專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組海參溶菌酶c端多肽、其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組海參溶菌酶C端多肽高效表達(dá)的工程菌制備方法，優(yōu)化發(fā)酵工藝而獲得高產(chǎn)率的可溶性多肽產(chǎn)物，以及對(duì)制備的產(chǎn)品進(jìn)行廣譜抗菌活性的研究。
背景技術(shù)：
溶菌酶是一種能水解粘多糖的堿性酶，它能催化細(xì)菌細(xì)胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β _1，4糖苷鍵的水解，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌死亡。它廣泛存在于自然界動(dòng)植物和微生物的組織、體液及分泌物中，在生物機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。溶菌酶作為天然的抗菌劑、免疫增強(qiáng)劑和防腐劑目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及飼料等行業(yè)。近年來(lái)隨著海洋生物魚(yú)類(lèi)、蝦類(lèi)、貝類(lèi)以及海珍品，如海參、鮑魚(yú)等養(yǎng)殖產(chǎn)量的快速增長(zhǎng)，隨之而來(lái)的是海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中的品質(zhì)退化、養(yǎng)殖水平低、疾病泛濫及環(huán)境污染等問(wèn)題。目前在水產(chǎn)品養(yǎng)殖以及畜禽生產(chǎn)中使用抗生素帶來(lái)的問(wèn)題也越來(lái)越受到人們的關(guān)注，一是耐藥性問(wèn)題，二是藥物殘留問(wèn)題，其副作用是不可忽視的，人們不希望以犧牲人類(lèi)健康為代價(jià)換取海產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)性能的提高。在這種嚴(yán)峻形勢(shì)下，溶菌酶在動(dòng)物養(yǎng)殖方面的優(yōu)勢(shì)以及在疾病預(yù)防治療方面的促進(jìn)作用顯示了它的突出地位，它的綠色、安全、無(wú)公害的特點(diǎn)代表了未來(lái)的飼料添加劑和動(dòng)物保健品的方向。根據(jù)溶菌酶空間結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)特性和催化活性的差異通?？煞譃?類(lèi)C-型 (chicken-type)溶菌酶、g_ 型(goose-type)溶菌酶、i_ 型(invertebrate-type)溶菌酶； 植物源(plant lysozyme)溶菌酶；微生物源(bacterial lysozyme)溶菌酶；噬菌體(phage lysozyme)溶菌酶。近年來(lái)隨著人們把開(kāi)發(fā)新藥和功能性食品的目光投向海洋，對(duì)i_型溶菌酶的研究興趣也日益高漲，相繼在海洋貝類(lèi)、蝦、海星、海膽、海參中發(fā)現(xiàn)了 i_型溶菌酶。目前已商品化使用的溶菌酶主要從蛋清中提取，屬于C-型溶菌酶。由于來(lái)源有限，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，溶菌酶產(chǎn)量受限，價(jià)格居高不下，難以滿足越來(lái)越大的市場(chǎng)需求。因此， 利用基因工程重組技術(shù)高效表達(dá)溶菌酶成為很重要的手段，尤其生產(chǎn)海參i_型溶菌酶具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，海參i_型溶菌酶與蛋清C-型溶菌酶不同，后者只對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌起抗菌作用，而海參i_型溶菌酶不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，并且對(duì)革蘭氏陰性菌均具有顯著的抗菌作用，尤其對(duì)通常引起水產(chǎn)動(dòng)物嚴(yán)重病害的病原菌(弧菌和假單胞菌)具有明顯的抗菌效果。同時(shí)，海參i_型溶菌酶具有較強(qiáng)的抗真菌、抗病毒、增加免疫力等能力，并具有生物相容性好、對(duì)組織無(wú)刺激、無(wú)毒性等特點(diǎn)。海參i-型溶菌酶(以下簡(jiǎn)稱(chēng)海參溶菌酶)基因于2007年在我們實(shí)驗(yàn)室首次被分離和鑒定(參見(jiàn)楊西建，等.海參i_型溶菌酶基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn).中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)；2007，23 (7) :542-547)。近年來(lái)，我們又將海參溶菌酶基因分別在大腸桿菌和畢赤酵母細(xì)胞中進(jìn)行重組表達(dá)，并對(duì)重組蛋白的抗菌活性進(jìn)行了研究(參見(jiàn)王秀霞，等.海刺參i_型溶菌酶基因的重組表達(dá)及抑菌譜分析.生物工程學(xué)報(bào)，2009，25 O) 189-194;谷躍峰，等.海參溶菌酶基因克隆及在畢赤酵母中的表達(dá)與純化.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，四(5) :317-320)。但目前存在的問(wèn)題，一是重組海參溶菌酶基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)，其溶菌酶蛋白以包涵體形式存在(即酶蛋白不溶解)，后續(xù)對(duì)該蛋白的變性和復(fù)性操作繁瑣，而且獲得的酶產(chǎn)量低、活性不穩(wěn)定；二是重組海參溶菌酶基因在畢赤酵母細(xì)胞中蛋白表達(dá)量很低。這兩個(gè)瓶頸問(wèn)題嚴(yán)重阻礙了海參溶菌酶研究向產(chǎn)業(yè)化試驗(yàn)的進(jìn)程，并且國(guó)內(nèi)外幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室在研究各類(lèi)溶菌酶基因表達(dá)時(shí)都遇到類(lèi)似問(wèn)題。經(jīng)過(guò)對(duì)海參溶菌酶基因結(jié)構(gòu)的分析，發(fā)現(xiàn)海參溶菌酶的N端區(qū)域可能編碼了糖苷酶活性，而C端區(qū)域可能編碼了異構(gòu)肽酶活性。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)將海參溶菌酶基因分成兩段，分別進(jìn)行重組表達(dá)制備成海參溶菌酶N端和C端多肽，再驗(yàn)證其特性和功能，并與海參溶菌酶做比較和分析。本發(fā)明是關(guān)于重組海參溶菌酶C端多肽的制備方法及應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有廣譜抗菌活性、高效表達(dá)海參溶菌酶C端多肽的基因工程制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為對(duì)來(lái)源于自主分離鑒定的海刺參 (Stichopus japonicus)的溶菌酶(SjLys)基因(GenBank 注冊(cè)號(hào)EF036468)進(jìn)行 C 端多肽的重組表達(dá)。利用設(shè)計(jì)合成的引物，擴(kuò)增海參溶菌酶C端多肽的基因；將構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-32a_S jLys-C，轉(zhuǎn)化Rosetta (DE3) pLysS細(xì)胞，獲得一株高效表達(dá)重組海參溶菌酶 C端多肽的基因工程菌。用所述的基因工程菌生產(chǎn)的溶菌酶C端多肽，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，其表達(dá)產(chǎn)物具有80%以上的可溶性，產(chǎn)品收率高。生產(chǎn)的重組海參溶菌酶C端多肽具有廣譜抗菌活性，尤其是經(jīng)100°C加熱40min，該多肽產(chǎn)品的抗菌活性增強(qiáng)了 10% 25%。研究證明，海參溶菌酶C端多肽的抗菌活性、穩(wěn)定性和生產(chǎn)效率均優(yōu)于海參溶菌酶， 可無(wú)危害地應(yīng)用于制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物等。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種重組海參溶菌酶C端多肽的引物序列，其引物序列分別為，正向引物=SEQ ID NO 1 ；反向引物=SEQ ID NO :2。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種重組海參溶菌酶C端多肽的質(zhì)粒，其制備方法包括以海參溶菌酶SjLys基因?yàn)槟０?，將核苷酸序列分別為，正向引物SEQ ID NO :1 ；反向引物SEQ ID NO :2的引物序列所擴(kuò)增的基因片段連接至大腸桿菌表達(dá)載體pET3h(+)中， 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種表達(dá)重組海參溶菌酶C端多肽的基因工程菌，其制備方法包括將上文所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DEiB)pLysS宿主細(xì)胞獲得重組基因工程菌。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種重組海參溶菌酶C端多肽的制備方法，包括下述步驟①誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)上文所述的重組基因工程菌，并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；②分離和純化收集步驟①所得產(chǎn)物，經(jīng)鎳離子親和層析柱純化，并用超濾膜濃縮；再將濃縮樣品脫鹽后制得終產(chǎn)品。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種上文所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化的條件包括③誘導(dǎo)表達(dá)將上文所述的重組基因工程菌在優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中，37°C、160rpm振蕩培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 6 0. 8，再向培養(yǎng)體系中加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L, 28C, 150rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)》1，收集發(fā)酵液；其中，優(yōu)化的液體培養(yǎng)基是指在LB培養(yǎng)基中加入兩種抗生素，即100mg/L氨芐青霉素和 34mg/L 氯霉素，并添加 5g/L 葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20 和 lg/L K2HPO4 · 3H20 ；④分離和純化將步驟③收集的發(fā)酵液離心，收集并洗滌菌體，反復(fù)凍融，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，并加入Triton X_100至終濃度為1 %后，經(jīng)冰浴超聲破菌，離心收集上清液，經(jīng)鎳離子親和層析柱His Trap HP column純化，收集重組海參溶菌酶多肽的融合蛋白組分，用截留分子量為5kDa的Millipore超濾膜將蛋白濃縮至8 10mg/mL ；再將濃縮樣品經(jīng)kphadex G-25凝膠層析脫鹽，收集融合蛋白組分，冷凍干燥，得到重組海參溶菌酶C端多肽的產(chǎn)品。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種利用上文所述的方法獲得的重組海參溶菌酶C 端多肽產(chǎn)品。本發(fā)明的另一方面在于保護(hù)一種利用上文所述的重組海參溶菌酶C端多肽在制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物、海水養(yǎng)殖生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用。上述本發(fā)明涉及的下列各實(shí)驗(yàn)操作，包括基因片段連接至大腸桿菌表達(dá)載體 pET32a(+)中、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta (DE;3)pLysS宿主細(xì)胞、鎳離子親和層析柱純化、超濾膜濃縮、樣品脫鹽等實(shí)驗(yàn)操作方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，故再次不做贅述，具體可見(jiàn)本發(fā)明中具體實(shí)施例所述部分。本發(fā)明的創(chuàng)新特征是1.高效表達(dá)和制備可溶性重組海參溶菌酶C端多肽，解決了當(dāng)前海參溶菌酶產(chǎn)業(yè)化遇到的蛋白溶解度低、酶活性低等關(guān)鍵問(wèn)題。2.本發(fā)明提供的基因工程菌生產(chǎn)重組海參溶菌酶C端多肽，具有產(chǎn)量高，生產(chǎn)條件和步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件易于控制，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)，因此適用于大規(guī)模的生產(chǎn)。3.重組海參溶菌酶C端多肽具有廣譜抗菌活性，尤其經(jīng)加熱處理后的該產(chǎn)品，其抗菌活性提高了 10% 25%。因此，該產(chǎn)品具有很好的熱穩(wěn)定性和酶活穩(wěn)定性，而且安全無(wú)害，可應(yīng)用于制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物等。


圖 1 是 PCR 擴(kuò)增 SjLys-C 的基因片段；其中泳道，M :100bp DNA ladder marker ； 1 =PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2是重組海參溶菌酶C端多肽的Western blotting分析結(jié)果圖；其中泳道，M 精準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 =IPTG誘導(dǎo)前菌株發(fā)酵液的菌體；2 :IPTG誘導(dǎo)后菌株發(fā)酵液的菌體；3 =Western blotting檢測(cè)泳道1中的樣品；4 =Western blotting檢測(cè)泳道2中的樣
P
BFI ；圖3是重組海參溶菌酶C端多肽的誘導(dǎo)表達(dá)及純化的SDS-PAGE結(jié)果圖；其中泳道，M 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 IPTG誘導(dǎo)前菌株發(fā)酵液的菌體；2 :IPTG誘導(dǎo)后菌株發(fā)酵液的菌體；3 誘導(dǎo)的菌株發(fā)酵液菌體細(xì)胞被破碎后的沉淀物；4 誘導(dǎo)的菌株發(fā)酵液菌體細(xì)胞被破碎后的上清液；5 泳道4中的樣品經(jīng)Ni2+-NTA親和層析柱純化的重組蛋白。
具體實(shí)施例方式下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用的海刺參(Stichopus japonicus)，源于大連長(zhǎng)?？h地區(qū)，其海參溶菌酶(SjLys)基因的GenBank注冊(cè)號(hào)為EF036468 ；引物序列合成、DNA測(cè)序是由北京華大基因研究中心完成；Western blotting 7MirMi^ TaKaRa Biotechnology ( ) ^ ] ；大腸桿菌Rosetta (DE;3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞和表達(dá)載體pET_32a(+)購(gòu)自 Novagen(美國(guó))公司；大腸桿菌DH5a，克隆載體 pMD 18-T，RNAiso Plus 試劑，TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)試劑盒，限制性核酸內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，DNA ladder marker禾口蛋白低分子量marker均購(gòu)自TaKaRa Biotechnology (大連)公司；質(zhì)粒提取和瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；HisTrap HP column 購(gòu)自 GE Healthcare (美國(guó))公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)的分析純。實(shí)施例1高效表達(dá)重組海參溶菌酶C端多肽的基因工程菌的制備1.海參溶菌酶C端多肽基因序列的擴(kuò)增(1)根據(jù)海參溶菌酶的基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，分別在正向和反向序列里引入Nco I和EcoR I酶切位點(diǎn)。其序列為正向引物SEQID NO :1GAATGCCATGGTGATGGGAGGTAGTCT反向引物SEQID NO :2GTGGAATTCTGTTCAGTTGTTGCTCATGTC。PCR擴(kuò)增片段范圍是從海參溶菌酶氨基酸Gly 70至Asn 145，全長(zhǎng)為228bp (含有 76aa)，即為SjLys-C的基因片段。(2)取新鮮的海刺參腸樣品，根據(jù)RNAiso Plus試劑說(shuō)明抽提總RNA。(3)以該海參腸總 RNA 為模板，使用 TaKafci One Step RNA PCR Kit(AMV)進(jìn)行 RT-PCR基因擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.重組海參溶菌酶C端多肽的引物序列，其特征在于引物序列分別為，正向引物SEQ ID NO 1 ；反向引物:SEQ ID NO :2。
2.一種重組海參溶菌酶C端多肽的質(zhì)粒，其特征在于，制備方法包括以溶菌酶SjLys 基因?yàn)槟０?，將?quán)利要求1所述的引物序列所擴(kuò)增的基因片段連接至大腸桿菌表達(dá)載體 pET32a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。
3.—種表達(dá)重組海參溶菌酶C端多肽的基因工程菌，其特征在于，制備方法包括將權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DE;3)pLysS宿主細(xì)胞獲得重組基因工程菌。
4.一種重組海參溶菌酶C端多肽的制備方法，其特征在于，制備方法包括①誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)權(quán)利要求3所述的重組基因工程菌，并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；②分離和純化收集步驟①所得產(chǎn)物，經(jīng)鎳離子親和層析柱純化，并用超濾膜濃縮；再將濃縮樣品脫鹽后制得終產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)表達(dá)和分離純化的條件包括③誘導(dǎo)表達(dá)將權(quán)利要求3所述的重組基因工程菌在優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中，37°C、160rpm振蕩培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 6-0. 8，再向培養(yǎng)體系中加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，、150rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集發(fā)酵液；其中，優(yōu)化的液體培養(yǎng)基是指在LB培養(yǎng)基中加入兩種抗生素，即100mg/L氨芐青霉素和 34mg/L 氯霉素，并添加 5g/L 葡萄糖，0. 3g/L MgSO4 · 7H20 和 lg/L K2HPO4 · 3H20 ；④分離和純化將步驟③收集的發(fā)酵液離心，收集并洗滌菌體，反復(fù)凍融，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體， 并加入Triton X-100至終濃度為1 %后，經(jīng)冰浴超聲破菌，離心收集上清液，經(jīng)鎳離子親和層析柱His Trap HP column純化，收集重組海參溶菌酶多肽的融合蛋白組分，用截留分子量為51^^的肌11丨？0儀超濾膜將蛋白濃縮至8 1011^/1^ ；再將濃縮樣品經(jīng)kphadex G-25 凝膠層析脫鹽，收集融合蛋白組分，冷凍干燥，得到重組海參溶菌酶C端多肽的產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法獲得的重組海參溶菌酶C端多肽產(chǎn)品。
7.如權(quán)利要求6所述的重組海參溶菌酶C端多肽在制備飼料添加劑、食品防腐劑、抗生素的替代藥物、海水養(yǎng)殖生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)來(lái)源于海刺參(Stichopus japonicus)溶菌酶(SjLys)基因(GenBank注冊(cè)號(hào)為EF036468)進(jìn)行C端多肽的重組表達(dá)。首先構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-SjLys-C，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS細(xì)胞，獲得一株高效表達(dá)重組海參溶菌酶C端多肽的基因工程菌。利用該基因工程菌生產(chǎn)的溶菌酶C端多肽，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，其表達(dá)產(chǎn)物具有80％以上的可溶性，產(chǎn)品收率高。生產(chǎn)的重組海參溶菌酶C端多肽具有廣譜抗菌活性，尤其是該產(chǎn)品經(jīng)100℃加熱40min處理后，它的抗菌活性增強(qiáng)了10％～25％，這對(duì)開(kāi)發(fā)海參溶菌酶多肽作為飼料添加劑非常有利。
文檔編號(hào)A61K38/47GK102559671SQ20121005548
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月5日
發(fā)明者叢麗娜, 常藝海 申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)