專利名稱：一種載gdnf微泡制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種載⑶NF微泡制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcell line derived neurotrophic factor,GDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中最具代表性的成員之一，最初在大鼠的B49神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞株中被發(fā)現(xiàn)，是分子量為24kDa的大分子蛋白。GDNF廣泛存在于發(fā)育的中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及成熟的腦組織，高水平表達(dá)于在紋狀體、丘腦、皮質(zhì)及海馬，對多種神經(jīng)元如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、5_羥色胺能神經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元都具有促進(jìn)生長、保護(hù)和修復(fù)功能，而且也可以調(diào)節(jié)
去甲腎上腺素能和Y-氨基丁酸能途徑。⑶NF對于帕金森病及阿爾茨海默病等神經(jīng)變性疾病的作用已經(jīng)得到了公認(rèn)，近期的臨床及動物實驗表明GDNF在抗抑郁癥治療中起著重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)GDNF與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，如抑郁癥、藥物依賴、阿爾茲海默病
坐寸ο然而，由于⑶NF分子量較大(24kDa),難以透過血腦屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)，其治療效果受到了嚴(yán)重限制。因此，如何促進(jìn)⑶NF透過BBB、增加⑶NF在中樞神系統(tǒng)內(nèi)的有效藥物濃度，將是應(yīng)用GDNF治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個關(guān)鍵科學(xué)問題。BBB是指腦毛細(xì)血管阻止某些物質(zhì)(多是有害的)進(jìn)入腦循環(huán)血的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可使腦組織少受甚至不受循環(huán)血液中有害物質(zhì)的損害，從而保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)起著重要作用。近年研究結(jié)果提示，血腦屏障是ー個復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，其主要由內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接、星形細(xì)胞、周皮細(xì)胞和血管周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞以及基膜等結(jié)構(gòu)構(gòu)成并維持了血腦屏障的特殊功能，保持了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。BBB在有效阻擋血液中有害物質(zhì)對腦的侵襲、保障其功能正常發(fā)揮的同吋，也阻擋了 98%以上小分子藥物和100%的大分子藥物，研究表明，只有高脂溶性的、低分子量(200-400Da)的小分子量物質(zhì)才能通過BBB，這種限制阻擋了絕大多數(shù)治療性藥物的進(jìn)入，使得腦惡性腫瘤、帕金森氏病、阿爾茲海默病、多發(fā)性硬化、中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷等許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病難以藥物治療，因此如何治療性地開放BBB，是近年來研究的熱點。開放血腦屏障的傳統(tǒng)方法較多，但均未能取得滿意效果。如通過動脈內(nèi)注入高滲溶液(如甘露醇)引起內(nèi)皮細(xì)胞皺縮，導(dǎo)致廣泛血腦屏障數(shù)小時的緊密連接開放；溶劑如高劑量的酒精或者ニ甲基亞砜(DMSO)烷基化物如左旋苯丙氨酸氮芥、免疫輔助劑和細(xì)胞活素也被用于開放BBB。滲透和化學(xué)方法都要求施行導(dǎo)管插管術(shù)，這種直接注射是侵入性的并且需要開放顱骨，容易引起非靶區(qū)腦組織的滲透性増加，甚至可能引起腦組織破壞、出血、感染；并且高滲溶液及化學(xué)試劑容易彌散，造成所注入動脈及分支所支配的BBB全部開放，因而缺乏選擇性，限制了其在臨床的應(yīng)用。大量研究顯示,超聲波能在一定條件下開放血組織屏障。Taniyama等在離體試驗中成功實現(xiàn)DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入鼠頸動脈組織，體外證實了超聲輻照能増加生物膜的通透性。隨后Mesiwala等于2002年選用高功率聚焦超聲研究證實，在一定超聲強(qiáng)度下選擇性開放BBB，并不引發(fā)明顯的腦組織損傷。為降低超聲能量，研究者發(fā)現(xiàn)用聚焦超聲協(xié)同外源性的空化核(微泡)實現(xiàn)了在未引發(fā)急性神經(jīng)元損傷的情況下短暫開放免BBB，進(jìn)而認(rèn)為聚焦超聲能實現(xiàn)高選擇性、非侵入性地開放BBB ;而在微泡存在的情況下，開放BBB所需的超聲能量明顯降低，這有利于實現(xiàn)用更低能量的超聲達(dá)到選擇性開放BBB而不損傷正常腦組織的目的?；诰劢钩暵?lián)合微泡有效無創(chuàng)地開放BBB，有學(xué)者在此基礎(chǔ)上注入微泡optison后，用低頻超聲多點照射開窗的腦組織，采用多種手段(光鏡、電鏡及MRI)，均觀察到BBB的開放。實驗證實超聲聯(lián)合微泡能局部、可逆和無創(chuàng)的開放BBB，為臨床應(yīng)用有效治療顱內(nèi)疾病的藥物提供了非常積極的應(yīng)用價值。在進(jìn)行超聲聯(lián)合微泡開放BBB的可行性研究的同時，研究者并沒有忽視安全性的評價。不同的研究小組都證實超聲協(xié)同微泡開放血腦屏障存在安全域值，只是由于不同研究者使用的超聲參數(shù)、輻照時間、微泡濃度、觀察方法等不盡相同，因而得出的結(jié)論不盡一致。研究者發(fā)現(xiàn)采用發(fā)射頻率I. 5MHz、脈沖重復(fù)頻率1Hz、瞬時峰值聲壓幅度2 12. 7MPa超聲輻照兔腦20s，MRI增強(qiáng)顯像及組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，當(dāng)聲壓達(dá)6. 3MPa時出現(xiàn)腦組織的損傷，表現(xiàn)為血管壁破壞、出血、偶見壞死。另ー研究小組采用發(fā)射頻率I. 63MHz、脈沖重復(fù)頻率1Hz、聲壓幅度O. 7 I. OMPa的脈沖超聲輻照兔腦20s，輻照后對整個腦組織進(jìn)行組織病 理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)在超聲照射區(qū)僅見少數(shù)細(xì)胞凋亡；而且在超聲輻照4周后無論進(jìn)行增強(qiáng)MRI檢查還是組織病理學(xué)檢查都沒有發(fā)現(xiàn)BBB損傷。以上多項研究中的結(jié)論均一致表明，現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)可以實時顯示正常的BBB的完整性和被疾病損害的區(qū)域性BBB。同時，多種方法打開BBB的影像學(xué)研究未觀測到腦組織受損。隨著聚焦超聲聯(lián)合微泡造影開放BBB研究的深入，有不少學(xué)者利用超聲開放BBB，采取靶向釋放的方式，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。研究者用聚焦超聲開放血腦屏障轉(zhuǎn)運靶向多巴胺受體的抗體進(jìn)入腦組織，結(jié)果顯示在超聲開放BBB后，所轉(zhuǎn)運入腦的抗體能識別腦細(xì)胞膜上的多巴胺受體?？傊曒d藥微泡的深入研究應(yīng)用超聲聯(lián)合微泡開放BBB的同時，微泡攜帶藥物或基因可靶向治療顱內(nèi)疾病，為顱內(nèi)疾病的治療提供了新的策略。但目前，關(guān)于核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)引導(dǎo)聚焦超聲聯(lián)合載藥微泡開放BBB，傳遞GDNF治療各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究尚未報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種載⑶NF微泡及其制備方法。本發(fā)明所提供的載⑶NF微泡，由內(nèi)部包裹生物惰性氣體的脂質(zhì)雙分子層和連接于所述脂質(zhì)雙分子層外側(cè)的生物素化的GDNF組成。其中，所述脂質(zhì)雙分子層具體可由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成ニ硬脂酰磷脂酸膽堿4. 9-5. I份、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000 O. 9-1. 2份、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000-生物素O. 9-1. 2份；所述脂質(zhì)雙分子層與生物素化的⑶NF通過生物素-抗生物素蛋白-生物素連接。所述載⑶NF微泡的平均粒徑為2-3 μ m。所述載⑶NF微泡的載藥量為46. 54% -46. 62%。所述生物惰性氣體可為六氟化硫或者全氟丙烷。制備所述載⑶NF微泡的方法，包括下述步驟
I)將ニ硬脂酰磷脂酸膽堿4. 9-5. I份、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇20000. 9-1. 2份、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000-生物素O. 9-1. 2份溶解于三氯甲烷中混勻，在干燥的N2流作用下除去三氯甲烷，使磷脂在容器壁上形成一層均勻的薄膜，真空干燥2小時以上；2)在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入脫氣的pH值為7. 4的Tris緩沖溶液，得到磷脂溶液，其中，所述Tris緩沖溶液中含體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油和體積分?jǐn)?shù)為10%的丙ニ醇； 3)加熱所述磷脂溶液到其相轉(zhuǎn)變溫度以上，并用水浴超聲使磷脂溶液徹底分散直至透明，然后分裝入西林瓶中，并將瓶中的空氣置換成生物惰性氣體，震蕩，得到微泡；4)離心漂浮法清洗微泡3-4次，除去未形成微泡的磷脂；在清洗后的微泡中加入抗生物素蛋白，室溫下孵育15分鐘以上，用PBS溶液離心漂浮法清洗3-4次，除去未耦合的抗生物素蛋白；然后在耦合抗生物素蛋白的微泡中加入生物素化的⑶NF，室溫下孵育10分鐘以上，之后用漂浮法清洗3-4次除去未結(jié)合的生物素化GDNF，得到載GDNF微泡。其中，所述步驟2)中所述磷脂溶液的濃度為2. 8-3. lmg/ml。步驟4)中所述微泡、抗生物素蛋白、生物素化的⑶NF的配比為(0.85-1.1)ml (O. 08-0. 12)mg (O. 9-1.2)mg。本發(fā)明的再ー個目的是提供ー種載⑶NF微泡的給藥套裝。本發(fā)明所提供的載GDNF微泡的給藥套裝，包括本發(fā)明的載GDNF微泡和低頻聚焦超聲設(shè)備；其中，所述載GDNF微泡的給藥量設(shè)定為O. 5ml，所述低頻聚焦超聲設(shè)備的參數(shù)設(shè)置如下探頭頻率1MHz，超聲照射時間60s，聲壓O. 8MPa，延遲時間60s。本發(fā)明采用MRI實時引導(dǎo)聚焦超聲聯(lián)合載有GDNF微泡開放BBB輻照大鼠顱腦頂葉皮層區(qū)，促進(jìn)GDNF透過血腦屏障，増加中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)GDNF的有效藥物濃度。通過低頻聚焦超聲聯(lián)合靶向微泡技術(shù)，進(jìn)行有效大分子突破BBB后的藥理學(xué)研究，將進(jìn)ー步增加神經(jīng)營養(yǎng)因子在治療腦疾病方面的優(yōu)勢，提供GDNF治療中樞神經(jīng)疾病的科學(xué)依據(jù)。


圖I為自制微泡與聲諾維在不同時間的粒徑分析。圖2為聚焦超聲聯(lián)合不同微泡開放血腦屏障腦的腦組織大體觀(左圖)和切面觀(右圖)。圖3為聚焦超聲聯(lián)合不同微泡開放血腦屏障腦腦組織中EB的含量。圖4為聚焦超聲聯(lián)合不同微泡開放血腦屏障腦組織HE染色。圖5為正交試驗各組超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障腦組織中的EB含量。圖6為正交試驗各組超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障腦組織切片HE染色(400X)。圖7為正交試驗各組超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障腦組織切片TUNEL染色(400X)。圖8為正交試驗各組聚焦超聲誘導(dǎo)血腦屏障細(xì)胞凋亡的作用。圖9為正交試驗各組腦組織內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。圖10為聚焦超聲誘導(dǎo)血腦屏障破壞后超聲組織中BSA濃度。圖11為聚焦超聲誘導(dǎo)血腦屏障破壞后超聲組織中的⑶NF濃度。圖12為⑶NF誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞的分化。A微泡組；B，⑶NF靶向微泡組；C :⑶NF蛋白組。圖13為MRI引導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障及EB顯示的血腦屏障開放區(qū)域。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說 明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例I、制備載⑶NF微泡造影剤及其開放血腦屏障的研究I)制備載⑶NF微泡按ー定比例將一定量的DSPC (ニ硬脂酰磷脂酸膽堿，10. 64mg)，DSPE_PEG2k (聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺，2. IOmg)、DSPE-PEG2k-Biotin (聚こニ醇-ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-生物素，2. 26mg)溶解于O. 5ml三氯甲烷中在渦旋混合器上混勻。在干燥的N2流作用下除去三氯甲烷使磷脂在試管壁上形成一層均勻的薄膜，真空烘箱中干燥2小時以上。然后在含有干燥磷脂薄膜的試管中加入5ml脫氣的pH7. 4的Tris緩沖溶液含有甘油(10%體積分?jǐn)?shù))和丙ニ醇(10%體積分?jǐn)?shù))得到一定濃度的磷脂溶液。加熱磷脂溶液到其相轉(zhuǎn)變溫度(55-60°C)以上，并用水浴超聲震蕩器使牛奶狀的磷脂溶液徹底分散直至透明，然后分成每毫升裝入一 2ml的西林瓶中，將瓶中的空氣置換成六氟化硫或者全氟丙烷，然后進(jìn)行用鋁塑蓋和橡膠塞封ロ后4°C存儲備用。使用時，用機(jī)械震蕩法(震蕩45s)制備出微泡之后，用PBS溶液離心漂浮法清洗3-4次，除去未形成微泡的磷脂。在Iml的微泡中加入O. Img抗生物素蛋白(avidin)，輕輕搖動室溫下孵育20分鐘，繼續(xù)用PBS溶液離心漂浮法清洗3-4次，除去未耦合的抗生物素蛋白avidin,然后在得到的微泡中混入Img生物素化的⑶NF(PeproTech公司，450-51),輕輕搖動并室溫下孵育15分鐘，之后用漂浮法清洗3-4次除去未結(jié)合的生物素化GDNF，得到⑶NF靶向性的微泡。對制備的載⑶NF微泡的性能檢測顆粒計數(shù)儀(Accusizer 780/A,美國)對載⑶NF微泡的粒徑進(jìn)行檢測其粒徑分布為O. 5-8 μ m,平均粒徑為2. 3 μ m。載⑶NF微泡中的載藥量和包封率分別為46. 58%和81. 52%。將自制的空白微泡與聲諾維在聚焦超聲(探頭頻率1MHz，微泡量1ml，照射時間60s，聲壓O. 8MPa)作用下開放血腦屏障(BBB)的效果進(jìn)行比較，結(jié)果見圖1_4。圖I為自制微泡與聲諾維(Brocco公司，H20080059)不同時間粒徑分析儀檢測圖，其中A :自制微泡Oh組；B :自制微泡24h ；C :聲諾維Oh組；D :聲諾維24h組。圖2為聚焦超聲聯(lián)合不同微泡開放血腦屏障腦組織大體觀和切面觀，其中A :自制微泡Oh組；B :自制微泡24h ；C :聲諾維Oh組；D :聲諾維24h組。圖3為各組腦組織中EB含量，其中A 自制微泡Oh組；B :自制微泡24h ；C :聲諾維Oh組；D :聲諾維24h組。圖4為聚焦超聲聯(lián)合不同微泡開放血腦屏障腦組織HE染色，其中A :自制微泡Oh組:聲諾維Oh組。
結(jié)果顯示，自制微泡和聲諾維在BBB的開放中沒有顯著性差異，并且自制微泡開放BBB的效果更加穩(wěn)定。
實施例2、確定MRI引導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合祀向微泡局部開放BBB的最佳參數(shù)以超聲照射時間、微泡劑量、延遲時間(微泡注射時間與聲震時間間隔)、超聲頻率、聲壓為影響因素，每個因素選擇三個水平，采用正交實驗設(shè)計(見表I)，以伊文思藍(lán)(EB, Evens blue, Sigma公司，E2129)滲出量作為血腦屏障通過率的指標(biāo)(EB滲出量)，確定MRI引導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合靶向微泡局部開放BBB，增加中樞GDNF水平的最佳參數(shù)。試驗方法通透性的測定采用EB的滲出量定量估計。取PBS灌流后的大鼠腦組織，將局部藍(lán)染的腦組織濕重按10ml/g浸入甲酰胺溶液，在60°C恒溫水浴箱中抽提24h，甲酰胺溶液呈現(xiàn)深淺不同的藍(lán)色，腦組織呈現(xiàn)無色透明狀，然后在UV300紫外-可見光分光光度計下620nm波長處定量EB在甲酰胺中的OD值，定量分析樣本腦組織中EB的含量。純甲酰胺溶液設(shè)為空白對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算EB含量(μ g/g)。結(jié)果見表I。表IMRI引導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合靶向微泡局部開放BBB的最佳參數(shù)的因素和水平
參數(shù) I 2 3 超聲照射時間(min) 0.5 I 1.5 微泡量(ml) 0.2 0.5 1.0 延遲時間(S) 15 60 120 頻率(MHz) 0.8 1.0 1.2 -聲壓(MPa) _0.6_0.8 _1.1 _表2MRI引導(dǎo)的低頻聚焦超聲聯(lián)合靶向微泡局部開放BBB的最佳參數(shù)的正交設(shè)計及各組EB滲出量
權(quán)利要求
1.一種載⑶NF微泡，由內(nèi)部包裹生物惰性氣體的脂質(zhì)雙分子層和連接于所述脂質(zhì)雙分子層外側(cè)的生物素化的⑶NF組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的載GDNF微泡，其特征在于所述脂質(zhì)雙分子層由下述質(zhì)量份的物質(zhì)組成二硬脂酰磷脂酸膽堿4. 9-5. I份、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000O.9-1. 2份、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素O. 9-1. 2份；所述脂質(zhì)雙分子層與生物素化的⑶NF通過生物素-抗生物素蛋白-生物素連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的載GDNF微泡，其特征在于所述載GDNF微泡的平均粒徑為2-3 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的載GDNF微泡，其特征在于所述生物惰性氣體為六氟化硫或者全氟丙烷。
5.制備權(quán)利要求2-4中任一項所述載GDNF微泡的方法，包括下述步驟 1)將二硬脂酰磷脂酸膽堿4.9-5.I份、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇20000. 9-1. 2份、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-生物素O. 9-1. 2份溶解于三氯甲烷中混勻，在干燥的N2流作用下除去三氯甲烷，使磷脂在容器壁上形成一層均勻的薄膜，真空干燥2小時以上； 2)在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入脫氣的pH值為7.4的Tris緩沖溶液，得到磷脂溶液，其中，所述Tris緩沖溶液中含體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油和體積分?jǐn)?shù)為10%的丙二醇； 3)加熱所述磷脂溶液到其相轉(zhuǎn)變溫度以上，并用水浴超聲使磷脂溶液徹底分散直至透明，然后分裝入西林瓶中，并將瓶中的空氣置換成生物惰性氣體，震蕩，得到微泡； 4)離心漂浮法清洗微泡3-4次，除去未形成微泡的磷脂；在清洗后的微泡中加入抗生物素蛋白，室溫下孵育20分鐘，用PBS溶液離心漂浮法清洗3-4次，除去未耦合的抗生物素蛋白；然后在耦合抗生物素蛋白的微泡中加入生物素化的GDNF，室溫下孵育15分鐘，之后用漂浮法清洗3-4次除去未結(jié)合的生物素化GDNF，得到載GDNF微泡。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟2)中所述磷脂溶液的濃度為2.8-3. lmg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于步驟4)中所述微泡、抗生物素蛋白、生物素化的⑶NF 的配比為(O. 85-1. l)ml (O. 08-0. 12)mg (O. 9-1. 2)mgo
8.一種載GDNF微泡的給藥套裝，包括權(quán)利要求1-4中任一項所述的載GDNF微泡和聚焦超聲設(shè)備；所述載GDNF微泡的給藥量設(shè)定為O. 5ml，所述聚焦超聲設(shè)備的參數(shù)設(shè)置如下探頭頻率1MHz，超聲照射時間60s，聲壓O. 8MPa，延遲時間60s。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種載GDNF微泡及制備方法。該載GDNF微泡由內(nèi)部包裹生物惰性氣體的脂質(zhì)雙分子層和連接于所述脂質(zhì)雙分子層外側(cè)的生物素化的GDNF組成。采用MRI實時引導(dǎo)低頻聚焦超聲聯(lián)合載有GDNF微泡開放BBB輻照大鼠顱腦頂葉皮層區(qū)(最佳參數(shù)設(shè)定為探頭頻率1MHz，微泡量0.5ml，照射時間60s，聲壓0.8MPa，延時60s)，可促進(jìn)GDNF透過血腦屏障，增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)GDNF的有效藥物濃度。通過低頻聚焦超聲聯(lián)合靶向微泡技術(shù)，進(jìn)行有效大分子突破BBB后的藥理學(xué)研究，將進(jìn)一步增加神經(jīng)營養(yǎng)因子在治療腦疾病方面的優(yōu)勢，提供GDNF治療中樞神經(jīng)疾病的科學(xué)依據(jù)。
文檔編號A61P25/16GK102657612SQ201210056979
公開日2012年9月12日 申請日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者劉俐, 孫成玉, 王峰, 石宇, 鄭海榮, 陸林, 陳蕓 申請人:北京大學(xué)