專利名稱：重組犬α型干擾素的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組犬a(chǎn)型干擾素，是一種治療犬病毒性腹瀉、流行性感冒等病毒性 疾病的重組犬a(chǎn)型干擾素的制備方法。
背景技術：
犬病毒性疾病是當前嚴重制約犬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病。全年均有發(fā)生，如犬 細小病毒病、急性病毒性胃腸炎等。這些動物一旦感染發(fā)病，則有起病急，臨床癥狀嚴重， 極易傳播擴散，以及病死率和死亡率均較高的特點，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失；更為重 要的是，寵物犬與人類密切接觸，某些人畜共患病還給人類健康帶來潛在威脅。但傳統(tǒng)的 治療方案臨床上有時難以奏效，尤其針對病毒病辦法不多，有可能引起人類新發(fā)傳染病。 人類普遍缺乏對新發(fā)傳染病的免疫力，且對新發(fā)傳染病的早期發(fā)現(xiàn)及診斷均較為困難，最 為重要的是缺乏特異性的預防和治療方法。同時，新發(fā)傳染病的發(fā)生、發(fā)現(xiàn)具有很大的不 確定性。因此，積極預防和治療犬病毒病一直是人類最為關注的問題。干擾素(interferon, IFN)是一類具有廣語抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)。現(xiàn)已知，a型干擾 素在機體內(nèi)發(fā)揮廣諳、高效抗病毒作用機制是抑制病毒蛋白質(zhì)的合成，并有選擇性地作用 于受感染細胞，而對正常宿主細胞無作用或作用微弱。
現(xiàn)有資料表明目前國內(nèi)外生產(chǎn)犬白細胞干擾素的技術工藝條件要求較高，形成產(chǎn)品 時成本高且價格較貴，不適合我國國情。因此很難得到廣泛的應用。而釆用基因工程技術 生產(chǎn)重組犬a(chǎn)型干擾素尚未見報道，

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組犬a(chǎn)型干擾素的制備方法，是將犬a(chǎn)型干擾素基因重組 質(zhì)粒轉化大腸桿菌，使其高效表達犬a(chǎn)型干擾素，經(jīng)高度純化后除菌、分裝和凍干等工藝 制成，是一種廣譜抗病毒制劑，主治犬病毒性腹瀉、細小病毒病、呼吸道感染等疾病。
本發(fā)明技術方案如下
重組犬a(chǎn)型干擾素的制備方法，是依次進行以下步驟 (1 )、構建克隆栽體
目的基因為atggccctgc cctgctcctt ctcggtggcc ctggtgctgc tcagctgcca ctccctgtgc tgtctggctt gcgacctgcc cgacacccac agcctgcgca actggagggt cctgacgctc ctgggacaga tgaggagact ctccgccagc tcttgtgacc actacaccac tgactttgcc ttccccaagg aactgtttga tggccagcgg ctccaggagg cgcaagccct ctctgtggtc cacgtgatga cccagaaggt cttccacct;c ttctgcacga acatgtcctc tgctccttgg aacatgaccc tcctggggga attgtgctcg gggctctctg agcagctgga tgacctggat gcctgtcccc tgcaggaggc agggctggcc gagacccccc tcatgcatga agactccacc ctgaggacct acttccaaag gatctccctc tacctgcaag acaggaacca cagcccgtgt gcctgggaga tggtccgagc agaaatcggg agatccttct tctccttgac catcttgcaa gaaagagtaa ggaggaggaa atga
特異性引物上游AAT TTG CCA CCT GCC CGA CA
下游GAT CTT TCC TCC TCC TGA TTC TTT C
克隆載體pMD18-T simple vector
(2) 、構建表達栽體 表達栽體PET-28a
(3) 、重組蛋白的表達
糸沐栽體構建成功的重組表達菌進行擴增、放大培養(yǎng)，并加入誘導劑誘導表達；
(4) 、鑒定重組蛋白；
(5) 、純化重組蛋白，得到粗制品干擾素。 所述的方法，其特征在于
(1) 、構建克隆載體用特異性引物PCR擴增犬cc型干擾素的目的基因后，將目的基 因克隆于pMD18-T simple vector,轉化JM109大腸桿菌，涂LB平板進行藍白斑篩選， 取白色樣的克隆菌進行目的基因PCR驗證，同時進行雙酶切鑒定；根據(jù)實驗結果，將 PCR和雙酶切均陽性質(zhì)粒進行目的基因測序；
(2) 、構建表達栽體選擇目的基因經(jīng)測序后與Genebank—致的克隆載體進行雙酶切 后與表達栽體PET-28a進行連接，并轉化至B1-21(DH-5a)大腸桿菌，涂布于含卡那霉 素的LB平板培養(yǎng)過夜；取卡那霉素LB平板生長的菌落經(jīng)PCR鑒定目的基因，陽性克 隆菌質(zhì)粒行雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示表達栽體構建成功；
(3)、重組蛋白的表達糸沐栽體構建成功的重組表達菌于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中 少量擴增后，置舍卡那霉素的LB培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG 誘導表達。
所述的方法，其特征在于
鑒定重組蛋白將目的基因的重組質(zhì)粒PET/IFN轉化大腸桿菌BL21(DH-5ct),經(jīng)IPTG 誘導后，菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍染色顯示，與空菌相比，在33KD 左右有一條濃染的新增蛋白條帶；經(jīng)Western blotting鑒定，能與抗a型IFN參考血清 發(fā)生強陽性反應。
所述的方法，其特征在于所述的LB培養(yǎng)基中含卡那霉素100ng/ml，重組表達菌大量 擴增培養(yǎng)3h后，至細菌到達對數(shù)生長期，細菌在550 - 600nm OD值為0. 3左右，方加入 誘導劑IPTG， IPTG終濃度200 ug/ml。
所述的方法，其特征在于純化重組蛋白是指用超聲破碎重組蛋白后，用強變性劑溶解 包涵體，用復性液復性重組蛋白過夜，得到可溶性重組蛋白，AKTA explorer蛋白純化儀 親和層析精純蛋白或鹽析法粗純蛋白質(zhì)、硫氰酸鉀法精純蛋白。
純化重組蛋白的具體步驟為
(1) 、收集菌液，4X: 12000 r/min離心5min，棄上清，留沉淀，-20匸與室溫反復 凍融沉淀3次后將沉淀混勻在9倍體積PBS液中，4X:孵育5min,得到重組蛋白；超 聲裂解重組蛋白，功率400W，工作2S,間隔2S，重復7 - 8次，可作革蘭染色觀察 細菌裂解情況，12000 r/min離心10min，獲得沉淀；
(2) 、加入變性緩沖液9ml， 4'C作用2-3h,加入復性緩沖液9ml， 4€作用4h， 4°C 條件下，用PBS透析2天，期間不斷換透析液，以除去變性劑。
本發(fā)明制備的重組犬a(chǎn)型干擾素，經(jīng)分離純化后，制成凍干粉針劑，加2ml無菌雙蒸 水后，能迅速溶解為均勻懸濁液，規(guī)格為干擾素含量>2萬單位/瓶，2-8TC可長期保存， 室溫(《25t:)可保存一年半。使用時要輕輕搖勻后方可進行肌肉注射，幼禽、畜5000 ~ 10000單位/只/天；成年禽、畜20000 - 40000單位/只/天，每日注射一次， 一個療程3-5次。
本發(fā)明系釆用先進的基因工程技術制備犬a(chǎn)型干擾素，降低了干擾素生產(chǎn)的成本以及 犬白細胞生產(chǎn)用血液來源及污染等問題，經(jīng)過嚴格田間試驗和區(qū)域試驗證實，無可見不良
反應。重組犬oc型干擾素注入動物機體后，可有效治療犬病毒性腹瀉、細小病毒病等病毒
性疾病，具有療效好，安全可靠，無毒副作用和不污染環(huán)境等特點。
在治療已發(fā)病犬的同時，應及時隔離未發(fā)病犬，并給予等量相應藥物預防注射，使用
本發(fā)明制備的重組犬a(chǎn)型干擾素時，應注意環(huán)境的消毒等綜合預防措施，防治再感染或疫 病的復發(fā)。
具體實施例方式
重組犬a(chǎn)型干擾素制備工藝
1、 構建克隆栽體
犬a(chǎn)型IFN的目的基因為 atggccctgc cctgctcctt ctcggtggcc ctggtgctgc tcagctgcca ctccctgtgc tgtctggctt gcgacctgcc cgacacccac agcctgcgca actggagggt cctgacgctc ctgggacaga tgaggagact ctccgccagc tcttgtgacc actacaccac tgactttgcc ttccccaagg aactgtttga tggccagcgg ctccaggagg cgcaagccct ctctgtggtc cacgtgatga cccagaaggt cttccacctc ttctgcacga acatgtcctc tgctccttgg aacatgaccc tcctggggga attgtgctcg gggctctctg agcagctgga tgacctggat gcctgtcccc tgcaggaggc agggctggcc gagacccccc tcatgcatga agactccacc ctgaggacct acttccaaag gatctccctc tacctgcaag acaggaacca cagcccgtgt gcctgggaga tggtccgagc agaaatcggg agatccttct tctccttgac catcttgcas gaaagagtaa ggaggaggaa atg3 特異性引物上游AAT TTG CCA CCT GCC CGA CA
下游GAT CTT TCC TCC TCC TGA TTC TTT C
用特異性引物PCR擴增犬oc型干擾素的目的基因后，將目的基因克隆于pMD18-T simple vector至并轉化JM109大腸桿菌涂LB培養(yǎng)基平板進行藍白斑篩選，取白色樣的克 隆菌進行目的基因PCR驗證，同時進行雙酶切鑒定。根據(jù)實驗結果，將PCR和雙酶切均陽 性質(zhì)粒進行目的基因測序。
2、 構建表達栽體
選擇目的基因經(jīng)測序后與Genebank —致的克隆栽體進行雙酶切后與表達栽體PET-28a 進行連接，并轉化至Bl-21 (DH-5 ot)大腸桿菌，涂布于舍卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)過 夜。取卡那霉素LB平板生長的菌落經(jīng)PCR鑒定目的基因，陽性克隆菌質(zhì)粒行雙酶切鑒定， 鑒定為陽性者表示表達栽體構建成功。
3、 重組蛋白的表達
湘沐重組表達菌于LB培養(yǎng)基(含卡那霉素100ng/ml)中少量擴增，LB培養(yǎng)基(含 卡那霉素100pg/ml)中放大培養(yǎng)或發(fā)酵3h后，加入IPTG誘導表達(終濃度200 pg/ml) 7h,收集細菌。
4、 將收集的細菌12000 r/min離心1-5min,留沉淀。
5 、重組蛋白進行鑒定經(jīng)IPTG誘導后，菌體蛋白經(jīng)SDS - PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍 染色顯示。與空菌相比，在33KD左右有一條濃染的新增蛋白條帶。經(jīng)Western blotting 鑒定，能與抗oc型IFN參考血清發(fā)生強陽性反應。
6、粗制品干擾素的制備
1)、 -20X:與室溫反復凍融沉淀3次，4X:超聲裂解細菌沉淀，功率400W,工 作2S，間隔2S,重復4-8次(可作革蘭染色觀察細菌裂解情況)，離心12000 r/min， 獲得沉淀。
2 )、每克沉淀加入變性緩沖液(8mol/ml尿素、)，4t:作用2 - 3h。
3) 、每毫升尿素-蛋白溶解液加入復性緩沖液(含2mol/ml還原性谷光甘肽和 0. 2mol/ml氧化性谷光甘肽)9ml， 4X:作用過夜。
4) 、 4X:條件下，用PBS透析2天，期間不斷換透析液，以除去變性劑等。 將檢驗合格的粗制品干擾素在4t:離心，2000 - 3000 r/min離心30min,取上清液用
蔡氏濾器加壓過濾，收集無菌濾液，取樣進行無菌檢驗、效價滴定和安全檢驗。經(jīng)檢測合 格后，加入終濃度含5 %脫脂奶粉、5 % GS (葡萄糖)和10 %犬血清(或血漿)作為凍干 保護劑混勻后，置于凍干機凍干。
粗制品干擾素可依下列步驟精純
1、 AKTATM explorer蛋白純化儀親和層析精純蛋白，按常規(guī)操作。
2、 鹽析法粗純蛋白質(zhì)操作步驟
(1 )在粗制干擾素中加1/10倍體積量4X:預冷的5M硫氰酸鉀(KCNS) (1/10倍體 積量釋義疏氰酸鉀體積量為粗制干擾素的10倍，本申請中類似表述均同此解釋)，慢加 攪拌，加完后，用4t;預冷2N HCl調(diào)pH至3. 5，慢加約3ml/min， 4X:靜置8-12h, (2)4"C條件下，2000 r/min離心20min，棄去上清液，取沉淀； (3 )沉淀中加1/15倍體積量的-20t:預冷95%酒精；先加少量酒精，組織勻漿器快檔
研磨3min,再加至足量酒精，用2N HC1調(diào)至pH4. 0,
(4) 4匸下2500 r/min離心20rain，棄沉淀；
(5) 上清液用1N NaoH調(diào)至pH5. 0-5. 5,
(6) 4匸下2000 r/min離心20min,棄沉淀； (7 )上清液用0. 1N NaoH調(diào)至pH5. 6-6. 0;
(8) 4X:下2000 r/min離心20min，棄;冗;定；
(9) 上清液用1N NaoH調(diào)至pH8. 0,
(10) 4X:下2000 r/min離心 20min，棄上清液；
(11) 沉淀物中加入原1/10-1/15倍體積量pH8.0的0.1M PB(含0.5M KCNS )溶
液；
(12) 41C攪拌過夜，使之充分溶解；
(13) 4X:下2000 r/min離心20min ，棄沉淀；
(14) 上清液用2N HCl調(diào)至pH10; '
(15) 4t:下2000rpm離心20min,棄上清液；
(16) 沉淀物中加入1/100倍體積量pH8. 0的0. 1M PB溶液溶解，然后用pH7. 6 PB 溶液透析，除去CNS;
(17) 用HN(h、 0. 1N Ag跳檢測CNS，直至透析除盡為止； (18 ) 3萬r/min離心lh，棄沉淀；
(19 )測定干擾素效價及比活性，比活性> 1 x 105國際單位/mg蛋白為合格； (20)無菌分裝，-701C保存。atggccctgccctgctccttctcggtggccctggtgctgctcagctgccactccctgtgc60
tgtctggcttgcgacctgccCg3C3CCC3C3gcctgcgcaactggagggtCCtg3CgCtC120
ctgggacagatgagg3gactCtCCgCC3gCtcttgtg3CC3Ct3C3CC3Ctgactttgcc180
ttccccaaggaactgtttgatggccagcggctccaggaggCgC33gCCCtctctgtggtc240
cacgtg3tgacccagaaggtCttCC3CCtCttctgcacg3acatgtcctctgctccttgg 300aacatgsccctcctgggggaattgtgctcg gggctctctgagcagctggatgacctggat360
gcctgtcccctgcsggaggcagggctggccgagacccccctcatgcatgaagactccacc420
ctgaggacctacttccaaaggatctccctctacctgcaagacaggaaccacagcccgtgt480
gcctgggagatggtccgagcagaaatcggg agatccttcttctccttgaccatcttgcaa 540gaaagagtaaggaggaggaaatga 56權利要求
1、重組犬α型干擾素的制備方法，是依次進行以下步驟(1)、構建克隆載體目的基因為atggccctgc cctgctcctt ctcggtggcc ctggtgctgc tcagctgcca ctccctgtgctgtctggctt gcgacctgcc cgacacccac agcctgcgca actggagggt cctgacgctc ctgggacagatgaggagact ctccgccagc tcttgtgacc actacaccac tgactttgcc ttccccaagg aactgtttgatggccagcgg ctccaggagg cgcaagccct ctctgtggtc cacgtgatga cccagaaggt cttccacctcttctgcacga acatgtcctc tgctccttgg aacatgaccc tcctggggga attgtgctcg gggctctctgagcagctgga tgacctggat gcctgtcccc tgcaggaggc agggctggcc gagacccccc tcatgcatgaagactccacc ctgaggacct acttccaaag gatctccctc tacctgcaag acaggaacca cagcccgtgtgcctgggaga tggtccgagc agaaatcggg agatccttct tctccttgac catcttgcaa gaaagagtaaggaggaggaa atga特異性引物上游AAT TTG CCA CCT GCC CGA CA下游GAT CTT TCC TCC TCC TGA TTC TTT C克隆載體pMD18-T simple vector(2)、構建表達載體表達載體PET-28a(3)、重組蛋白的表達挑取載體構建成功的重組表達菌進行擴增、放大培養(yǎng)，并加入誘導劑誘導表達；(4)、鑒定重組蛋白；(5)、純化重組蛋白，得到粗制品干擾素。
2、根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于(1)、構建克隆栽體用特異性引物PCR擴增犬cc型干擾素的目的基因后，將目的基 因克隆于pMD18-T simple vector,轉化JM109大腸桿菌，涂LB平板進行藍白斑篩選， 取白色樣的克隆菌進行目的基因PCR驗證，同時進行雙酶切鑒定；根據(jù)實驗結果，將 PCR和雙酶切均陽性質(zhì)粒進行目的基因測序；(2 )、構建表達栽體選擇目的基因經(jīng)測序后與Genebank —致的克隆栽體進行雙酶切 后與表達栽體PET-28a進行連接，并轉化至Bl-21(DH-5a)大腸桿菌，涂布于含卡那霉 素的LB平板培養(yǎng)過夜；取卡那霉素LB平板生長的菌落經(jīng)PCR鑒定目的基因，陽性克 隆菌質(zhì)粒行雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示表達栽體構建成功； (3)、重組蛋白的表達糸沐載體構建成功的重組表達菌于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中少量擴增后，置含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中放大培養(yǎng)，加入異丙基疏代半乳糖苷IPTG 誘導表達。
3、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于鑒定重組蛋白將目的基因的重組質(zhì)粒PET/IFN 轉化大腸桿菌BL21 (DH-5 oc)，經(jīng)IPTG誘導后，菌體蛋白經(jīng)SDS - PAGE蛋白電泳及考馬 斯亮藍染色顯示，與空菌相比，在33KD左右有一條濃染的新增蛋白條帶；經(jīng)Western blotting鑒定，能與抗oc型IFN參考血清發(fā)生強陽性反應。
4、 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于所述的LB培養(yǎng)基中含卡那霉素100|ag/ml, 重組表達菌大量擴增培養(yǎng)3h后，至細菌到達對數(shù)生長期，細菌在550 - 600nm 0D值為 0. 3左右，方加入誘導劑IPTG, IPTG終濃度200 u g/ml。
5、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于純化重組蛋白是指用超聲破碎重組蛋白后， 用強變性劑溶解包涵體，用復性液復性重組蛋白過夜，得到可溶性重組蛋白，AKTA explorer蛋白純化儀親和層析精純蛋白或鹽析法粗純蛋白質(zhì)、^f危氰酸鉀法精純蛋白。
6、 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于純化重組蛋白的具體步驟為(1) 、收集菌液，4TC 12000 r/min離心5min，棄上清，留沉淀，-20X:與室溫反復 凍融沉淀3次后將沉淀混勻在9倍體積PBS液中，4X:孵育5min,得到重組蛋白；超 聲裂解重組蛋白，功率400W，工作2S,間隔2S,重復7-8次，可作革蘭染色觀察 細菌裂解情況，12000 r/min離心10min,獲得沉淀；(2) 、加入變性緩沖液9ml， 4t:作用2-3h,加入復性緩沖液9ml， 4"C作用4h, 4°C 條件下，用PBS透析2天，期間不斷換透析液，以除去變性劑。
7、 根據(jù)權利要求l所述的重組犬cc型干擾素的制備方法，其特征在于對粗制品干擾素 依下列步驟精純(1 )、在粗制干擾素中加1/10倍體積量41C預冷的5M硫氰酸軒，慢加攪拌，加完后， 用4。C預冷2N HCl調(diào)pH至3. 5,慢加約3ml/min, 4€靜置8-12h,(2) 、 4t:條件下，2000 r/min離心20min，棄去上清液，取沉淀；(3) 、沉淀中加1/15倍體積量的-20X:預冷95y。酒精；先加少量酒精，組織勻漿器快 檔研磨3min,再加至足量酒精，用2N HC1調(diào)至pH4. 0,(4) 、 4X:下2500 r/min離心20min，棄沉淀；(5 )、上清液用IN NaoH調(diào)至pH5. 0-5. 5, (6)、 4匸下2000 r/min離心20min，棄沉淀； (7 )、上清液用0. IN NaoH調(diào)至pH5. 6-6. 0;(8) 、 4t:下2000 r/min離心20min，棄沉淀；(9) 、上清液用1N NaoH調(diào)至pH8. 0,(10) 、 4。C下2000 r/min離心 20min，棄上清液；(11) 、沉淀物中加入原1/10-1/15倍體積量pH8.0的0.1M PB(含0.5M KCNS )溶 液；(12) 、 4X:攪拌過夜，使之充分溶解；(13) 、 4匸下2000 r/min離心20min ,棄沉淀； (14 )、上清液用2N HC1調(diào)至pH3. 0;(15)、 4'C下2000rpm離心20min,棄上清液；(16 )、沉淀物中加入1/100倍體積量pH8. 0的0. 1M PB溶液溶解，然后用pH7. 6 PB 溶液透析，除去CNS—;(17) 、用HNO,、 0.1N AgN03檢測CNS—,直至透析除盡為止；(18) 、 3萬r/min離心lh,棄沉淀；(19 )、測定干擾素效價及比活性，比活性> 1 x 105國際單位/mg蛋白為合格； (20)、無菌分裝，-70X:保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組犬α型干擾素的制備方法，系將特異性引物PCR擴增犬α型干擾素的目的基因，與表達載體PET-28a進行連接，轉化大腸桿菌，使其高效表達犬α型干擾素，經(jīng)高度純化后除菌、分裝和凍干等工藝制成重組犬α型干擾素凍干粉針劑。本發(fā)明制備工藝簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)凍干后易運送和保藏。產(chǎn)品質(zhì)量可靠。重組犬α型注射犬機體后，具有療效好、安全可靠和無毒副作用等特點。可用于治療犬細小病毒病、病毒性腹瀉等疾病，是一種廣譜抗病毒制劑。
文檔編號A61K38/21GK101100664SQ20061004123
公開日2008年1月9日 申請日期2006年7月28日 優(yōu)先權日2006年7月28日
發(fā)明者王明麗 申請人:王明麗