專利名稱：用于體內(nèi)遞送多核苷酸的多綴合物的制作方法
用于體內(nèi)遞送多核苷酸的多綴合物本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年8月17日、發(fā)明名稱為“用于體內(nèi)遞送多核苷酸的多綴合物”的中國(guó)專利申請(qǐng)200780029802. 3 (國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2007/076202)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2006年8月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/822，833和2007年5月3日提及的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/915，868的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
多核苷酸和其他膜不透性化合物向活細(xì)胞的遞送受到細(xì)胞的復(fù)雜的膜系統(tǒng)的高度限制。用于反義和基因治療的藥物是相對(duì)較大的親水聚合物并且通常也是帶大量負(fù)電荷的。這兩種物理特征阻礙了它們經(jīng)細(xì)胞膜的直接擴(kuò)散。為此原因，多核苷酸遞送的主要障 礙是多核苷酸向細(xì)胞內(nèi)部的遞送。已經(jīng)開發(fā)了多種轉(zhuǎn)染試劑在體外將多核苷酸遞送到細(xì)胞。然而，在體外有效的轉(zhuǎn)染試劑的毒性、血清相互作用和弱的尋靶作用使得多核苷酸的體內(nèi)遞送復(fù)雜化。在體外良好運(yùn)行的轉(zhuǎn)染試劑、陽(yáng)離子聚合物和脂類通常去穩(wěn)定化細(xì)胞膜并形成大的顆粒。轉(zhuǎn)染試劑的陽(yáng)離子電荷促進(jìn)了核酸結(jié)合以及細(xì)胞結(jié)合。膜的去穩(wěn)定化促進(jìn)了膜不透性多核苷酸經(jīng)細(xì)胞膜的遞送。這些性質(zhì)使得轉(zhuǎn)染試劑在體內(nèi)無(wú)效或有毒性。陽(yáng)離子電荷導(dǎo)致與血清組分的相互作用，其引起多核苷酸-轉(zhuǎn)染試劑相互作用的去穩(wěn)定化和弱的生物利用度和尋靶作用。陽(yáng)離子電荷也可以導(dǎo)致體內(nèi)毒性。在體外有效的轉(zhuǎn)染試劑的膜活性通常導(dǎo)致體內(nèi)毒性。對(duì)于體內(nèi)遞送，轉(zhuǎn)染復(fù)合體(與待遞送的核酸結(jié)合的轉(zhuǎn)染試劑)應(yīng)該是小的，直徑小于IOOnm,并且優(yōu)選小于50nm。甚至小于20nm或小于IOnm的更小的復(fù)合體將是更有效的。大于IOOnm的轉(zhuǎn)染復(fù)合體在體內(nèi)基本上不能接近除了血管細(xì)胞之外的細(xì)胞。體外復(fù)合體也是帶正電荷的。該正電荷對(duì)于復(fù)合體與細(xì)胞的附著和膜融合、去穩(wěn)定化或破壞是必須的。體內(nèi)轉(zhuǎn)染復(fù)合體上的陽(yáng)離子電荷導(dǎo)致不利的血清相互作用并且因此導(dǎo)致弱的生物利用度。接近中性或負(fù)電荷的復(fù)合體將具有更好的體內(nèi)分布和尋靶能力。然而，體外轉(zhuǎn)染復(fù)合體通過(guò)電荷-電荷(靜電)相互作用與核酸結(jié)合。帶負(fù)電荷的聚合物和脂類不與帶負(fù)電荷的核酸相互作用。此外，這些靜電復(fù)合體當(dāng)暴露于生理鹽濃度或血清組分時(shí)傾向于聚集或瓦解。最后，在體外有效的轉(zhuǎn)染復(fù)合體通常在體內(nèi)是有毒的。用于轉(zhuǎn)染的聚合物和脂類破壞或去穩(wěn)定化細(xì)胞膜。用核酸遞送平衡該活性在體外比在體內(nèi)更容易達(dá)到。盡管一些研究小組已經(jīng)在改善體內(nèi)基因向細(xì)胞的遞送方面取得了不斷的進(jìn)步，但是仍然需要將多核苷酸與遞送劑一起有效遞送到靶細(xì)胞而沒(méi)有與體內(nèi)施用轉(zhuǎn)染試劑相關(guān)的毒性的制劑。本發(fā)明使用生物學(xué)不穩(wěn)定的綴合物遞送系統(tǒng)提供了將多核苷酸遞送到細(xì)胞并釋放的組合物和方法。發(fā)明概述在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了用于在體內(nèi)將多核苷酸遞送到細(xì)胞的組合物，其包含與多核苷酸可逆地綴合的可逆掩蔽的膜活性聚合物。聚合物通過(guò)一個(gè)或多個(gè)第一種可逆共價(jià)連接連接到一種或多種掩蔽劑并且通過(guò)一個(gè)或多個(gè)第二種可逆共價(jià)連接進(jìn)一步連接到一種或多種多核苷酸。第一種和第二種可逆共價(jià)連接可以包含在相同或相似的條件下被切割的可逆鍵或者它們可以在不同的條件下被切割，即它們可以包含正交(orthogonal)可逆鍵。對(duì)哺乳動(dòng)物施用可藥用載體或稀釋劑中的多核苷酸-聚合物綴合物。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，公開了膜活性聚合物，其包含聚乙烯醚隨機(jī)共聚物。可以從兩種、三種或多種不同的單體合成聚乙烯醚共聚物。單體可以選自受保護(hù)的氨基乙烯醚，如含有苯二甲酰亞氨基的乙烯醚、丁基乙烯醚、十二烷基乙烯醚、十八烷基乙烯醚。優(yōu)選的聚乙烯醚隨機(jī)共聚物包含三種單體含有胺的單體、丁基乙烯醚和十八烷基乙烯醚。在優(yōu)選實(shí)施方案中，膜活性聚合物的一種或多種生物物理學(xué)特征通過(guò)掩蔽劑可逆地屏蔽或修飾。掩蔽劑可以選自位阻穩(wěn)定劑、尋祀基團(tuán)(targeting groups)和電荷修飾齊U。掩蔽劑可以通過(guò)抑制聚合物與血清組分或非靶細(xì)胞的非特異性相互作用而改善聚合物-多核苷酸的生物分布或?qū)ぐ凶饔?。掩蔽劑也可以減少聚合物或聚合物-多核苷酸綴合物的聚集。含有尋靶基團(tuán)的掩蔽劑可以通過(guò)將綴合物系統(tǒng)靶向細(xì)胞表面受體而增強(qiáng)細(xì)胞特異性尋靶作用或細(xì)胞內(nèi)化。在聚合物綴合到多核苷酸之前或之后，可以將掩蔽劑綴合到膜活性聚合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用所述的綴合物系統(tǒng)可以被遞送到細(xì)胞的多核苷酸可以選自DNA、RNA、封閉性多核苷酸、反義寡核苷酸、質(zhì)粒、表達(dá)載體、寡核苷酸、siRNA、微RNA、mRNA、shRNA 和核酶。在優(yōu)選實(shí)施方案中，掩蔽劑和多核苷酸通過(guò)可逆連接共價(jià)連接到膜活性聚合物。盡管聚合物的掩蔽和多核苷酸與聚合物的連接是重要的，但是這些連接可以干擾聚合物的轉(zhuǎn)染活性或多核苷酸的活性。通過(guò)經(jīng)由可逆連接將掩蔽劑和多核苷酸連接到聚合物，所述可逆連接在合適的時(shí)間被切割，聚合物恢復(fù)活性并且多核苷酸被釋放?？赡娴墓矁r(jià)連接含有可逆的或不穩(wěn)定的鍵，其可以選自生理學(xué)不穩(wěn)定的鍵、細(xì)胞生理學(xué)不穩(wěn)定的鍵、pH不穩(wěn)定鍵、非常pH不穩(wěn)定鍵、極端pH不穩(wěn)定鍵、酶可切割的鍵和二硫鍵。將聚合物連接到多核苷酸和掩蔽劑的兩種可逆連接的存在提供了多核苷酸與遞送聚合物的共同遞送和掩蔽劑對(duì)遞送聚合物的選擇性尋靶作用和失活。連接的可逆性提供了多核苷酸從膜活性聚合物的釋放和膜活性聚合物的選擇性活化。在優(yōu)選實(shí)施方案中，我們描述了一種組合物，其包含遞送聚合物，其a)通過(guò)一種或多種可逆連接共價(jià)連接到一種或多種尋靶基團(tuán)、位阻穩(wěn)定劑或電荷修飾劑；和b)通過(guò)一種或多種可逆連接共價(jià)連接到一種或多種多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，尋靶作用劑、位阻穩(wěn)定劑或電荷修飾劑的可逆共價(jià)連接與多核苷酸可逆共價(jià)連接是正交的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，我們描述了聚合物綴合系統(tǒng)，其用于將多核苷酸遞送到細(xì)胞并將該多核苷酸釋放到細(xì)胞中，所述聚合物綴合系統(tǒng)包含可逆地綴合到膜活性聚合物的多核苷酸，所述膜活性聚合物自身可逆地綴合到掩蔽劑。綴合鍵可以是相同的或者它們可以是不同的。此外，綴合鍵可以在相同或不同條件下被切割。在優(yōu)選實(shí)施方案中，我們描述了聚合物綴合系統(tǒng)，其用于將膜不透性分子遞送到細(xì)胞并在細(xì)胞中釋放分子。聚合物綴合系統(tǒng)包含可逆地連接到膜活性聚合物的膜不透性分子，其中多種掩蔽劑通過(guò)可逆的共價(jià)鍵連接到膜活性聚合物。膜活性聚合物當(dāng)在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)可以是無(wú)毒的或者可以不是被靶定的。掩蔽劑的可逆連接可逆地抑制或改變了聚合物的膜相互作用、血清相互作用、細(xì)胞相互作用、毒性或電荷。優(yōu)選的可逆共價(jià)鍵包含不穩(wěn)定鍵、生理學(xué)不穩(wěn)定鍵或在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)條件下可被切割的鍵。優(yōu)選的不穩(wěn)定鍵包含pH不穩(wěn)定鍵。優(yōu)選的PH不穩(wěn)定鍵包含馬來(lái)酰胺酸鍵。另一優(yōu)選的不穩(wěn)定鍵包含二硫鍵。膜不透性分子包括但不限于多核苷酸、蛋白質(zhì)、抗體和膜不透性藥物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在過(guò)量聚合物存在下將多核苷酸連接到聚合物。過(guò)量聚合物可以有助于多核苷酸-聚合物綴合物的配制。過(guò)量聚合物可以在綴合物配制期間減少綴合物的聚集。可以在將綴合物施用于細(xì)胞或生物前將多核苷酸-聚合物綴合物與過(guò)量聚合物分離。備選地，多核苷酸-聚合物綴合物可以與過(guò)量聚合物共同施用于細(xì)胞或生物。過(guò)量聚合物可以與所述聚合物是相同的或者它可以是不同的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的聚合物綴合物可以用于體外遞送多核苷酸或其他膜不透性分子。對(duì)于體外遞送，聚合物的可逆掩蔽增強(qiáng)了一些否則無(wú)效的多胺如聚賴氨酸的轉(zhuǎn)染活性?？赡嫜诒我部梢酝ㄟ^(guò)減小其他膜活性聚合物的毒性或?qū)⑺鼈兊哪て茐男蕴卣飨拗朴趦?nèi)體而增強(qiáng)所述其他膜活性聚合物的效用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，我們描述了用于在體內(nèi)將多核苷酸遞送到細(xì)胞的系統(tǒng)，其包含將尋靶基團(tuán)共價(jià)連接到多核苷酸，將第二種尋靶基團(tuán)共價(jià)連接到膜活性聚合物，并將多核苷酸和膜活性聚合物注射到生物中。當(dāng)結(jié)合附圖考慮時(shí)，本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)根據(jù)下面的詳細(xì)描述將是顯而易見(jiàn)的。附圖簡(jiǎn)述圖I.聚乙烯醚聚合物聚合的反應(yīng)方案。圖2.闡明本發(fā)明的掩蔽劑的幾種實(shí)施方案的附圖。圖3.簡(jiǎn)圖，圖解了多核苷酸-聚合物可逆綴合物和通過(guò)馬來(lái)酰胺酸對(duì)綴合物的可逆掩蔽。圖4.顯微照片，顯示了用A) CDM-PEG (左)或B) CDM-PEG加CDM-Pip-LBA掩蔽的PBAVE聚合物的肝臟肝細(xì)胞的定向遞送。圖5.顯微照片，顯示了在體內(nèi)掩蔽的多核苷酸-聚合物綴合物向肝細(xì)胞的遞送。圖6.曲線圖，圖解了 ppara siRNA的多綴合物介導(dǎo)的遞送后體內(nèi)靶基因降低(knockdown)。圖7.顯微照片，顯示了 用(A)DNA-DWl360-CDM-PEG/NAG，(B)DNA+DW1360-CDM-PEG/NAG(未綴合到聚合物的多核苷酸)，(C)DNA-DWl360-CDM-PEG/ 葡萄糖，和(D) DNA-DWl360-CDM-PEG/甘露糖在體內(nèi)將ds DNA向肝臟的遞送。Cy3_標(biāo)記的DNA =每個(gè)小圖中的左上象限，AIEXA -488鬼筆環(huán)肽染色的肌動(dòng)蛋白=右上象限，細(xì)胞核=左下象限，復(fù)合圖=右下象限。圖8.圖和印跡，圖解了靜脈內(nèi)注射siRNA多綴合物后小鼠的肝臟中靶基因表達(dá)的降低。(A)用apoB siRNA多綴合物處理后肝臟中apoBmRNA水平的降低。(B)apoB siRNA多綴合物處理的小鼠中apoB-100蛋白的血清水平。(C)靜脈內(nèi)注射ppara siRNA多綴合物后肝臟中ppara mRNA水平的降低。 圖9.圖表，圖解了 apoB-lsiRNA多綴合物劑量反應(yīng)。(A)注射apoB-lsiRNA多綴合物的連續(xù)稀釋液后apoB mRNA的降低。(B)注射不同量的siRNA后apoB mRNA的降低。


圖10.圖表，圖解了 apoB-lsiRNA多綴合物處理的小鼠中膽固醇水平。圖11.顯微照片，顯示了(A)ApoB siRNA或(B)GL3陰性對(duì)照siRNA，或(C)僅鹽水的多綴合物遞送后小鼠肝臟中的脂類積累。圖12.圖表，圖解了在第O天在小鼠 中施用apoB-lsiRNA綴合物后第2_15天，基因表達(dá)的抑制(A)和引起的血清膽固醇的降低(B)。圖13.顯微照片，顯示了通過(guò)施用可逆地綴合到DW1360并用CDM-PEG和CDM-NAG掩蔽的抗體，體內(nèi)遞送抗體到肝細(xì)胞。左上象限顯示了經(jīng)標(biāo)記的抗體，右上象限顯示了肌動(dòng)蛋白，左下象限顯示了細(xì)胞核，右下象限顯示了復(fù)合圖。圖14.圖表，其圖解了在用商業(yè)體外轉(zhuǎn)染試劑或用不同量的ApoBsiRNA多綴合物遞送的ApoB siRNA轉(zhuǎn)染的原代肝細(xì)胞中的基因降低。圖15.圖表，圖解了在體外siRNA-綴合物對(duì)H印a_lclc7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染僅僅綴合物=掩蔽的 siRNA-PLL。圖16.圖表，圖解了 PBAVE存在下DPH的熒光。圖17.圖表，圖解了 A)在Shodex SB-803柱上PEG標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫圖，B) ShodexSB-803柱的校準(zhǔn)圖，和OPBAVE聚合物的分子量計(jì)算。圖18.圖表，圖解了 A)Cy3標(biāo)記的核酸標(biāo)準(zhǔn)品和掩蔽的多核苷酸-聚合物綴合物的洗脫圖，B) Sephacryl S-500大小排阻層析的校準(zhǔn)圖，和C)掩蔽的多核苷酸-聚合物綴合物的分子量計(jì)算。圖19.顯微照片，顯示了使用寡核苷酸-聚合物-CDM/PEG/NAG綴合物(A，C)或寡核苷酸-聚合物-CDM/PEG/葡萄糖綴合物(B，D)，體內(nèi)多核苷酸遞送到小鼠半乳糖受體陽(yáng)性腫瘤(A-B)或半乳糖受體陰性腫瘤(C-D)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及可用于將多核苷酸或其他細(xì)胞不透性分子遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的化合物、組合物和方法。本文描述了用于在體內(nèi)將多核苷酸或其他膜不透性分子遞送到細(xì)胞的多綴合物(polyconjugate)系統(tǒng)。多綴合物系統(tǒng)將尋靶、抗調(diào)理作用、抗聚集和轉(zhuǎn)染活性摻入到小的50納米以下的遞送載體。該系統(tǒng)的關(guān)鍵組分是連接組分部分的鍵的可逆性。所述的體內(nèi)多核苷酸遞送綴合物的第一個(gè)組分包含該多核苷酸與膜活性聚合物的生理學(xué)上可逆的共價(jià)連接。多核苷酸與膜活性聚合物的共價(jià)連接確保了在血清存在下體內(nèi)或離體(ex vivo)施用時(shí)，多核苷酸不容易與聚合物解離，從而提供了多核苷酸與膜活性聚合物向靶細(xì)胞的共同遞送。然而，多核苷酸與聚合物的共價(jià)連接可以使得多核苷酸無(wú)活性。因此，通過(guò)生理學(xué)上可逆的連接或者鍵完成多核苷酸與膜活性聚合物的連接或鍵。通過(guò)使用生理學(xué)可逆的連接，多核苷酸可以從聚合物被切除，釋放多核苷酸參與和細(xì)胞組分的功能性相互作用。通過(guò)選擇合適的可逆連接，可能形成綴合物，其僅在其被遞送到希望的位置，如細(xì)胞質(zhì)后釋放所述多核苷酸。所述的體內(nèi)多核苷酸遞送綴合物的第二種組分包含膜活性聚合物的可逆修飾。膜活性聚合物的可逆修飾減小了非生產(chǎn)性血清和非靶細(xì)胞相互作用并且減小了毒性。掩蔽劑也可以為綴合物增加希望的功能，如增強(qiáng)靶細(xì)胞相互作用或增強(qiáng)綴合物的胞吞作用。通過(guò)掩蔽劑與聚合物經(jīng)由生理學(xué)可逆的共價(jià)連接進(jìn)行共價(jià)連接掩蔽聚合物。掩蔽劑可以是無(wú)菌的穩(wěn)定劑、尋靶基團(tuán)或電荷修飾劑。掩蔽劑可以掩蔽聚合物防止非特異性相互作用，延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間，增強(qiáng)特異性相互作用，抑制毒性，或改變聚合物的電荷。這些修飾的每一種可以改變聚合物的膜活性，使得經(jīng)修飾的聚合物不能促進(jìn)多核苷酸的遞送。因此，通過(guò)生理學(xué)可逆的連接完成掩蔽劑與膜活性聚合物的連接。通過(guò)使用生理學(xué)可逆的連接，掩蔽劑可以從聚合物被切除，從而暴露聚合物并恢復(fù)被暴露的聚合物的活性。通過(guò)選擇合適的可逆連接，可能形成綴合物，其在已經(jīng)被遞送或靶向希望的細(xì)胞類型或細(xì)胞位置后恢復(fù)膜活性聚合物的活性。本發(fā)明包括如下一般結(jié)構(gòu)的綴合物遞送系統(tǒng)N-L1-P- (L2-M)y,其中N是多核苷酸或其他細(xì)胞不透性分子，L1是可逆連接，P是聚合物，L2是第二 種可逆連接，M是掩蔽劑。掩蔽劑M掩蔽或修飾P的性質(zhì)或相互作用。y是大于O的整數(shù)。優(yōu)選的聚合物是膜活性聚合物。另一優(yōu)選的聚合物是轉(zhuǎn)染聚合物。許多掩蔽劑可以連接到單個(gè)聚合物。所述許多掩蔽劑可以通過(guò)多個(gè)可逆連接連接到所述聚合物。當(dāng)可逆連接L2切割時(shí)，聚合物P恢復(fù)被掩蔽的性質(zhì)或相互作用。掩蔽劑M可以為聚合物P增加活性，如細(xì)胞受體結(jié)合。L1的可逆鍵可以與L2的可逆鍵是相同或不同的(正交的)。選擇可逆連接L1或L2的可逆鍵使得在希望的生理?xiàng)l件下，如存在于希望的組織、器官和亞細(xì)胞位置中的生理?xiàng)l件下或應(yīng)答藥學(xué)上可接受的外源試劑的加入下發(fā)生切割。多核苷酸N和掩蔽劑M可以在沿著聚合物P的長(zhǎng)度的任何位置處連接到聚合物P。聚合物聚合物是通過(guò)稱作單體的較小單位重復(fù)鍵合形成的分子。聚合物可以是線性的、分枝網(wǎng)絡(luò)狀的、星形的、雞冠狀或梯形的。聚合物的主鏈由原子組成，所述原子的鍵是聚合物長(zhǎng)度增長(zhǎng)所需的。例如，在聚-L-賴氨酸中，羰基碳、α-碳和α-胺基是聚合物長(zhǎng)度所需的并且因此是主鏈原子。聚合物的側(cè)鏈由這樣的原子組成，所述原子的鍵不是聚合物長(zhǎng)度的增長(zhǎng)所需的。聚合物可以是均聚物，其中使用一種單體或者聚合物可以是共聚物，其中使用兩種或多種不同的單體。共聚物可以是交替的、隨機(jī)的(統(tǒng)計(jì)學(xué)的)、嵌段或接枝的(雞冠狀)。交替聚合物含有確定的重復(fù)順序的單體，如-[Α-Β]η_。交替聚合物的單體通常不均聚化，而是一起反應(yīng)產(chǎn)生交替共聚物。隨機(jī)共聚物中的單體沿著任何給定鏈沒(méi)有確定順序或排列，如-AnBm_。此類聚合物的一般組成反映了輸入單體的比例。然而，一種單體與另一種單體的精確比例可以在鏈之間不同。單體的分布可以沿著單一聚合物的長(zhǎng)度不同。而且，單體的化學(xué)性質(zhì)可以影響其摻入隨機(jī)共聚物中的速率和它在聚合物內(nèi)的分布。從而，盡管隨機(jī)聚合物中單體的比例取決于單體的輸入比例，但是輸入比例可以不精確地匹配摻入的單體的比例。嵌段聚合物具有一種聚合物(聚合物A)的一段或嵌段接著是第二種聚合物(聚合物B)的一段或嵌段即-聚A-聚B-。結(jié)果是不同的聚合物鏈以從頭至尾的構(gòu)型連接。從而，嵌段聚合物是不同單體成分的嵌段的線性排列。通常(盡管不是必需的)，聚合物嵌段是均聚物，聚合物A由不同于聚合物B的單體組成。二嵌段共聚物是聚A-聚B，三嵌段共聚物是聚A-聚B-聚A。如果A是親水基團(tuán)并且B是疏水基團(tuán)，那么所得的嵌段共聚物可以被認(rèn)為是聚合的表面活性劑。接枝聚合物是一種類型的嵌段共聚物，其中一個(gè)單體的鏈被接枝到另一單體的側(cè)鏈上，如(其中n、m、X、y和ζ是整數(shù)):
權(quán)利要求
1.用于將RNA干擾多核苷酸體內(nèi)遞送到肝細(xì)胞的綴合物遞送系統(tǒng)，其包含 其中， P是膜活性多胺， L2是二取代的馬來(lái)酰胺酸生理學(xué)不穩(wěn)定的鍵， M1是含有靶向基團(tuán)的掩蔽劑， M2是含有位阻穩(wěn)定劑的掩蔽劑， N是RNA干擾多核苷酸， L1是與L2正交的生理學(xué)不穩(wěn)定的共價(jià)鍵， y和ζ是大于或等于O的整數(shù),其中y和ζ的值一起大于P的胺數(shù)目的50%, P的膜活性通過(guò)經(jīng)生理學(xué)不穩(wěn)定的鍵L2連接M1和M2修飾大于50%的P胺而被可逆抑制，并且L2的切割恢復(fù)P的膜活性。
2.權(quán)利要求I的綴合物，其中所述多核苷酸包含siRNA或者微RNA。
3.權(quán)利要求I的綴合物，其中所述多胺大于5kDa。
4.權(quán)利要求I的綴合物,其中所述綴合物直徑小于20nM。
5.權(quán)利要求I的綴合物，其中所述綴合物在pH9下具有O到-20mV的ζ電位。
6.權(quán)利要求I的綴合物，其中L2是馬來(lái)酰胺酸。
7.權(quán)利要求6的綴合物，其中靶向基團(tuán)是半乳糖衍生物。
8.權(quán)利要求7的綴合物，其中P-L2-M1具有結(jié)構(gòu) 其中η是I到500的整數(shù)。
9.權(quán)利要求6的綴合物，其中所述位阻穩(wěn)定劑是聚乙二醇。
10.權(quán)利要求9的綴合物，其中P-L2-M1具有結(jié)構(gòu)其中η是I到500的整數(shù)。
11.權(quán)利要求I的綴合物，其中所述膜活性聚合物含有兩種或更多種不同的單體。
12.權(quán)利要求11的綴合物，其中所述膜活性聚合物含有三種或更多種不同的單體。
13.權(quán)利要求12的綴合物，其中所述單體選自含有胺的單體、低級(jí)烷基單體、丁基單體、高級(jí)烷基單體、十二烷基單體和十八烷基單體。
14.權(quán)利要求I的綴合物，其中y+z的值大于或等于所述多胺上胺數(shù)目的70%。
15.權(quán)利要求I的綴合物遞送系統(tǒng)，其中所述綴合物遞送系統(tǒng)還包含通過(guò)生理學(xué)不穩(wěn)定鍵可逆地共價(jià)連接到多種掩蔽劑的過(guò)量膜活性多胺，其中所述過(guò)量聚合物不共價(jià)連接到所述RNA干擾多核苷酸。
16.權(quán)利要求I的綴合物遞送系統(tǒng)，其中所述綴合物在可藥用載體或稀釋劑中提供。
17.用于將RNA干擾多核苷酸體內(nèi)遞送到肝細(xì)胞的綴合物遞送系統(tǒng)，其通過(guò)包含如下步驟的方法形成 a)形成膜活性多胺； b)形成第一種掩蔽劑，其包含含有尋靶基團(tuán)的二取代的馬來(lái)酐； c)形成第二種掩蔽劑，其包含含有位阻穩(wěn)定劑的二取代的馬來(lái)酐； d)通過(guò)與馬來(lái)酰胺酸鍵正交的生理學(xué)不穩(wěn)定的共價(jià)鍵將所述RNA干擾多核苷酸連接到所述多胺； e)可逆地抑制膜活性多胺的膜活性，其中抑制由通過(guò)將所述多胺與所述第一種和第二種掩蔽劑反應(yīng)修飾所述多胺上50%或以上的胺組成。
18.權(quán)利要求17的綴合物遞送系統(tǒng)，其中所述尋靶基團(tuán)是半乳糖衍生物并且所述位阻穩(wěn)定劑是聚乙二醇。
19.權(quán)利要求18的綴合物遞送系統(tǒng)，其中所述半乳糖衍生物是N-乙酰半乳糖胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于向哺乳動(dòng)物細(xì)胞遞送多核苷酸或其他細(xì)胞不透性分子的化合物、組合物和方法。描述了多綴合物系統(tǒng)，其向小的生物相容的體內(nèi)遞送載體中摻入尋靶、抗調(diào)理作用、抗聚集和轉(zhuǎn)染活性。連接組分部分的多個(gè)可逆連接的使用提供了生理學(xué)應(yīng)答活性調(diào)節(jié)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102614528SQ20121011107
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2007年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日
發(fā)明者A·布洛欣, D·B·羅森瑪, D·H·韋克菲爾德, D·L·劉易斯, H·赫維耶, J·A·沃爾夫, J·E·哈格斯特倫, J·克萊因, S·翁, V·特魯別茨科伊 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司