chǎn)物序列確實為犬免疫球蛋白IgG Fe片段基因(Canine IgG Fe)，犬免疫球蛋白IgG Fe片段基因序列如SEQ IDNo:3所示,其胺基酸序列如SEQ ID No:4所示。
[0042]實施例三犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)表現(xiàn)載體的構(gòu)筑
[0043]在本實施例中，將實施例一所得的犬干擾素a 2基因(CIFNa 2) (SEQ ID No:1)以及實施例二所得的犬免疫球蛋白IgG Fe片段基因(Canine IgG-Fc) (SEQID No:3)以甘胺酸(Glycine, G)及絲胺酸(Serine, S)組成的連接子(linker)的 DNA 序列(SEQ ID No:5)連接，以構(gòu)筑犬融合干擾素(CIFNa-1gG Fe)的DNA序列(SEQ ID No:7)。 [0044]首先，以PCR反應分別增幅犬干擾素a 2基因(CIFNa 2) (SEQ ID No:1)以及犬免疫球蛋白IgG Fe片段基因(Canine IgG-Fc) (SEQ ID No:3)，并利用PCR引子設計將甘胺酸及絲胺酸組成的連接子的DNA序列(SEQ ID No:5)分段與犬干擾素α 2基因(CIFNa 2)以及犬免疫球蛋白IgG Fe片段基因(Canine IgG-Fc) 一同進行PCR反應增幅。其中，犬干擾素α 2基因(CIFNa 2)的特異性引子序列如下:
[0045]正向引子(CIFNa2/F2):
[0046]-GG GGTACC, ATGGCCCTGCCCTGCTCC-3? (SEQ ID NO:13)
[0047]KpnI
[0048]反向引子(CIFNa2-linker/R):
[0049]5，-CGGGATCCACCTGAGCCACCTTTCCTCCTCCTGATTCT-3’ (SEQ ID NO:14)；
[0050]BamHI連接子部分序列
[0051]而犬免疫球蛋白IgG Fe片段基因的特異性引子序列如下:
[0052]正向引子(Linker-1gG/F):
[0053]5， -CGGGATCCGGTGGAGGCGGAAGCGGCGGTGGAGGATCACCCAAAAGAGAAAATGGA-3>
[0054]BamHI 連接子部分序列(SEQ ID NO: 15)
[0055]反向引子(IgG_Fc/R2):
[0056]5，-CCG CTCGAGi CGTTTACCCGGAGAATGGGAGAG-3’ (SEQ ID NO:16)。
[0057]XhoI
[0058]在PCR反應管中加入0.3ng的質(zhì)體DNA(CIFNa 2/yT&A質(zhì)體或Canine IgG Fc/yT&A質(zhì)體)、5μ1 IOx PCR 反應液、8μ IL 25mM dNTP、I μ 150 μ M5’ 端正向引子、I μ I 50 μ M3’端反向引子、33 μ I滅菌水、I μ I Taq聚合酶，混合均勻后放入PCR反應器中(AppliedBiosystems GeneAmp PCR system 2400)，反應條件為先以94°C 5分鐘將DNA變性，接著以940C 30秒、57°C 30秒、72°C 30秒進行30個循環(huán)，最后以72 °C 5分鐘完成PCR反應。
[0059]將PCR反應產(chǎn)物以洋菜膠電泳分析確認產(chǎn)物片段大小，接著以核酸提取試劑盒(Geneaid公司，臺灣)進行PCR產(chǎn)物純化。再將純化后的PCR產(chǎn)物犬干擾素α2基因(CIFNa 2)以限制酶KpnI以及BamHI進行酶切反應，將純化后的PCR產(chǎn)物犬免疫球蛋白IgG Fe片段基因(Canine IgG-Fc)以限制酶BamHI以及XhoI進行酶切反應，并將表現(xiàn)載體pcDNA3以限制酶KpnI以及XhoI進行酶切反應后，再以核酸提取試劑盒(Geneaid公司，臺灣)純化酶切后的PCR產(chǎn)物及表現(xiàn)載體，接著進行接合反應，將PCR產(chǎn)物選殖到pcDNA3載體中形成pcDNA3-CIFN a 2-1gG Fe質(zhì)體，并將pcDNA3_CIFN a 2-1gG Fe質(zhì)體轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢細胞株(CHO cells)中，選出帶有pcDNA3-CIFNa 2-1gG Fe質(zhì)體的中國倉鼠卵巢細胞株(CHO cells)，并進行定序確認增殖的PCR產(chǎn)物序列確實為本實施例犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)的DNA序列(SEQ ID No:7)，而本實施例犬融合干擾素(CIFNa 2-1gGFe)的胺基酸序列如SEQ ID No:8所示。
[0060]此外，以pcDNA3_CIFNa 2-1gG Fe質(zhì)體為PCR反應的模板，并以下列引子對本實施例犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)DNA序列進行增殖:
[0061]正向引子(CIFNa2/F1):
[0062]5，-CGGAATTCATGGCCCTGCCCTGCTCC-3，(SEQID NO:9)
[0063]EcoRI
[0064]反向引子(CIFNa2-1 gG/R):
[0065]5，-CCG CTCGAG TTTACCCGGAGAATGGG-3 ’ (SEQ ID NO:17)。
[0066]XhoI
[0067]PCR反應條件為先以94°C 5分鐘將DNA變性，接著以94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒進行30個循環(huán)，最后以72°C 5分鐘完成PCR反應。
[0068]接著將P CR反應產(chǎn)物以洋菜膠電泳分析確認產(chǎn)物片段大小，接著以核酸提取試劑盒(Geneaid公司，臺灣)進行PCR產(chǎn)物純化。再將純化后的PCR產(chǎn)物犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)與表現(xiàn)載體pET24a以限制酶EcoRI以及XhoI進行酶切反應，再以核酸提取試劑盒(Geneaid公司，臺灣)純化酶切后的PCR產(chǎn)物及表現(xiàn)載體，接著進行接合反應，將PCR產(chǎn)物選殖到pET24a載體中形成pET24a_CIFN a 2-1gG Fe質(zhì)體，并將pET24a-CIFNa 2-1gG Fe質(zhì)體轉(zhuǎn)形至表現(xiàn)宿主大腸桿菌BL21中，選出帶有pET24a-CIFN a 2-1gG Fe質(zhì)體的大腸桿菌BL21，并進行定序確認增殖的PCR產(chǎn)物序列確實為本實施例犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)的DNA序列(SEQID No:7)。
[0069實施例四犬融合干擾素(CIFNa-1gG Fe)在原核生物中的表現(xiàn)
[0070]將實施例三所得到的pET24a-CIFNa-1gG Fe質(zhì)體轉(zhuǎn)形至表現(xiàn)宿主大腸桿菌BL21。先取200 μ I勝任細胞加入5 μ I實施例三所得到的pET24a_CIFN a -1gG Fe質(zhì)體，置于冰上30分鐘后，再立即放入42°C水浴槽中I分30秒進行熱休克(heat shock)，接著放入冰水中，靜置5分鐘后，再加入800μ I LB培養(yǎng)液，37°C水浴培養(yǎng)I小時。再以室溫3000xg離心5分鐘，去除600 μ I上清液，并將下層剩余的LB及菌塊沖散，取200 μ I菌液加至含有30 μ g/ml卡那霉素(kanamycin)或50 μ g/ml氨節(jié)青霉素(ampicillin)的LB固體培養(yǎng)基上涂抹，37°C過夜培養(yǎng)后，挑選單一菌落進行培養(yǎng)及定序確認轉(zhuǎn)形無誤。
[0071]將帶有實施例三所得到的pET24a_CIFN a -1gG Fe質(zhì)體的表現(xiàn)宿主大腸桿菌BL21接種至含有30 μ g/ml卡那霉素(kanamycin)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時后,取I %體積的菌液接種至250ml含有30 μ g/ml卡那霉素(kanamycin)的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37°C下培養(yǎng)至菌液濃度達OD6tltlnm為0.6~0.8時,加入ImM異丙基-β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)誘導，分別于誘導4、6、8小時收集菌液樣本，8小時后以13000xg，4°C，離心10分鐘，去除上清液，將菌塊以12.5%或10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酸胺膠電泳分析(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)，并以西方墨點法檢測犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)蛋白表現(xiàn)的情況。
[0072]將上述SDS-PAGE分析后的膠體上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，并將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜置于封閉緩沖液(blocking buffer, 5% Skim milk溶于TBST)中，于室溫下作用I小時，以去除非特異性反應,再以 TBST(IOmM Tris-HCl pH 8.0,150mM NaCl,0.3% Tween 20)清洗三次，每次5分鐘，隨后分別加入鼠抗6xHis (mouse anti 6xHis)單株抗體(Invitrogen公司，美國)、兔抗犬干擾素(rabbit ant1-canine IFN)多株抗體、兔抗犬IgG(rabbitant1-canine IgG)多株抗體以及鼠抗犬干擾素(mouse ant1-canine IFN)多株抗體作為初級抗體偵測犬融合干擾素；加入抗體后于室溫下作用I小時后，以TBST清洗六次，每次5分鐘,再加入已標記堿性磷酸酶(AP)的山羊抗鼠(goat anti mouse)抗體(Sigma公司，美國)或是已標記堿性磷酸酶(AP)的山羊抗兔(goat anti rabbit)抗體(Sigma公司，美國)，作為次級抗體，該抗體事先以含有0.5% skin milk的TBST稀釋2000倍，于室溫下輕輕搖晃作用I小時后，以TBST清洗6次，每次5分鐘，再加AP受質(zhì)NBT/BCIP (Bio-Rad)呈色約1-2分鐘后，倒掉顯色劑以清水沖洗終止呈色反應。 [0073]西方墨點法分析結(jié)果如圖1所示，帶有犬融合干擾素基因的大腸桿菌菌塊可被鼠抗 6xHis (mouse anti 6xHis)單株抗體、兔抗犬干擾素(rabbit ant1-canine IFN)多株抗體、兔抗犬IgG(rabbit ant1-canine IgG)多株抗體以及鼠抗犬干擾素(mouseant1-canine IFN)多株抗體辨認，顯示該大腸桿菌含有犬融合干擾素，且本實施例之犬融合干擾素的蛋白質(zhì)分子量約為51KDa，與西方墨點法分析結(jié)果一致。
[0074]實施例五犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)在真核生物中的表現(xiàn)
[0075]將實施例三所得到的pcDNA3-CIFNa2_IgG Fe質(zhì)體轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢細胞株(CHO cells)。取3yg pcDNA3-CIFN a 2-1gG Fe質(zhì)體DNA加入無抗生素且無血清的VP培養(yǎng)基(Invitrogen)中震蕩 15 秒(混合液 A);另外將 6 μ g Lipofectamine 試劑(Invitrogen)加入無抗生素且無血清的VP培養(yǎng)基中(混合液B)，于室溫下作用5分鐘；接著將混合液A加入混合液B中，震蕩15秒后于室溫下作用30分鐘。再將上述混合液(A+B)均勻加入經(jīng)過隔夜培養(yǎng)的CHO細胞中，將細胞置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)作用6小時后，去除混合液并加入含有10%胎牛血清(FBS)的F12培養(yǎng)基，將細胞置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
[0076]接著，以博菜霉素(Zeocin)篩選帶有犬融合干擾素基因的CHO細胞。將經(jīng)過轉(zhuǎn)染的CHO細胞株繼代培養(yǎng)于24孔細胞培養(yǎng)盤中，以含有10% FBSU00Units/ml青鏈霉素(Penicillin)、100Units/ml 鏈霉素(Streptomycin)和 700yg/ml 博菜霉素(Zeocin)的F12培養(yǎng)基培養(yǎng)以進行篩選。接著將細胞以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次后加入0.125%胰蛋白酶(Trypsin)進行消化，待細胞圓化后，搖晃角瓶使細胞脫落，以培養(yǎng)基將細胞沖散懸浮，細胞培養(yǎng)于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱，繼代兩次后，待活著的細胞約剩一至兩成時，將細胞培養(yǎng)基替換成含有50 μ g/ml博菜霉素(Zeocin)以及10% FBS的F12培養(yǎng)基，待細胞恢復原來生長速度后，以間接免疫突光染色(Indirect Immunofluorescence Assay, IFA)法以及西方墨點法確認細胞是否帶有犬融合干擾素(CIFN-1gG Fe)基因并且表現(xiàn)該重組蛋白。
[0077]1.以間接免疫熒光染色(IFA)法檢測豬融合重組型干擾素的表現(xiàn)[0078]將轉(zhuǎn)染的CHO細胞接種在24孔細胞培養(yǎng)盤內(nèi)(2X 105cells/well)以含10% FBS的F12培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后，以PBS清洗三次后加入80%丙酮(_20°C )，并于4°C下靜置30分鐘進行細胞固定，再以PBS清洗三次后，加入以PBS稀釋5000倍的rabbitanti canineIgG抗體(300 μ I/well)，置于37°C培養(yǎng)箱中避光作用30分鐘，再以PBS清洗三次后，每孔加入300 μ I以PBS稀釋2000倍的goat anti rabbit-FITC抗體，置于37°C培養(yǎng)箱中避光作用30分鐘后，以熒光顯微鏡觀察。[0079]熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過博菜霉素(Zeocin)篩選后存活的CHO細胞帶有犬融合干擾素基因，以間接免疫熒光染色(IFA)法分析可觀察到熒光訊號(如圖2B所示)；而轉(zhuǎn)染pcDNA3-CIFNα 2載體的CHO細胞則沒有熒光訊號(如圖2Α所示)。
[0080]2.以西方墨點法檢測豬融合重組型干擾素的表現(xiàn)
[0081]西方墨點法的試驗步驟如實施例四所述,分別以鼠抗6xHis(mouse anti 6xHis)單株抗體(Invitrogen公司，美國)、兔抗犬干擾素(rabbit ant1-canine IFN)多株抗體、兔抗犬IgG(rabbit ant1-canine IgG)多株抗體以及鼠抗犬干擾素(mouseant1-canine IFN)多株抗體作為初級抗體偵測轉(zhuǎn)染的CHO細胞分泌物是否含有犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe);并以已標記堿性磷酸酶(AP)白勺山羊抗鼠(goat anti mouse)抗體(Sigma公司，美國)或是已標記堿性磷酸酶(AP)的山羊抗兔(goat anti rabbit)抗體(Sigma公司，美國)，作為次級抗體呈色；結(jié)果如圖3所示，帶有犬融合干擾素基因的CHO細胞分泌物可被鼠抗6xHi s (mouse anti 6xHis)單株抗體、兔抗犬干擾素(rabbitant1-canine IFN)多株抗體、兔抗犬IgG(rabbit ant1-canine IgG)多株抗體以及鼠抗犬干擾素(mouse ant1-canine IFN)多株抗體辨認,顯示該CHO細胞含有犬融合干擾素,且本實施例之犬融合干擾素的蛋白質(zhì)分子量約為51KDa，與西方墨點法分析結(jié)果一致。
[0082]實施例六犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)誘導細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白的活性分析
[0083]1.以犬干擾素(CIFNa 2)、犬融合干擾素(CIFNa 2_IgG Fe)及干擾素誘導劑(polyl:C)誘導狗腎臟細胞(MDCK)產(chǎn)生抗病毒蛋白
[0084]首先將狗腎臟細胞(MDCK)種于6孔細胞培養(yǎng)盤內(nèi)(4xl05細胞/孔)，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)24小時，去除上清培養(yǎng)液后，以PBS清洗三次，根據(jù)不同組別分別加入100 μ g犬干擾素a 2 (Canine IFN α 2)、100 μ g犬融合干擾素(CIFN a 2-1gG Fe)及預混好的2.5μ g polyl:C與Iipofectamine 2000混合液，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)I小時，再補0.5% DMEM培養(yǎng)液至3ml，接著置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后分別收集MDCK細胞總蛋白質(zhì)及細胞總RNA進行分析(每個處理進行3重復)。
[0085]2.狗腎臟細胞(MDCK)總蛋白質(zhì)的萃取
[0086]將上述各組MDCK細胞以PBS清洗三次，加入細胞裂解緩沖液(cell lysisbuffer, 100 μ I/孔)，并將細胞培養(yǎng)盤置于室溫下，以振蕩器(shaker)以120rpm均勻搖晃，搖晃時每隔3-5分鐘以手輕拍細胞培養(yǎng)盤使細胞脫落，收集細胞團塊及溶液，于4°C下以14000xg離心20分鐘，離心后分別取上清液(細胞質(zhì)內(nèi)蛋白)及下層細胞碎塊，分別置于-20°C備用。并以Protein Assay試劑盒(Bio-Rad公司)進行細胞質(zhì)內(nèi)總蛋白的定量。
[0087]3.狗腎臟細胞(MDCK)總RNA的萃取
[0088]以核酸提取試劑盒(NucleicAcid Extraction Kit I, FAV0RGEN公司)萃取MDCK細胞總RNA。先加入570μ IVNE buffer將細胞團塊沖散并置于室溫作用10分鐘，再加Λ 570 μ 199.9%乙醇，以振蕩器(vortex)均勻混合，接著將室溫作用完畢之液體加入VNEcolumn中，以8000xg離心I分鐘,去掉套管中的液體，加入400 μ Iffl buffer,以8000xg離心I分鐘，去除套管液體，加入600 μ I Wash buffer,以8000xg離心I分鐘,去除套管液體，再次加入600 μ I Wash buffer,以8000xg離心I分鐘，去除套管液體后再以13000xg離心3分鐘，去除套管液體，并加入50 μ IRNase free water回溶RNA,并以13000xg離心3分鐘后,將RNA置于-20°C備用。
[0089]4.以西方墨點法分析抗病毒蛋白的表現(xiàn)
[0090]西方墨點法的試驗步驟如實施例四所述；分別以0.05% TBST稀釋500倍的兔抗Mx蛋白(rabbit anti Mxl)抗體(GeneTex公司，美國)作為一級抗體，以及以標記有辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗兔(goat anti rabbit-HRP)抗體(以0.05% TBST配置)(KPL公司，美國)作為二級抗體，分別偵測以CHO細胞表現(xiàn)的犬融合干擾素(CIFN a 2-1gG Fe)及干擾素誘導劑(poly1:C)處理過的MDCK細胞內(nèi)，是否含有抗病毒蛋白Mx蛋白。
[0091]結(jié)果如圖4所示，以CHO細胞表現(xiàn)的犬融合干擾素(CIFNa2-1gG Fe)及以干擾素誘導劑(polyl:C)處理過的MDCK細胞內(nèi)皆含有Mx蛋白，且未處理組的MDCK細胞內(nèi)沒有Mx蛋白的產(chǎn)生，顯示MDCK細胞經(jīng)過本發(fā)明犬融合干擾素的處理后可以誘導抗病毒蛋白-Mx蛋白的產(chǎn)生(如圖4A所示)。
[0092]5.以即時定量PCR(real-time RT-PCR)分析抗病毒蛋白的基因表現(xiàn)量
[0093]以 QuantiFast SYBR Green RT-PCR Handbook kit (QIAGEN 公司，荷蘭)將上述所萃取之總RNA(20ng)進行real-time RT-PCR,以分析抗病毒蛋白(Mx蛋白、PKR蛋白、OAS蛋白)的基因表現(xiàn)量。先將上述萃取之總RNA稀釋至5ng/μ 1，接著依序加入12.5μ I 2χQuantiFast SYBR Green RT-`PCR Master Mix、I μ I 正向引子、I μ I 反向引子、QuantiFastRT Mix、模板RNA及RNase-free water,進行real-time RT-PCR反應；各抗病毒蛋白的特異性引子序列如下:
[0094]Mx 蛋白正向引子(Mx real-time/F):
[0095]5，-ATGAGCCATGACGAGGTTTC-3’ (SEQ ID NO:18)
[0096]Mx 蛋白反向引子(Mx real-time/R):
[0097]5，-TTCAGGAGCCAGCTGTAGGT-3，(SEQ ID NO:19)
[0098]PKR 蛋白正向引子(PKR real-time/F):
[0099]5’ -TGAGCAATGCCAGATACAGTG-3’ (SEQ ID NO:20)
[0100]PKR 蛋白反向引子(PKR real-time/R):
[0101]5’-CCATATCCACCTGAGCCAAT-3’ (SEQ ID NO:21)
[0102]OAS 蛋白正向引子(0AS real-time/F):
[0103]5’ -AGCTCGAGAAACGAGGACAG-3’ (SEQ ID NO:22)
[0104]OAS 蛋白反向引子(0AS real-time/R):
[0105]5’ -ACTTCAGGGTTGGGTCTGTG-3’ (SEQ ID NO:23)
[0106]另以管家基因(housekeeping gene)肌動蛋白(actin)的表現(xiàn)量作為對照組:
[0107]Actin 蛋白正向引子(Actin real-time/F):
[0108]5’ -GCGCAAGTACTCTGTGTGGAT-3’ (SEQ ID NO:24)
[0109]Actin 蛋白反向引子(Actin real-time/R):[0110]5，-GTCGTACTCCTGCTTGCTGAT-3，(SEQ ID NO:25)
[0111]Real-time RT-PCR 反應條件為:反轉(zhuǎn)錄反應(Reverse transcription) 50°C 10分鐘，接著進行PCR起始步驟95 °C 5分鐘，變性(Denaturation) 95 °C 10秒，黏合/延伸(annealing/extension) 60°C 30秒,共35個循環(huán)后完成反應,實驗結(jié)果則代入下列公式進行計算，并以Sigmastat軟體進行分析。公式如下:
[0112]2—A A。_ 2—“CT gene of interest-CT internal control)-(CT gene of interest-CT internal control)}
[0113]各抗病毒蛋白的real-time RT-PCR結(jié)果分別如圖5至圖7所示。
[0114]如圖5所示，分別以20ng大腸桿菌表現(xiàn)純化的犬干擾素α 2(CIFNa 2)、犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)及CHO細胞表現(xiàn)純化的犬融合干擾素(CIFNa 2-1gGFc)處理MDCK細胞24小時后，以CHO細胞表現(xiàn)純化的犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)處理組所被誘發(fā)的Mx蛋白基因表現(xiàn)量最高，為以大腸桿菌表現(xiàn)純化的犬干擾素a 2 (CIFN a 2)處理組的Mx蛋白基因表現(xiàn)量的7.9倍，且約為未處理組(負對照組)的Mx蛋白基因表現(xiàn)量的41倍(P
<0.05)。
[0115]如圖6所示，分別以20ng大腸桿菌表現(xiàn)純化的犬干擾素a 2(CIFNa 2)、犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)及CHO細胞表現(xiàn)純化的犬融合干擾素(CIFNa 2-1gGFc)處理MDCK細胞24小時后，以大腸桿菌表現(xiàn)純化的犬干擾素a2(CIFNa2)處理組被誘發(fā)的PKR蛋白基因表現(xiàn)量最高；而相較于未處理組(負對照組)的PKR蛋白基因表現(xiàn)量，以大腸桿菌表現(xiàn)純化的犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)、CH0細胞表現(xiàn)純化的犬融合干擾素(CIFNa 2_IgGFe)以及干擾素誘導劑poly1:C處理的MDCK細胞內(nèi)仍有誘導PKR蛋白的基因表現(xiàn)(p
<0.05)。
[0116]如圖7所示，分別以20ng大腸桿菌表現(xiàn)純化的犬干擾素a 2(CIFNa 2)、犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)及CHO細胞表現(xiàn)純化的犬融合干擾素(CIFNa 2-1gGFc)處理MDCK細胞24小時后，以CHO細胞表現(xiàn)純化的犬融合干擾素(CIFNa 2-1gG Fe)處理組被誘發(fā)的OAS蛋白基因表現(xiàn)量最高；而相較于未處理組(負對照組)的OAS蛋白基因表現(xiàn)量，以大腸桿菌表現(xiàn)純化的犬干擾素a 2 (CIFNa 2)、犬融合干擾素(CIFNa 2_IgG Fe)以及干擾素誘導劑poly1:C處理的MDCK細胞內(nèi)仍有誘導OAS蛋白的基因表現(xiàn)(p < 0.05)。
[0117]由上述實施例可知，本發(fā)明所提供之犬融合干擾素可以誘導犬細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白的表現(xiàn)，進而達到抗病毒的效果。
[0118]上列詳細說明針對本發(fā)明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例并非用以限制本發(fā)明之專利范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含于本案之專利范圍中。
【權(quán)利要求】
1.一種犬融合干擾素，包含一犬干擾素以及一犬免疫球蛋白Fe片段。
2.如權(quán)利要求1所述之犬融合干擾素，其特征在于，該犬干擾素以及該犬免疫球蛋白Fe片段是由一連接子所連接。
3.如權(quán)利要求1或2所述之犬融合干擾素，其特征在于，該犬干擾素具有如SEQID No:2所示之序列。
4.如權(quán)利要求1或2所述之犬融合干擾素，其特征在于，該犬免疫球蛋白Fe片段具有如SEQ ID No:4所示之序列。
5.如權(quán)利要求2所述之犬融合干擾素，其特征在于，該連接子具有如SEQID No:6所示之序列。
6.如權(quán)利要求2所述之犬融合干擾素，其特征在于，該犬融合干擾素具有如SEQIDNo:8所示之序列。
7.一種編碼如權(quán)利要求1所述之犬融合干擾素的多核苷酸。
8.如權(quán)利要求7所述之多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸具有如SEQID No:7所示之序列。
9.一種如權(quán)利要求1所述 之犬融合干擾素在制備犬抗病毒藥物中的用途。
【文檔編號】A61K47/48GK103665166SQ201210319688
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月3日
【發(fā)明者】郭村勇 申請人:福又達生物科技股份有限公司