膽汁酸系列衍生物在抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于化合物醫(yī)藥用途發(fā)明領(lǐng)域，公開了膽汁酸系列衍生物在抑制腫瘤細(xì)胞生長中的作用。本發(fā)明篩選出膽汁酸系列衍生物中活性最高的為4｀-羥基膽酸丁酯，并在此基礎(chǔ)上通過各種檢測方法進(jìn)一步確定4｀-羥基膽酸丁酯的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。
【專利說明】膽汁酸系列衍生物在抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于化合物醫(yī)藥用途發(fā)明領(lǐng)域，具體涉及膽汁酸系列衍生物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用及其可作為藥物中間體的功能。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，腫瘤患者死亡原因大多為惡性腫瘤晚期轉(zhuǎn)移所致，如何克服腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為醫(yī)藥工作者研究開發(fā)抗腫瘤藥物的重要任務(wù)。腫瘤轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位，經(jīng)淋巴道、血管或體腔等途徑，到達(dá)其他部位繼續(xù)生長的過程。腫瘤侵襲是指惡性腫瘤離開原發(fā)生長部位，突破基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的屏障，侵犯毗鄰的正常組織，并使之發(fā)生變性和壞死。腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多步驟的復(fù)雜過程，包括以下幾步:1.腫瘤細(xì)胞從原發(fā)瘤病灶脫離；2.腫瘤細(xì)胞穿過細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)浸潤；3.遷移與血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，隨著血流到達(dá)并停留于遠(yuǎn)處位點的血管壁；4.腫瘤細(xì)胞穿出血管，通過細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，最后在特定的組織或器官形成轉(zhuǎn)移灶。
[0003]目前臨床使用抗腫瘤藥物絕大數(shù)為化療藥物，這些藥物能作用在腫瘤細(xì)胞生長繁殖的不同環(huán)節(jié)上，抑制或殺死腫瘤細(xì)胞?；熕幬镌跉[瘤細(xì)胞的同時，又殺傷正常組織的細(xì)胞，尤其是殺傷人體中生長發(fā)育旺盛的血液、淋巴組織細(xì)胞等，而這些細(xì)胞與組織是人體重要的免疫防御系統(tǒng)，破壞了人體的免疫系統(tǒng)，癌癥就可能迅速發(fā)展，造成嚴(yán)重后果。化療藥物大多缺乏選擇性，體內(nèi)分布廣泛，易引發(fā)毒副作用，導(dǎo)致患者不能耐受，降低藥物療效。因此，近年來人們一直致力于新型抗腫瘤藥物的研究，其中有效抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物是一個新的藥物開發(fā)方向。
[0004]近年來，膽汁酸因其獨特的生物和化學(xué)性質(zhì)而在生物醫(yī)藥、高分子材料及仿生等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。膽汁酸在生物體內(nèi)的作用為促進(jìn)脂類物質(zhì)的消化吸收，調(diào)節(jié)膽固醇代謝，此外，膽汁酸還可直接作為藥物或與其他藥物聯(lián)合治療肝病、膽結(jié)石以及炎癥等疾病。膽汁酸價廉易得，其衍生化合物通常仍能保留肝腸循環(huán)特性、良好生物相容性、甾環(huán)的高穩(wěn)定性、分子的兩親性等特征，故可將膽汁酸用于前藥的設(shè)計。目前的一些體內(nèi)、外實驗表明:膽汁酸衍生物有抗腫瘤活性，該活性表現(xiàn)在通過各種信號途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了充分利用膽汁酸衍生物良好的生物相容性，留環(huán)的高穩(wěn)定性等優(yōu)勢，研究及開發(fā)膽汁酸衍生物的抗腫瘤活性是本發(fā)明的研究目的。通過初步藥物篩選，在眾多膽汁酸衍生物中選擇一種抗腫瘤活性最強(qiáng)的化合物，隨后由體內(nèi)外實驗深入研究其抗腫瘤的機(jī)理、體內(nèi)作用最佳濃度范圍以及如何成為優(yōu)良的藥物中間體。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)手段包括:MTT比色法篩選抑制腫瘤細(xì)胞生長效果最佳的膽酸衍生物為4、-羥基膽酸丁酯，分別通過劃痕試驗、黏附實驗、transwell侵襲實驗測定4 ' -羥基膽酸丁酯對人乳腺癌細(xì)胞的遷移、黏附、侵襲能力有明顯抑制和削弱。為了進(jìn)一步說明4 ' -羥基膽酸丁酯對腫瘤細(xì)胞的抗轉(zhuǎn)移作用，分別從RNA水平和蛋白水平上對腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志基因進(jìn)行檢測，為4 ^ -羥基膽酸丁酯的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用提供了更加堅實的實驗證據(jù)。
[0007]本發(fā)明的有益效果:目前，膽汁酸衍生物的抗腫瘤活性集中在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而本發(fā)明將膽汁酸衍生物的抗腫瘤活性拓展到抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性，并從中確定了 4 ' -羥基膽酸丁酯的最佳活性濃度范圍。這一發(fā)明有助于開闊以膽汁酸為前藥設(shè)計的思路，也助于將4 ' -羥基膽酸丁酯這一化合物繼續(xù)開發(fā)為良好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。
【具體實施方式】:
[0008]實施例1:膽汁酸衍生物的體外抗腫瘤實驗
[0009]1.細(xì)胞株:!fepG-2(人肝癌細(xì)胞)、MCF_7(人乳腺癌細(xì)胞)、SW480(人結(jié)腸癌細(xì)胞)
[0010]2.培養(yǎng)基:低糖DMEM培養(yǎng)基
[0011]3.方法
[0012]3.1收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入lOOul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。
[0013]3.2 5% C02，37°C孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物(I μ M, 5 μ M, 25 μ M, 125 μ M, 625 μ Μ)，設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)空白組和對照組。
[0014]3.324小時后，每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入IOOul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀0D570nm處測量各孔的吸光值。
[0015]3.4利用公式:抑制率=(對照孔OD-加藥孔OD)/對照孔ODX 100%求出各衍生物的腫瘤細(xì)胞抑制率，并分別計算各衍生物的半抑制濃度IC5(I。
[0016]4.結(jié)果:篩選出半抑制濃度IC5tl最低即抗腫瘤效果最好的膽汁酸衍生物為4 羥基膽酸丁酯。
[0017]實施例2:測定4 ^ -羥基膽酸丁酯對MCF-7遷移、侵襲、黏附能力的影響
[0018]1.細(xì)胞劃痕實驗:
[0019]直觀地確定了 4 ' -羥基膽酸丁酯可以抑制貼壁生長的MCF_7(人乳腺癌細(xì)胞)的遷移能力。
[0020]2.Transwell 侵襲實驗:
[0021]在模擬細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境的前提下，測定經(jīng)4 ^ -羥基膽酸丁酯處理之后可以穿膜的MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)數(shù)量，并與空白實驗組相對比，從而確定4 ^ -羥基膽酸丁酯可以明顯降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。
[0022]3.黏附實驗:
[0023]通過測定MCF-7 (人乳腺癌細(xì)胞)經(jīng)4 ' -羥基膽酸丁酯處理后分別與HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)、膠原蛋白的黏附率，確定4 ' -羥基膽酸丁酯可以抑制腫瘤細(xì)胞的黏附能力。
[0024] 實施例3:從RNA和蛋白水平上檢測腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的標(biāo)志基因表達(dá)情況
[0025]1.半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR):
[0026]對經(jīng)4 ^ -羥基膽酸丁酯處理過的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞提取RNA并檢測各腫瘤轉(zhuǎn)移標(biāo)志基因的表達(dá)水平，從RNA水平上確定4 ' -羥基膽酸丁酯可以抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。
[0027]2.Western Blot 實驗:
[0028]對經(jīng)4 ' 平，從蛋白水平上確定了 4 '-羥基膽酸丁酯可以抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。
【權(quán)利要求】
1.膽汁酸系列衍生物(式I)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的應(yīng)用，其特征為膽汁酸系列衍生物有降低腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的作用。
3.膽汁酸系列衍生物在制備抗`肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K31/575GK103655581SQ201210317129
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年8月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月31日
【發(fā)明者】胡祥正, 張同存, 王晶, 羅學(xué)剛, 王楠, 周宏建, 宋光珍, 許衛(wèi)衛(wèi) 申請人:天津紐偉仕生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司