專利名稱：菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素基因、抗菌多肽及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學和基因工程技術領域。本發(fā)明涉及一種菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽基因及其所編碼的抗菌肽與應用，尤其涉及一種菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素(Cv-def)抗菌肽基因及其所編碼的抗菌多肽與所述基因在制備具有抗菌活性的人工合成多肽的應用。
背景技術：
由于傳統(tǒng)抗菌素的濫用和耐藥菌株的不斷產(chǎn)生，嚴重影響了感染性疾病的臨床治療效果。而抗菌肽具有殺菌強，不易引起耐藥性等優(yōu)點，成為抗菌藥物新的研究熱點。目前抗菌肽產(chǎn)量低，天然抗菌肽的分離難度大，因而傾向于利用基因工程方法獲得抗菌肽。防御素(defensin)是近年來發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于動植物體內(nèi)的一類陽離 子抗菌多肽，由29 54個氨基酸殘基組成，含有6 8個保守的半胱氨酸(通常是6個)，分子量小于5KDa。N端有3個β轉角和I個Y轉角，中間有I個兩親性的α螺旋，C端有I個反向平行的β折疊，由3 4個二硫鍵連接α螺旋和β轉角，形成特定的CS α β結構。防御素可在特定的細胞中合成并貯存于細胞質的顆粒中，或被病原微生物誘導合成，對多種微生物均具有較強的防御能力，主要作用于病原微生物的細胞膜，使病原微生物不易對其產(chǎn)生抗性，防御素是目前頗具吸引力的一類新型候選抗菌藥物。寄生蜂類群中大多數(shù)是農(nóng)林害蟲的天敵，在農(nóng)林業(yè)害蟲綜合防治中起到重要的作用。通過長期的進化，寄生蜂在寄生寄主昆蟲后能改變寄主體內(nèi)的生理環(huán)境，其幼蟲能夠在寄主內(nèi)正常生長發(fā)育，但又不至于使寄主昆蟲立刻死亡。雖然目前對寄生蜂對寄生后寄主的生理影響有所了解，但是寄生蜂對寄主調控機理的多樣性及分子機理目前尚不清楚。菜蛾盤絨繭蜂是防治小菜蛾的主要優(yōu)勢寄生性天敵，該蜂擁有目前國際上研究所揭示的幾乎所有的寄生蜂因子(多分DNA病毒、畸形細胞、毒液)，是一個經(jīng)過長期自然選擇而適應寄生小菜蛾的種類。然而，目前菜蛾盤絨繭蜂的先天免疫系統(tǒng)研究較少，且尚未有文獻報道從菜蛾盤絨繭蜂分離得到抗菌肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是，針對目前菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽研究狀況及其不足，提供一種具有抗菌活性的菜蛾盤絨繭蜂防御素抗菌肽基因、及其所編碼的抗菌多肽，及該抗菌多肽的應用。為解決技術問題，本發(fā)明的解決方案是提供一種菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素基因，該基因的核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示。本發(fā)明還提供了一種由該菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素基因編碼的抗菌多肽，該抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。進一步，本發(fā)明提供了一種人工合成的抗菌多肽，是將前述菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素基因編碼的抗菌多肽去除信號肽前體后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。該人工合成的抗菌多肽是采用固相化學法合成的。本發(fā)明還提供所述的抗菌多肽在制備用于治療革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染的食品添加劑或藥物中的應用。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明所提供的菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因及其編碼的核苷酸序列，使其能夠應用在菜蛾盤絨繭蜂中表達的新的抗菌蛋白、編碼序列及其在開發(fā)成有應用價值的食品添加劑和藥物并應用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和食品衛(wèi)生等多個領域。


圖I為本發(fā)明中轉錄組抗菌肽篩選策略。圖2為菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素Cv-def基因驗證。圖3為菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素Cv-def的質譜圖。圖4為瓊脂擴散實驗測試合成菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素Cv-def表達對枯草芽孢桿菌的抑制效果圖。其中A :氣節(jié)青霉素；C :陰性對照0· 1%醋酸溶液；I : I. 25 mg/ml樣品；2:O. 625mg/ml 樣品；3 0. 313 mg/ml 樣品；4 0. 156 mg/ml 樣品；5: O. 078mg/ml 樣品。圖5為瓊脂擴散實驗測試合成菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素Cv-def表達對金黃色葡萄球菌的抑制效果圖。其中Amp :氣節(jié)青霉素；C :陰性對照0. 1%醋酸溶液；I :1. 25 mg/ml樣品；2 :O. 625 mg/ml 樣品。圖6為瓊脂擴散實驗測試合成菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素Cv-def表達對大腸桿菌的抑制效果圖。 其中Amp :氣節(jié)青霉素；C :陰性對照0. 1%醋酸溶液；I :1. 25 mg/ml樣品；2 :O. 625 mg/ml 樣品。
具體實施方案本發(fā)明所述菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示，該序列特征長度515堿基對；類型核酸；鏈型雙鏈；拓撲結構線性；分子類型cDNA。其核苷酸序列與埃及伊蚊(Aedes aegypti)防御素抗菌肽至少有70%的同源性。本發(fā)明所述菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因編碼的抗菌多肽，其氨基酸如SEQ ID NO. 2所示。該序列特征長度78氨基酸；類型氨基酸；鏈型單鏈；拓撲結構線性；分子類型蛋白質。本發(fā)明所述菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽基因cDNA的克隆方法是以菜蛾盤絨繭蜂總RNA反轉錄得到cDNA為模板，構建cDNA文庫，構建抗菌肽數(shù)據(jù)庫，與菜蛾盤絨繭蜂轉錄組本地Blast篩選得到defensin部分cDNA序列,然后經(jīng)RACE方法擴增得到末端序列，最后經(jīng)序列拼接獲得菜蛾盤絨苗蜂抗菌肽defensin基因cDNA全長序列。本發(fā)明提供的一種合成抗菌肽，是根據(jù)天然抗菌肽序列結構基礎上設計合成的，其制備方法可以是固相化學法。本序列來源為SEQ ID NO. 2去除信號肽前體，具體的序列如 SEQ ID NO. 3 所示。作為本發(fā)明菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素Cv-def的改進包括菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽Cv-def為多肽，其保守性變異多肽、其活性片段或活性衍生物。利用瓊脂擴散法檢測多肽的抗菌活性，氨芐青霉素為對照，進行抗菌活性檢測。結果表明本發(fā)明合成抗菌肽具有抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌活性。因此本發(fā)明提供了所述抗菌多肽在制備用于治療革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染的食品添加劑或藥物中的應用。本發(fā)明通過基于高通量轉錄組測序方法，以菜蛾盤絨繭蜂為實驗材料，通過基因注釋和與已有抗菌肽序列進行比對，篩選其體內(nèi)表達的抗菌肽核苷酸序列片段，并通過RACE方法得到抗菌肽cDNA核苷酸序列全長。得到全長抗菌肽cDNA核苷酸序列后，根據(jù)其編碼的氨基酸序列，利用固相化學快速合成多肽，并應用于抗菌檢測。
在本發(fā)明中菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因或多肽指具有該菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素Cv-def活性的SEQ ID NO. 3序列多肽。該術語還包括具有與天然該菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素Cv-def相同功能的SEQ ID NO. 3序列的變異形式。這些變異形式包括若干個氨基酸的缺失、插入或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。在本發(fā)明中菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因保守性變異多肽指■ 與SEQID NO. 3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳8個，更佳地至多5個氨基酸性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。本發(fā)明還包括菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因或多肽的類似物。這些類似物與天然抗菌多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。其中修飾形式包括在不改變一級結構的情況下，體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；⒘u基化或糖基化。下面結合實驗室具體的實驗數(shù)據(jù)和結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實施例中未注明具體條件的實驗方案，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York: Cold SpringHaebor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。實施案例I :菜蛾盤絨繭蜂轉錄組數(shù)據(jù)篩選首先從各網(wǎng)站(APD: http://www. bicnirrh. res. in/antimicrobial/ ; CAMP:http://aps.unmc.edu/AP/main.php ;NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov)收集盡量已知所有的抗菌肽序列建立抗菌肽數(shù)據(jù)庫，然后與菜蛾盤絨繭蜂轉錄組測序數(shù)據(jù)進行本地BlastX，得到與已知抗菌肽序列相似或同源的部分抗菌肽序列。然后利用RACE技術，得到該片段的全長，經(jīng)過測序驗證后，提交NCBI進行序列比對，并根據(jù)該序列6個半胱氨酸排列特征，推測該序列屬于昆蟲防御素家族。整個數(shù)據(jù)篩選策略如圖I所示。實施案例2:菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素(Cv-def) cDNA克隆
I. I、TRIzol 法提取總 RNA(I)將一定量(5只左右菜蛾盤絨繭蜂)冰凍lmin，放入I. 5ml離心管中，加入ImlTRIzol試劑，充分研磨勻漿，室溫靜置5min。(2)向離心管中加入0.2ml氯仿，振蕩15s，混合液轉入TIANGEN離心管中，靜置2min。(3)4°C，12000g離心15min，取上清液，將其轉入一新1.5ml的離心管中。(4)向離心管中加入O. 5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置lOmin。(5) 4°C, 12000g 離心 IOmin,棄掉上清液。
(6)向離心管中加入Iml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4°C，7500g離心5min，棄掉上清液。(此時加入無水乙醇，可于_80°C超低溫冰箱中長期保存)(7)晾干離心管，加入適量的DEPC H2O溶解(65°C促溶)，分光光度計測量0D260/0D280的值，比值在I. 8^2. O之間時，進行下一步實驗。1.2、cDNA 第一鏈合成(I)往O. 5ml無菌的離心管中分別加入I μ I提取的RNA，I μ I SMART IV /5’ PCR正向引物，1μ I CDS 111/3’PCR反向引物，加2μ I DEPC H2O使總體積達到5 μ I。(2)混勻離心管中的試劑并短暫離心，72°C孵育2min。(3)迅速將離心管冰浴2min，短暫離心。(4)往離心管中分別加入 2 μ I 5XFrist-strand Buffer, I μ I 20mM 二硫蘇糖醇(DTT), I μ I IOmM dNTP, I μ I Reverse Transcriptase 反轉錄酶，反復吹打混勻，短暫離心。(5)42。(孵育111。(6)將離心管置于冰上疒3min，終止反應。取一部分用于進一步實驗，其余于-80°C超低溫冰箱冷凍保存。1.3、dsDNA 合成(I)往O. 5離心管中分別加入1μ I第一鏈合成反應產(chǎn)物，5μ I IOXLA Buffer(Mg2+free) ,5μ I Mg2+, 8 μ I dNTP, I μ I SMART IV/5’PCR 正向引物，I μ ICDS III/3，PCR 反向引物，0. 5μ1 LA Tag DNA聚合酶，29. 5 μ I ddH20，充分混勻，短暫離心。(2)PCR 儀中按以下擴增程序(95°C，20s ;25 28X (95。。，5s ;68°C，6min))擴增。(3)取5μ I PCR產(chǎn)物用于凝膠檢測(檢測條帶所含分子量范圍及條帶亮暗)，取檢測結果良好的I μ I產(chǎn)物稀釋100倍用于做以后PCR的模板，其余于-80°c超低溫冰箱冷凍保存。1.4、PCR擴增菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素(Cv-def)基因5’和3’末端操作按Clontech 公司試劑盒 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 說明書進行。根據(jù)試劑盒的要求，依據(jù)已知的Defensin基因EST序列分別設計兩條上、下游引物，以進行巢式PCR。所用引物分別為第一次PCR 反應條件為98°C，3min ;30X ( 98°C，IOs ;60°C，20s ;68°C，lmin);68°C，6min。第二次PCR以第一次PCR產(chǎn)物為模板進行擴增，反應條件為95°C，3min ；35X(95。。，25s ；63°C，20s ；72°C, lmin) ；72°C, 6min。將擴增產(chǎn)物連接到 pMD-19 載體上得到重組質粒，并用PMD-19的通用引物M13土進行序列測定，測定結果與已知序列片段進行比較和序列拼接。序列拼接結果在NCBI上進行BlastX，結果表明得到序列與埃及伊蚊抗菌肽defensin基因相似度為70%。實施例3 :菜蛾盤絨苗蜂抗菌多肽防御素(Cv-def)多肽合成、抑菌功能測定3. I菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素Cv-def多肽合成和純化(由上海生工生物工程股份有限公司完成)a.儀器新加坡玻璃儀器廠BZ24/29 D=2. 5CM北京創(chuàng)新通恒LC 3000制備型液相色譜儀；島津公司的LC IOAvp高效液相色譜儀Waters公司的ZQ-2000質譜儀b.多肽合成流程
肽鏈合成采用標準Fmoc化學作用的固相法合成。具體合成由下列幾個循環(huán)組成I.去保護Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑(piperidine)去除氨基的保護基團。2.激活和交聯(lián)下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化?；罨膯误w與游離的氨基反應交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環(huán)這兩步反應反復循環(huán)直到合成完成。3.洗脫和脫保護多肽從柱上洗脫下來，其保護基團被一種脫保護劑(TFA)洗脫和脫保護。大致的步驟為先用浸泡樹脂，再將氨基酸接在樹脂上，按照序列中特定的順序一直接到最好一個氨基酸，經(jīng)過縮合-脫保護-縮合-脫保護-縮合-脫保護。最后將多肽從樹脂上裂解下來，得到粗肽。采用高效液相色譜(HPLC)進一步的精制、分離與純化合成肽鏈，收集到目標肽后進行質譜鑒定。3. 2合成肽抗菌活性的測定本發(fā)明涉及供試菌株有革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、昆蟲病原真菌和酵母。其中革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);革蘭氏陰性菌為腸道沙門氏菌(Salmonella enteritidis)和大腸桿菌(Escherichia coli );昆蟲病原真菌為球抱白僵菌(Beuaveria bassiana)、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae);植物病原真菌灰霉菌(Botrytis cinerea);酵母為畢赤酵母(pichia pastoris)。實驗前，將2. 5mg合成肽固體溶于2ml 0.01%的乙酸溶液中配成I. 25 mg/ml的樣品母液，并分裝保存于_80°C。按瓊脂平板擴散抑制試驗進行本抗菌試驗，具體步驟為供試菌株在培養(yǎng)基(細菌培養(yǎng)基為MH培養(yǎng)基，真菌和酵母培養(yǎng)基分別為改良馬丁和YDP培養(yǎng)基)中生長到0D600為0. 8后，加入至預融并降溫至40°C左右的相應固體培養(yǎng)基，混勻，倒板等其冷卻后，將三層濾紙片(新華I號定性濾紙，打孔器打成6mm的小紙片，滅菌烘干備用)放置于培養(yǎng)基上，然后滴加10 μ I合成肽溶液與濾紙片上，用卡那霉素做陽性對照，0.01%的乙酸溶液為陰性對照，正面向上吸收完全后倒置培養(yǎng)過夜。觀察抑菌圈，測其大小。菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素Cv-def抗菌活性結果如圖所示，菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素Cv-def具有抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌活性，對真菌和酵母無抗性。3.3體外溶血活性測定本實施案例用于檢測合成的多肽的對于哺乳動物紅細胞是否具有溶血活性，其測定方法如下
取新鮮提取的小鼠血液，4。(^下1500 rpm離心10 min,棄血清,將血細胞用預冷的O. 15 M，pH 7.2的PBS緩沖液潤洗3次(3000 rpm)，最后用PBS將血細胞的濃度調整為 0.5%。取 75 μ I 血細胞懸液加 75 μ I 不同濃度(L 25、0· 625、0· 313、0· 156、0· 078mg/ml)的合成肽溶液于96孔板中。37°C水浴中孵育I小時，4000 rpm離心10 min后取60 μ I上清液檢測紫外分光光度(波長414 nm)。設陰性和陽性對照(0%和100%溶血)，陰性對照為加入PBS緩沖液的血細胞懸浮液，陽性對照為加入O. 1% Triton X-100的血細胞懸浮液；用下列公式計算溶血性溶血作用=(抗菌肽光密度值-陰性對照光密度值)/(O. l%Triton X-100光密度值-陰性對照光密度值)X 100。取三次實驗的平均值為最終實驗結果，檢測結果見下表I。表I合成肽的溶血活性
權利要求
1.一種菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQID NO. I 所示。
2.權利要求I所述菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素基因編碼的抗菌多肽，其特征在于，該抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—種人工合成的抗菌多肽，其特征在于，是將權利要求2中所述菜蛾盤絨繭蜂抗菌多肽防御素基因編碼的抗菌多肽去除信號肽前體后得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.根據(jù)權利要求3所述的抗菌多肽，其特征在于，該人工合成的抗菌多肽是采用固相化學法合成的。
5.權利要求3或4所述的抗菌多肽在制備用于治療革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染的食品添加劑或藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術領域，旨在提供一種菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素基因、抗菌多肽及應用。該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，該基因編碼的抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；將該抗菌多肽去除信號肽前體后還得到的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的抗菌多肽。本發(fā)明還提供了抗菌多肽合成方法及在制備用于治療革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染的食品添加劑或藥物中的應用。本發(fā)明所提供的菜蛾盤絨繭蜂抗菌肽防御素(Cv-def)基因及其編碼的核苷酸序列，使其能夠應用在菜蛾盤絨繭蜂中表達的新的抗菌蛋白、編碼序列及其在開發(fā)成有應用價值的食品添加劑和藥物并應用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和食品衛(wèi)生等多個領域。
文檔編號A61P31/04GK102816770SQ20121031502
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權日2012年8月30日
發(fā)明者陳學新, 王知知, 時敏, 趙偉 申請人:浙江大學