專利名稱：通過(guò)抑制鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原的表達(dá)而治療牛皮癬、鱗狀上皮細(xì)胞癌和/或角化不全的方 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了通過(guò)抑制細(xì)胞的鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(Squamous Cell CarcinomaAntigen,下文中稱為“SCCA” )的表達(dá)而治療和/或預(yù)防選自牛皮癬和鱗狀上皮細(xì)胞癌的疾病的方法、藥物組合物。本發(fā)明還提供了以抑制鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原-I(SCCA-I)所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的候選物質(zhì)的活性為指標(biāo)，篩選抑制表皮角化不全的物質(zhì)的方法；提供了通過(guò)所述方法篩選到的抑制表皮角化不全的物質(zhì)；進(jìn)一步地提供了通過(guò)抑制表皮細(xì)胞中SCCA-I的胱天蛋白酶(caspase) 14抑制活性而謀求表皮細(xì)胞角化的正?；?、抑制表皮角化不全的方法。
背景技術(shù)：
SCCA為自鱗狀上皮癌細(xì)胞提取的抗原，其在子宮頸部、肺、食道、皮膚的鱗狀上皮細(xì)胞癌中顯示出高的血液濃度，常用于鱗狀上皮細(xì)胞癌的診斷(H. Kato等人，Cancer 40:1621-1628(1977) ；N. Mino 等人，Cancer 62:730-734(1988))。特別是，由于 SCCA 的血液中水平與鱗狀上皮細(xì)胞癌的進(jìn)展階段、惡性程度、腫瘤的大小等呈良好的相關(guān)性，其除了用于癌癥的早期發(fā)現(xiàn)之外，在癌癥治療效果的評(píng)價(jià)以及診斷所擔(dān)心的復(fù)發(fā)等中也是特別有效的癌標(biāo)志物。還知道SCCA在牛皮癬表皮的上層中表達(dá)增強(qiáng)(Takeda A.等人，J. Invest.Dermatol. (2002) 118(1),147-154).牛皮癬是皮膚病中的一種，是以表皮細(xì)胞的增殖/分化異常和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的慢性、再發(fā)性的炎癥性角化不全癥的牛皮癬。認(rèn)為牛皮癬除遺傳因素之外還因多種環(huán)境因子而發(fā)病(Hopso-Havu等人，British Journal ofDermatology(1983) 109，77-85)。SCCA是由染色體18q21.3上串聯(lián)排列的兩個(gè)基因SCCA-I和SCCA-2編碼的。認(rèn)為由這兩個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)SCCA-I和SCCA-2均為分子量約45，000的蛋白質(zhì)，同源性非常高，但是二者反應(yīng)部位的氨基酸序列不同，具有不同的功能(khick等人，J. Biol. Chem.(1997)27213,1849-55)。雖然已知在鱗狀包皮細(xì)胞癌和牛皮癬等疾病中存在SCCA-I和SCCA-2高表達(dá)，但是，對(duì)它們?cè)诩膊〖?xì)胞中發(fā)揮什么樣的功能尚不清楚。一方面，已知角質(zhì)形成細(xì)胞通過(guò)終末分化，具有形成抵御有害環(huán)境的被稱作“角質(zhì)層”的保護(hù)屏障的功能。終末分化過(guò)程在分化程序中受到正確調(diào)控，從增殖型基底細(xì)胞開(kāi)始經(jīng)有棘細(xì)胞、顆粒細(xì)胞，最后到角質(zhì)細(xì)胞。從顆粒細(xì)胞向角化細(xì)胞的過(guò)渡期中，角質(zhì)形成細(xì)胞的內(nèi)側(cè)和外側(cè)發(fā)生劇烈變化。角質(zhì)形成細(xì)胞的核與細(xì)胞器消失，另一方面，生成周?chē)|(zhì)層、被稱作角化外皮的強(qiáng)化了的細(xì)胞膜以及角蛋白構(gòu)型(keratin pattern) 0角蛋白構(gòu)型內(nèi)部結(jié)構(gòu)柔軟，且維持緊張狀態(tài)。以往的報(bào)告稱，分化中的角質(zhì)形成細(xì)胞存在DNA片段化和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞等，顯示出程序性細(xì)胞死亡(apoptosis)特征(Haake A. R.，J. Invest.Dermatol. 101，107-12 (199 )。人角化細(xì)胞提取物中檢測(cè)到了胱天蛋白酶樣活性，然后發(fā)現(xiàn)在人角質(zhì)形成細(xì)胞中存在若干種胱天蛋白酶。但是，另有報(bào)告稱，典型的促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡的胱天蛋白酶，例如胱天蛋白酶-3、-6和-7，終末分化時(shí)不被活化。分化異常往往導(dǎo)致被稱作“角化不全”的角化層中的核持久存在。角化不全嚴(yán)重破壞皮膚的屏障功能。但是，何種因子參與脫核過(guò)程，另外在角質(zhì)形成細(xì)胞分化中如何調(diào)控該過(guò)程，直至今日尚不十分明確。胱天蛋白酶是已熟知的程序性細(xì)胞死亡的細(xì)胞死實(shí)行因子，它們是進(jìn)化過(guò)程中保守的半胱氨酸蛋白酶，在天冬氨酸殘基的后方切割底物。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能將哺乳動(dòng)物的胱天蛋白酶分為三個(gè)亞群，即開(kāi)始胱天蛋白酶、實(shí)行胱天蛋白酶和炎癥性胱天蛋白酶。實(shí)行胱天蛋白酶的重要作用是分解CAD (胱天蛋白酶活化型DNA酶)抑制物ICAD，結(jié)果是使CAD作為活性核酸酶游離出來(lái)(Enari M.等人，Nature 391，43-50 (1998))。胱天蛋白酶活性受多種分子調(diào)節(jié)。特別是三組與若干種胱天蛋白酶直接復(fù)合的抑制性蛋白質(zhì)。桿狀病毒抗程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)P35除作用于絲氨酸和其它半胱氨酸蛋白酶12之外，還抑制胱天蛋白酶 1，-3，-6，-7，-8 和-10 (Zhou Q.等人，Biochemistry 37,10757-65 (1998)) 桿狀病毒還合成其它抗程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)、程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)抑制物(IAP)。發(fā)現(xiàn)IAP同源體也存在于哺乳動(dòng)物中(Verhagen A.M.等人，Genome Biol. 2，REVIEWS 3009 (2001)) 哺乳動(dòng)物IAP通過(guò)抑制胱天蛋白酶14、或者通過(guò)拮抗促進(jìn)程序性細(xì)胞死亡的促進(jìn)因子例如DIABLO/Smac而阻斷程序性細(xì)胞死亡(Wu G. Nature 408，1008-12 (2000))。細(xì)胞因子應(yīng)答修飾因子A(Crm Α)為牛痘病毒基因產(chǎn)物，能夠抑制程序性細(xì)胞死亡胱天蛋白酶和炎癥性胱天蛋白酶(Garcia-Calvo M 等人，J. Biol. Chem. 273，3洸08_13 (1998))。令人感興趣的是，已教導(dǎo)了 Crm A屬于絲氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族，作為絲氨酸蛋白酶抑制蛋白的一部分，例如PI-9和PAI-I通過(guò)分別與胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶3的相互作用能夠抑制程序性細(xì)胞死亡(Annand R. R.等人，Biochem. J. 342Pt3，655-65 (1999))。角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化是否是程序性細(xì)胞死亡現(xiàn)象的一部分，另外，在此過(guò)程中是否有任意的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)參與等令人感興趣。胱天蛋白酶14是胱天蛋白酶家族的最新成員，發(fā)現(xiàn)存在于專門(mén)分化的角質(zhì)形成細(xì)胞中。胱天蛋白酶14在胱天蛋白酶家族成員間作為同源的EST而鑒定。最新的研究顯示，角化細(xì)胞中的胱天蛋白酶14經(jīng)加工形成異二聚體，進(jìn)而對(duì)胱天蛋白酶1對(duì)應(yīng)的合成底物 Trp-Glu-His-Asp-AFC 顯示酶活性(Mikolajczyk J.等人，Biochemistry 43，10560-9(2004))。此水解活性對(duì)于蛋白質(zhì)分解切割和cosmotropic鹽的存在是必要的。教導(dǎo)了雖然胱天蛋白酶14的一級(jí)結(jié)構(gòu)與炎癥性胱天蛋白酶例如胱天蛋白酶1、-4和-5極為相似，但是限定于分化的角質(zhì)形成細(xì)胞中的胱天蛋白酶14的表達(dá)以其它方式參與角質(zhì)形成細(xì)胞終末分化(Lippens S.等人，Cell Death Differ. 7，1218-24(2000))。但是，尚不清楚胱天蛋白酶14的活化機(jī)制、天然底物和調(diào)節(jié)因子。發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明人以闡明SCCA所參與的表皮生理學(xué)機(jī)制為目的進(jìn)行研究之際有令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，SCCA為具有抑制細(xì)胞程序性死亡作用的抗程序性細(xì)胞死亡因子。
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簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明人進(jìn)行了皮膚UV防御機(jī)制的研究，明確了由于對(duì)人皮膚的UV照射，棘層和顆粒層中SCCA的表達(dá)有力地增強(qiáng)。然后，在沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SCCA表達(dá)的3T3細(xì)胞中導(dǎo)入人SCCA-I和SCCA-2基因，建立穩(wěn)定的表達(dá)體系。在調(diào)查SCCA穩(wěn)定表達(dá)系細(xì)胞由于UV照射所致程序性細(xì)胞死亡時(shí)，發(fā)現(xiàn)在任一 SCCA穩(wěn)定表達(dá)體系中，均顯著減少由UV照射引起的程序性細(xì)胞死亡。進(jìn)而，通過(guò)以pSilencer載體使siRNA在高表達(dá)SCCA的HaCat細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的RNA干擾法，建立了 SCCA-I和SCCA-2的敲低(siSCCA)細(xì)胞株，細(xì)胞株經(jīng)UV照射后，與對(duì)照株相比，SCCA敲低(knock down)細(xì)胞株的程序性細(xì)胞死亡率顯著增高。根據(jù)以上結(jié)果，本發(fā)明人可以得出如下結(jié)論，SCCA是具有抑制程序性細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)。對(duì)于癌癥和牛皮癬等伴隨細(xì)胞增殖和分化異常的疾病，認(rèn)為是由于抑制了癌細(xì)胞等的程序性細(xì)胞死亡，避免了細(xì)胞死亡，而繼續(xù)異常增殖。因此，在顯示SCCA表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)胞中，具有抗程序性細(xì)胞死亡作用的SCCA抑制該細(xì)胞死亡，作為結(jié)果就是該細(xì)胞的異常增殖。因此，明確了如果具有程序性細(xì)胞死亡抑制作用的SCCA的表達(dá)受到抑制，就能夠治療和預(yù)防鱗狀上皮細(xì)胞癌和牛皮癬等伴隨細(xì)胞增殖異常等的疾病。本發(fā)明借鑒上述觀點(diǎn)，以提供治療和預(yù)防伴隨SCCA高表達(dá)細(xì)胞的增殖異常的疾病，例如癌癥、特別是鱗狀上皮細(xì)胞癌、進(jìn)一步地是牛皮癬等的方法、藥物組合物作為課題。進(jìn)一步地，本發(fā)明闡明了表皮角化不全的機(jī)制，以開(kāi)發(fā)與現(xiàn)有技術(shù)不同的全新方法來(lái)抑制和治療表皮角化不全的手段作為課題。考慮到對(duì)于伴隨角化不全的特應(yīng)性皮炎、牛皮癬等皮膚病尚無(wú)特效藥物，本發(fā)明對(duì)于皮膚科學(xué)、化妝品學(xué)領(lǐng)域的影響巨大。在第一觀點(diǎn)中，本發(fā)明提供了通過(guò)抑制細(xì)胞的鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCCA)的表達(dá)而治療和/或預(yù)防選自牛皮癬和鱗狀上皮細(xì)胞癌的疾病的方法。優(yōu)選地，通過(guò)對(duì)編碼SCCA的基因?qū)嵤㏑NA干擾而抑制細(xì)胞的SCCA表達(dá)。在更合適的方案中，RNA干擾利用了這樣的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA由含有序列號(hào)1的寡核苷酸或其變體的有義寡核苷酸鏈和含有序列號(hào)2的寡核苷酸或其變體的反義寡核苷酸鏈組成。本文中，上述序列號(hào)1的寡核苷酸的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因的第46 66位核苷酸雜交的序列，而上述序列號(hào)2的寡核苷酸的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因的第46 66位核苷酸之互補(bǔ)鏈雜交的序列。在上述觀點(diǎn)的其他方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)抑制細(xì)胞的SCCA的表達(dá)而治療和/或預(yù)防選自牛皮癬和鱗狀上皮細(xì)胞癌的疾病的藥物組合物。優(yōu)選地，藥物組合物含有這樣的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA提供對(duì)編碼SCCA的基因進(jìn)行RNA干擾的短鏈RNA。在更為合適的方案中，上述藥物組合物含有這樣的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA由含有序列號(hào)1的寡核苷酸或其變體的有義寡核苷酸鏈和含有序列號(hào)2的寡核苷酸或其變體的反義寡核苷酸鏈組成。本文中，上述序列號(hào)1的寡核苷酸的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因中第46 66位核苷酸雜交的序列，而上述序列號(hào)2的寡核苷酸的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因中第46 66位核苷酸之互補(bǔ)鏈雜交的序列。在合適的方案中，上述雙鏈RNA為在載體中例如在pSilencer載體中含有的形態(tài)。本發(fā)明進(jìn)一步地提供了 SCCA表達(dá)受到抑制的細(xì)胞的制備方法。優(yōu)選地，通過(guò)對(duì)編碼SCCA的基因進(jìn)行RNA干擾而抑制SCCA的表達(dá)。在更合適的方案中，RNA干擾利用了這樣的雙鏈RNA，所述雙鏈RNA由含有序列號(hào)1的寡核苷酸或其變體的有義寡核苷酸鏈和含有序列號(hào)2的寡核苷酸或其變體的反義寡核苷酸鏈組成。本文中，上述序列號(hào)1的寡核苷酸的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因的第46 66位核苷酸雜交的序列，而上述序列號(hào)2的寡核苷酸的變體具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因第46 66位核苷酸之互補(bǔ)鏈雜交的序列。本發(fā)明進(jìn)一步地提供了通過(guò)上述方法使SCCA的表達(dá)受到抑制的細(xì)胞和含有該細(xì)胞的哺乳動(dòng)物。因此，本發(fā)明提供了用于治療和預(yù)防選自鱗狀上皮細(xì)胞癌和牛皮癬的疾病的方法、藥物組合物。進(jìn)一步地，在其他觀點(diǎn)中，本申請(qǐng)還包含以下的發(fā)明方案。[1]抑制表皮角化不全的物質(zhì)的篩選方法，所述方法的特征在于以抑制鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原-I(SCCA-I)所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的候選物質(zhì)的活性作為指標(biāo)。[2] [1]的方法，其包括以下測(cè)試體系⑴、(2)、(3)(1)測(cè)定半胱氨酸蛋白酶的活性，得到其測(cè)定值[χ]；(2) i)將候選物質(zhì)與酶活性同等量的前述(1)所述半胱氨酸蛋白酶混合，孵育；然后ii)在與前述(1)相同的條件下測(cè)定該的孵育混合物的半胱氨酸蛋白酶活性，得出其測(cè)定值[y]；以及(3) i)將SCCA-I與等量的( i)中所使用的前述候選物質(zhì)混合，孵育；ii)將該C3)i)孵育混合物與酶活性同等量的前述(1)所述的半胱氨酸蛋白酶混合，在與前述相同的條件下孵育；然后iii)在與前述(1)相同的條件下測(cè)定該(3)ii)的孵育混合物的半胱氨酸蛋白酶活性，得出其測(cè)定值[ζ]；其中，如果滿足{[z]/[x]X100}-{100-[y]/[x]X100} >0，則確定前述候選物質(zhì)具有抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的活性，從而選定為抑制表皮角化不全的物質(zhì)。[3] [2]的方法，以滿足{[z]/[x]X100}-{100-[y]/[x]X100} > 3 為條件。[4] [3]的方法，以滿足{[z]/[x]X100}-{100-[y]/[x]X100} > 16 為條件。[5] [1]至W]中任意一項(xiàng)所述的方法，其中前述半胱氨酸蛋白酶是胱天蛋白酶14。[6] [1]至W]中任意一項(xiàng)所述的方法，其中前述半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶。[7]抑制表皮角化不全的皮膚外用組合物，特別是美容學(xué)的皮膚外用組合物，其特征在于含有選自水燭提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物和大棗提取物中的1種或幾種生藥作為活性成分。[8] [7]的皮膚外用組合物，其特征在于含有水燭提取物。[9] [7]或[8]的組合物，其中前述表皮角化不全是由牛皮癬引起的。[10] [7]或[8]的組合物，其中前述表皮角化不全是由特應(yīng)性皮炎引起的。[11]通過(guò)抑制表皮細(xì)胞中SCCA-I的胱天蛋白酶14抑制活性而謀求表皮細(xì)胞角化的正常化、抑制表皮角化不全的方法。[12] [11]的方法，其通過(guò)向表皮涂抹含有選自水燭提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物和大棗提取物中的1種或幾種生藥作為活性成分的皮膚外用組合物，抑制表皮細(xì)胞中SCCA-I的胱天蛋白酶14抑制活性。[13] [12]的方法，其特征在于前述皮膚外用組合物含有水燭提取物。因此，通過(guò)本發(fā)明，提供與現(xiàn)有技術(shù)不同的全新方法作為抑制和治療表皮角化不全的手段成為可能。[14]以選自水燭提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物和大棗提取物中的一種或幾種生藥作為活性成分的用途，用于制備抑制表皮角化不全的皮膚外用組合物，特別是美容學(xué)或化妝學(xué)的皮膚外用組合物。[15] [7]的用途，其中前述生藥是水燭提取物。[16] [14]或[15]的用途，其中前述表皮角化不全是由牛皮癬引起的。[17] [14]或[15]的用途，其中前述表皮角化不全是由特應(yīng)性皮炎引起的。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了在露光和非露光部位的表皮中SCCA的表達(dá)。圖2顯示了由UV照射引起的表皮中SCCA表達(dá)的變化。圖3顯示了培養(yǎng)的人角化細(xì)胞中UV照射對(duì)SCCA表達(dá)的影響。圖4顯示了對(duì)SCCA高表達(dá)細(xì)胞與不表達(dá)SCCA的細(xì)胞，比較由UV照射誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡率。圖5顯示了 SCCA敲低細(xì)胞株的建立。圖6顯示了比較SCCA敲低細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞由UV照射誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡率。圖7顯示了皮膚提取物的蛋白質(zhì)印跡分析。通過(guò)使用H-99抗體和hl4D146抗體，利用免疫印跡法對(duì)酶原和活性胱天蛋白酶-14的存在進(jìn)行分析。應(yīng)用于10 μ g(泳道1，2和4)和1 μ g(泳道；3)的全皮膚提取物、皮膚等價(jià)提取物和角化細(xì)胞提取物。圖8顯示了純化胱天蛋白酶-14的分析。(A)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將自Superdex 75層析得到的級(jí)分第25號(hào)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后考馬斯亮蘭染色。顯示17Kda和IlKda兩條蛋白質(zhì)條帶。(B)使用H-99、hl4D146和C20抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析。17KDa條帶對(duì)H99抗體和hl4D146抗體二者顯陽(yáng)性，而IlKDa條帶顯示可被C20抗體識(shí)別。圖9顯示了若干種合成抑制物對(duì)純化胱天蛋白酶-14的的效果。胱天蛋白酶的肽抑制物(YVAD，VDVAD, DEVD, VEID，IETD，LEHD, DNLD)、以及半胱氨酸蛋白酶(IAA)和絲氨酸蛋白酶(AEBSF)的類特異性抑制物與胱天蛋白酶-14進(jìn)行孵育。在1.3M檸檬酸鈉和5mMDTT的存在下，使用WEHD-MCA作為底物，測(cè)定殘留的酶活性。進(jìn)行試驗(yàn)的酶濃度分別為5、2. 5和1. 25 μ Μ。數(shù)值以重復(fù)測(cè)試的平均值表示。圖10 (A)顯示了純化胱天蛋白酶-14對(duì)ICAD的切割活性。(B)顯示了使用FL331抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。顯示3!3Kda和27Kda的切割產(chǎn)物。通過(guò)使用10 μ M SCCA-I進(jìn)行前孵育，ICAD的切割被完全抑制。只有在cosmotrophic鹽存在的情況下，可觀察到ICAD被分解。使用針對(duì)氨基末端的特異性抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與胱天蛋白酶14進(jìn)行延長(zhǎng)的孵育，完整的ICAD分子消失。向混合物中加入SCCA-I，也已經(jīng)檢測(cè)不到ICAD分解，經(jīng)16小時(shí)孵育后，仍絲毫未受影響(B)。(C)顯示了在cosmotropic鹽存在的情況下，對(duì)合成的胱天蛋白酶底物的水解活性的調(diào)查結(jié)果。圖11顯示了活性胱天蛋白酶-14和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的定位。用H_99抗體㈧、
7hl4D146抗體(B)和TUNEL(C)對(duì)正常人皮膚的薄切片進(jìn)行染色。使用Texas-Red用于檢測(cè)熒光(B)。FITC用于TUNEL，Texas Red用于免疫染色，對(duì)TUNEL和胱天蛋白酶實(shí)施雙重染色。圖12顯示了 ICAD和角化不全核的共定位(co-localization)。用抗ICAD抗體FL331對(duì)正常人皮膚的薄切片進(jìn)行染色。下表皮的幾乎所有核對(duì)該抗體顯陽(yáng)性。來(lái)自AD患者皮膚的角化細(xì)胞表在層上的ICAD用抗體進(jìn)行染色時(shí)，顯示出不同大小的陽(yáng)性部位(B)。通過(guò)顯示核簇的碘化丙啶(PI)常常觀察到核染色(C)。相同部位的明視野顯示出表面上的重疊范圍(D)。重疊圖像明確了 ICAD僅存在于角化不全部位(E)。在明視野中也顯示了核染色的重疊圖像(F)。圖13顯示了 SCCA-I和角化不全核的共定位。正常的皮膚切片內(nèi)幾乎不可能檢出SCCA-1。在AD患者皮膚的表在層，顯示了 SCCA-I陽(yáng)性部位(H)。僅在這些部位上可觀察到核簇(I)。明視野如(J)所示。顯示了重疊圖像是SCCA-I陽(yáng)性部位與優(yōu)選地未消化核存在部位的重疊(K)。還顯示了與SCCA-I染色和明視野相應(yīng)的其他重疊圖像(L)。 用于實(shí)施發(fā)明的最佳方式^^^mm / mmt hm^mmmw^本發(fā)明人闡明了 SCCA是具有抑制程序性細(xì)胞死亡作用的蛋白質(zhì)。因此，明確了通過(guò)抑制SCCA的表達(dá)，能夠治療和預(yù)防癌和牛皮癬等伴隨鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原表達(dá)的細(xì)胞的增殖和分化異常的疾病。鱗狀上皮細(xì)胞癌是位于例如子宮頸、肺、食道、上顎、皮膚等器官的鱗狀上皮細(xì)胞癌。SCCA是在上述鱗狀上皮癌細(xì)胞和牛皮癬表皮中存在的分子量約45，000的蛋白質(zhì)。SCCA-I和SCCA-2的氨基酸序列以及編碼它們的核酸序列如Takeda A等人J. Invest.Dermatol. 118，147-154(2002)(見(jiàn)上文)所述。通過(guò)多種遺傳學(xué)技術(shù)，例如RNA干擾法、反義RNA *DNA法、肽及RNA *DNA適配子、位點(diǎn)特異性刪除、同源重組、顯性失活等位基因、胞內(nèi)抗體等多種技術(shù)，可達(dá)到抑制細(xì)胞SCCA的表達(dá)，特別優(yōu)選地是通過(guò)RNA干擾法。RNA干擾法是通過(guò)向細(xì)胞導(dǎo)入這樣的雙鏈RNA從而抑制目的基因表達(dá)的方法，所述雙鏈RNA由包含與編碼部分目的基因的部分mRNA互補(bǔ)的約21至23個(gè)堿基對(duì)的有義寡核苷酸鏈和包含與上述部分mRNA同源的約21至23個(gè)堿基對(duì)的反義寡核苷酸鏈構(gòu)成。由于該方法是基于源自基因編碼區(qū)的雙鏈RNA的干擾特性，已在線蟲(chóng)的遺傳學(xué)研究中證明了具有極好的有用性(Fire等，Nature (1998) 391 :806-811)，也能夠用于在果蠅和哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生功能缺損表現(xiàn)型。在本方法中體外合成這樣的雙鏈RNA(dsRNA)，所述雙鏈RNA由與SCCA基因適當(dāng)?shù)哪康膮^(qū)域優(yōu)選地長(zhǎng)度約18至23個(gè)核苷酸的區(qū)域互補(bǔ)的序列(有義寡核苷酸)和與該有義序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度約18至23個(gè)核苷酸的序列(反義寡核苷酸)組成。優(yōu)選地，雙鏈RNA由含有與SCCA基因的第46 66位核苷酸序列之互補(bǔ)序列(ACATGAACTTGGTGTTGGCT T 序列號(hào)1)的有義寡核苷酸和含有與上述第46 66位核苷酸序列同源的序列(AAGCCAACACCAAGTTCATG T ；序列號(hào)幻的反義寡核苷酸組成。對(duì)于所有有義及反義寡核苷酸的長(zhǎng)度無(wú)特別限定，例如25個(gè)核苷酸或以上至100個(gè)核苷酸以下，優(yōu)選地40個(gè)核苷酸或以上至80個(gè)核苷酸以下，更加優(yōu)選地50個(gè)核苷酸或以上至70個(gè)核苷酸以下。
有義寡核苷酸也可以是含有序列號(hào)1的寡核苷酸的變體的寡核苷酸。該變體優(yōu)選地具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因的第46 66位核苷酸雜交的序列。另外，反義寡核苷酸也可以是含有序列號(hào)2的寡核苷酸的變體的寡核苷酸。該變體優(yōu)選地具有在高嚴(yán)格條件下與編碼SCCA的基因第46 66位核苷酸之互補(bǔ)鏈雜交的序列。文中所述的高嚴(yán)格雜交條件包括，例如鈉濃度約10至40mM、優(yōu)選地約20mM、溫度約50至70°C、優(yōu)選地約60至65 °C的條件。獲得的雙鏈RNA可以直接導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞，或者也可以預(yù)先將dsRNA與攜帶啟動(dòng)子、終止子等轉(zhuǎn)錄元件的載體連接后導(dǎo)入細(xì)胞。作為載體，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種載體，優(yōu)選PSilencer載體(Ambion)。通過(guò)向細(xì)胞導(dǎo)入含有上述雙鏈RNA的載體，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生了序列號(hào)1(或其變體)的有義鏈和序列號(hào)2 (或其變體)的反義鏈以及其有義鏈和反義鏈連結(jié)的短發(fā)夾RNA(shRNA)。shRNA隨后被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶-切丁酶切割成約21至23個(gè)堿基對(duì)的短鏈RNA(short interfering RNA)，復(fù)合體RISC形成后，引起切割SCCAmRNA的RNA干擾，結(jié)果是通過(guò)導(dǎo)入細(xì)胞抑制了 SCCA的表達(dá)。合適地，本發(fā)明中使用SCCA表達(dá)抑制基因例如上述雙鏈RNA和其他抑制SCCA表達(dá)的基因如反義DNA或RNA、適配子RNA或DNA等(以下簡(jiǎn)稱為“SCCA表達(dá)抑制基因”)作為用于抑制SCCA表達(dá)，結(jié)果預(yù)防和治療牛皮癬和鱗狀上皮細(xì)胞癌的藥物組合物的活性成分。上述SCCA表達(dá)抑制基因通過(guò)注射直接施與，也可以通過(guò)施與整合有所述基因的載體或質(zhì)粒的方法而施與患部。作為上述載體可例舉有腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，通過(guò)使用這些病毒載體，能夠更有效地施與SCCA表達(dá)抑制基因。另外，可以采用向脂質(zhì)體等磷脂小泡內(nèi)導(dǎo)入SCCA表達(dá)抑制基因，施與該脂質(zhì)體的方法。由于脂質(zhì)體是含有生物分解性材料的閉鎖小泡，通過(guò)脂質(zhì)體和基因的混合，使基因保留在脂質(zhì)體內(nèi)部的水層和脂質(zhì)雙分子層中(脂質(zhì)體-基因復(fù)合體)。然后，該復(fù)合體與細(xì)胞共同培養(yǎng)，復(fù)合體中的基因攝入至細(xì)胞內(nèi)(脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法)。然后，將得到的細(xì)胞按照以下的施與方法進(jìn)行施與。作為上述藥物組合物的施與方式，除常規(guī)的靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)等全身施與之外，還可以對(duì)存在腫瘤和牛皮癬的各組織進(jìn)行局部施與。進(jìn)一步地，還可采用導(dǎo)管技術(shù)、外科手術(shù)等組合的施與方式。本發(fā)明的藥物組合物的施與量根據(jù)年齡、性別、癥狀、施與途徑、施與次數(shù)、劑型不同，由醫(yī)師等決定合適方式。將質(zhì)粒DNA直接向靜脈內(nèi)施與，由于DNA被血液中的DNase等立即分解，使基因表達(dá)是困難的。因此，使用質(zhì)粒DNA的情況下，優(yōu)選地采用質(zhì)粒的直接注射法。該方法與使用病毒性載體的方法相比較，由于載體純化簡(jiǎn)單，能夠在短時(shí)間內(nèi)大量制備、對(duì)于導(dǎo)入基因的大小和注入時(shí)的濃度無(wú)限制，具備很多優(yōu)勢(shì)(Verma I M等人，Nature 389 =239-242,1997) 0DNA直接注射法是將經(jīng)純化的質(zhì)粒DNA在生理鹽水等中溶解，僅將其直接進(jìn)行肌肉內(nèi)注射即可。其結(jié)果是質(zhì)粒DNA被攝入至注射部位周邊的細(xì)胞中，整合至質(zhì)粒上的真核生物表達(dá)單元的基因產(chǎn)生表達(dá)，產(chǎn)生該基因產(chǎn)物。關(guān)于DNA直接注射法，現(xiàn)今肌肉內(nèi)注射正成為主流，也可以向腫瘤內(nèi)(Yang J P等人，Gene.Ther.3 :542-548，1996)、皮內(nèi)(HenggeU R 等人，J. Clin. Invest. 97 :2911-2916,1996 ；Choate K A 等人，Hum. Gene. Ther. 8 1659-1665,1997)等直接注射質(zhì)粒DNA。
肌肉內(nèi)注射質(zhì)粒DNA為例如將1 μ g至lmg，優(yōu)選地25 μ g至100 μ g的DNA溶解于50 μ 1的生理鹽水，進(jìn)行注射。由此4至7日后得到表達(dá)的最高值。確認(rèn)SCCA的表達(dá)抑制可通過(guò)例如直接測(cè)定細(xì)胞中的SCCA的量進(jìn)行。優(yōu)選地，通過(guò)從細(xì)胞中提取RNA，測(cè)定編碼SCCA的mRNA的量而確定。本領(lǐng)域公知mRNA提取、其量的測(cè)定，例如通過(guò)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行RNA的定量。另外，可利用SCCA特異性抗體進(jìn)行SCCA的測(cè)定，可通過(guò)本領(lǐng)域公知的例如利用熒光物質(zhì)、色素、酶等的免疫染色法，蛋白質(zhì)印跡法，免疫測(cè)定法，例如ELISA法、RIA等多種方法進(jìn)行SCCA的測(cè)定。除上述之外，還可以通過(guò)測(cè)定SCCA已知的生物活性，測(cè)定SCCA的表達(dá)量。除此之外，SCCA的表達(dá)可以通過(guò)原位雜交法和測(cè)定其生物活性來(lái)確定。通過(guò)本發(fā)明抑制SCCA表達(dá)的細(xì)胞優(yōu)選地為表皮細(xì)胞，例如顆粒細(xì)胞、有棘細(xì)胞等也行。另外，作為具有該細(xì)胞的哺乳動(dòng)物，除了人之外還有小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、兔、狗、貓、馬、牛、綿羊、豬、山羊、猿猴等非人哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的動(dòng)物和細(xì)胞還可以作為如下用途的模型動(dòng)物和細(xì)胞，用于例如闡明表皮的UV防御機(jī)能、預(yù)防或抑制UV對(duì)皮膚傷害的藥物的研究/開(kāi)發(fā)以及篩選。抑制角化不全的物質(zhì)的篩詵方法、通過(guò)該方法篩詵到的物質(zhì)和角化不全的抑制方法牛皮癬是皮膚病中的一種，是以表皮細(xì)胞的增殖/分化異常和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的慢性、再發(fā)性的炎癥性角化不全癥。認(rèn)為牛皮癬除遺傳因素之外還因多種環(huán)境因子而發(fā)病(Hopso-Havu 等人，British Journal of Dermatology (1983) 109，77-85)。SCCA 是由染色體18q21. 3上串聯(lián)排列的兩個(gè)基因SCCA-I基因和SCCA-2基因編碼。由它們編碼的蛋白質(zhì)SCCA-I和SCCA-2均為分子量約45，000的蛋白質(zhì)，同源性非常高，但是二者反應(yīng)部位的氨基酸序列不同，具有不同的功能Gchick等人，J.Biol. Chem. (1997) 27213，1849-55)。本發(fā)明的抑制表皮角化不全的物質(zhì)的篩選方法是以候選物質(zhì)的如下活性為指標(biāo)，即抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。作為半胱氨酸蛋白酶，理想地是，使用胱天蛋白酶14是最優(yōu)選的，也可以用其它胱天蛋白酶家族，或者從方便獲取的角度考慮可以用公知的所有其它半胱氨酸蛋白酶例如木瓜蛋白酶，組織蛋白酶例如組織蛋白酶B、組織蛋白酶L，菠蘿蛋白酶，無(wú)花果蛋白酶等替代。在合適的方案中，上述篩選方法由如下測(cè)試體系(1)、(2), (3)組成，其中測(cè)試體系(1)為測(cè)試半胱氨酸蛋白酶的活性的體系；測(cè)試體系(2)為僅有候選物質(zhì)存在下，測(cè)試半胱氨酸蛋白酶的活性的體系；測(cè)試體系( 為將候選物質(zhì)和SCCA-I預(yù)先孵育，在該孵育混合物存在下測(cè)試半胱氨酸蛋白酶的活性的體系。由于包括測(cè)試體系O)，能知道候選物質(zhì)自身對(duì)半胱氨酸蛋白酶的影響。再者，對(duì)測(cè)試體系(1)、(2)、(3)的實(shí)施順序無(wú)特別限制，只要測(cè)試條件相同，也可以在相同日期或不同日期測(cè)試。測(cè)定半胱氨酸蛋白酶的酶活性可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行，使用作為半胱氨酸蛋白酶的底物習(xí)慣使用的例如N α -苯甲?；?L-精氨酸4-硝基苯胺鹽酸鹽(L-BAPNA)。在特別合適的方案中，該篩選方法可以按照以下的方式進(jìn)行。(1)測(cè)試半胱氨酸蛋白酶的活性的體系在適當(dāng)?shù)臏y(cè)試用緩沖液，例如HEPES緩沖液中將半胱氨酸蛋白酶按照所設(shè)定的時(shí)間進(jìn)行孵育。然后，添加半胱氨酸蛋白酶的底物例如L-BAPNA，在所設(shè)定的溫度下按照所設(shè)定的時(shí)間進(jìn)行孵育后，使顯色，測(cè)定半胱氨酸蛋白酶的酶活性[X]。(2)僅有候選物質(zhì)存在下，測(cè)試半胱氨酸蛋白酶的活性的體系將上述測(cè)試用緩沖液和候選物質(zhì)按照所設(shè)定的時(shí)間進(jìn)行孵育后，添加半胱氨酸蛋白酶，在與(1)相同的條件下測(cè)定半胱氨酸蛋白酶的活性[y]。求出該半胱氨酸蛋白酶酶活性[y]相對(duì)于上述[χ]的％ {[y]/[χ] χ 100}ο{[y]/[χ] X 100}的值成為衡量上述試驗(yàn)物質(zhì)具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的指標(biāo)，即該值越接近100，則表示試驗(yàn)物質(zhì)具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性越低。另外，求出100與上述{[y]/[χ] X 100}值之間的差值{100-[y]/[x]X100}。這種情況下，該值越接近0，則表示試驗(yàn)物質(zhì)具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性越低。(3)測(cè)定含有SCCA-1、候選物質(zhì)和半胱氨酸蛋白酶的體系的酶活性將上述測(cè)試用緩沖液與SCCA-I混合，然后加入候選物質(zhì)，按照所設(shè)定的時(shí)間進(jìn)行孵育。在與(1)或( 相同的條件下測(cè)定半胱氨酸蛋白酶的活性[Z]。求出該半胱氨酸蛋白酶酶活性[ζ]相對(duì)于上述[χ]的％ {[ζ]/[χ] X 100}ο{[ζ]/[χ] X 100}值成為衡量SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性和試驗(yàn)物質(zhì)自身具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性總計(jì)的指標(biāo)，即該值越接近100，其總抑制活性越低。最后，求出{[ζ]/[χ] X 100}與{100-[y]/[x]X100}的差值。該差值越大，則在含有SCCA-1、候選物質(zhì)和半胱氨酸蛋白酶的體系中，SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性越低，即提示候選物質(zhì)顯著抑制SCCA-I的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。推定通過(guò)上述方法篩選的物質(zhì)具有抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性效果，進(jìn)而具有角化不全抑制功能，很有可能作為有效的角化不全抑制劑。這樣的物質(zhì)角化不全抑制功能的確認(rèn)，可應(yīng)于發(fā)生角化不全的皮膚例如模型動(dòng)物的皮膚，能夠簡(jiǎn)便地觀察治療效果。因此，本發(fā)明的篩選方法作為從眾多候選物質(zhì)例如生藥中一次篩選出表皮角化不全抑制物的方法是極為有用的。被認(rèn)為是角化不全的癥狀包括例如牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、汗腔角化癥、日光角化癥、脂漏性角化癥、扁平鱗癬等皮膚疾病，因此，通過(guò)本發(fā)明所述的篩選方法被選出的物質(zhì)對(duì)治療/預(yù)防上述皮膚病是有用的。本發(fā)明人通過(guò)上述篩選方法探討了各種生藥抑制SCCA-I所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的效果，發(fā)現(xiàn)水燭提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物和大棗提取物具有如上抑制效果。因此，在其它觀點(diǎn)中，本發(fā)明提供了抑制表皮角化不全的皮膚外用組合物，其特征在于含有選自水燭提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物和大棗提取物中的一種或幾種生藥作為活性成分。這些來(lái)自植物的提取物通過(guò)如下方式得到，即根據(jù)需要對(duì)植物原材料進(jìn)行干燥，進(jìn)而根據(jù)需要進(jìn)行切細(xì)或粉碎后，通過(guò)水性提取劑或有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。作為水性提取劑可使用例如冷水、溫水、沸水或較之低溫的熱水，另外，作為有機(jī)溶劑可使用例如甲醇、乙醇、1，3- 丁二醇、醚等，可常溫下或加熱后使用。本發(fā)明所述的外用組合物可以任意選擇使用1種或2種以上的上述提取物。上述提取物的含量?jī)?yōu)選地為前述外用組合物總量的0. 001 20. 0質(zhì)量％，更為優(yōu)選地為0.01 10.0質(zhì)量％。特別優(yōu)選地為0. 1 5.0質(zhì)量％。含量不滿0.001質(zhì)量％時(shí)，會(huì)出現(xiàn)本發(fā)明效果無(wú)法充分發(fā)揮的情形；另一方面，含量超過(guò)20.0質(zhì)量％時(shí)，會(huì)出現(xiàn)制劑化困難而不優(yōu)選。本發(fā)明的外用組合物通過(guò)常規(guī)方法制備即可，另外，也可制備單獨(dú)的上述提取物，但是除了上述提取物之外，通常用于化妝品和醫(yī)藥品等皮膚外用劑的成分例如油分、表面活性劑、粉末、色材、水、保濕劑、增粘劑、醇類、各種皮膚營(yíng)養(yǎng)劑、抗氧化劑、紫外線吸收齊U、香料、防腐劑等可以根據(jù)需要適當(dāng)?shù)嘏浜稀４送?，也可以適當(dāng)?shù)嘏浜弦叶匪囊宜岫c、乙二胺四乙酸三鈉、檸檬酸鈉、多磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡糖酸等金屬螯合劑，咖啡因、鞣酸、異搏定及其衍生物，甘草提取物、光甘草定、火棘果實(shí)的熱水提取物、各種生藥、醋酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其鹽等的藥劑，維生素C、抗壞血酸磷酸鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等的美白劑，葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等的糖類，視黃醇、視黃酸、視黃醇醋酸酯、視黃醇棕櫚酸酯等的維生素A類等。本發(fā)明的外用組合物可以作為化妝用品、準(zhǔn)藥品等，特別適合作為化妝用品用于外表皮膚，其劑型可采用如下多種劑型，水溶液體系、可溶化體系、乳化體系、粉末體系、油液體系、凝膠體系、軟膏體系、氣溶膠體系、水-油2層體系、水-油-粉末3層體系等。即如果是基礎(chǔ)化妝品，可以洗面產(chǎn)品，化妝水，乳液，面霜，凝膠，香精(美容液)，面膜，敷面膏等形式廣泛采用上述多種劑型。另外，如果是化妝用化妝品，可以以粉底等形式，作為洗護(hù)用品，可以以沐浴液、肥皂等形式而廣泛應(yīng)用。進(jìn)一步地，如果是準(zhǔn)藥品，可以以各種軟膏劑等形式廣泛應(yīng)用。因此，本發(fā)明的外用組合物采取的形式并不限定于上述劑型和形式。本發(fā)明進(jìn)一步地提供了通過(guò)抑制表皮細(xì)胞中SCCA-I所具有的胱天蛋白酶14抑制活性而謀求表皮細(xì)胞角化的正?；?，抑制表皮角化不全的方法。被認(rèn)為是角化不全的癥狀如上所述，可例舉如牛皮癬、特應(yīng)性皮炎、汗腔角化癥、日光角化癥、脂漏性角化癥、扁平鱗癬等皮膚疾病。優(yōu)選地，將本發(fā)明的皮膚外用組合物應(yīng)用于皮膚，對(duì)其用法、用量無(wú)特別限定，可根據(jù)皮膚外用組合物的劑型和所處置皮膚的角化不全狀態(tài)作出適宜的決定。下面，通過(guò)列舉具體實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明。并且，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例(ι) m^rr^mm /(1-i)免疫組織化學(xué)檢查表皮活組織檢查按照AmeX步驟進(jìn)行(Sato Y等人，Am. J. Pathol.，125，431-435(1986))，用冷丙酮固定后包埋于石蠟中。用二甲苯對(duì)切片進(jìn)行脫石蠟處理，用丙酮，然后用PBS洗滌。然后，用10%正常兔血清(Histofine，Tokyo, Japan)封閉該切片的非特異性結(jié)合部位。將表皮切片分別與抗SCCA-I 單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)(稀釋為 1 500)、抗 SCCA-2 單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，CA，USA)(稀釋為 1 500)或抗 SCCA 多克隆抗體(如 Takeda A.等人，J，Invest. Dermatol. 118,147-154(2002)中記載的方式純化)孵育。用PBS洗滌后，將切片用蘇木精復(fù)染，用DAKOEnvision System(DAK0 Corp.，CA，USA)進(jìn)行觀察。
圖1是收集自非露光部位的上臂部位(人M歲)，臀部(人46歲)，大腿部位(人75歲)獲得的表皮，以及自露光部位的頰部(人20歲，76歲)，眼瞼(人82歲)獲得的表皮作為表皮樣本，使用與SCCA-I和SCCA-2 二者結(jié)合的抗SCCA多克隆抗體作為抗體，進(jìn)行顯微鏡觀察的結(jié)果。根據(jù)圖1，表明了與非露光部位相比，露光部位的表皮上層中SCCA顯著增強(qiáng)。但是，即使在露光部位，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基底層中SCCA表達(dá)的增強(qiáng)。圖2是作為表皮樣本，對(duì)實(shí)施了 UV照射(透射儀TOREX FL205-E-30/DMR(ToshibaMedical Supply)的人表皮和沒(méi)有實(shí)施照射的對(duì)照表皮中分別的SCCA-I和SCCA-2的表達(dá)的顯微鏡觀察結(jié)果。分別使用抗SCCA-I單克隆抗體和抗SCCA-2單克隆抗體作為抗體。根據(jù)圖2，清楚了通過(guò)對(duì)人表皮照射UV，使SCCA-I和SCCA-2的表達(dá)均被增強(qiáng)。此外，在皮膚有棘層和顆粒層中表達(dá)增強(qiáng)顯著。根據(jù)上述內(nèi)容，清楚了如果表皮受到UV照射，在表皮中，尤其是在其有棘層和顆粒層中SCCA-I和SCCA-2的表達(dá)被增強(qiáng)。α-ii)定量 PCR 實(shí)驗(yàn)接著，進(jìn)行基因水平確認(rèn)表皮中SCCA-I和SCCA-2的表達(dá)由于UV照射而被增強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)。在角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基(GIBCO，Invitrogen)中，在L-谷氨酰胺和上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子存在下，在高濕度，5% CO2環(huán)境下，于37°C培養(yǎng)人角化細(xì)胞，對(duì)集密度為60-70% 的細(xì)胞照射 UVB 0-48 小時(shí)。使用透射儀 TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba MedicalSupply)，以50mJ/cm2的強(qiáng)度進(jìn)行UVB照射。對(duì)照細(xì)胞不進(jìn)行UVB照射。使用Isogen(Nippon Gene)，按照所附的說(shuō)明書(shū)，從上述培養(yǎng)細(xì)胞中分離純化總RNA。通過(guò)定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)確定SCCA-I和SCCA-2各自的表達(dá)水平。簡(jiǎn)而言之，用 Superscript II Qnvitrogen, Carlsbad，CA)使總 RNA 轉(zhuǎn)變?yōu)?cDNA。用 ABI PRISM7900HT 測(cè)序檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems, Foster City，CA)，進(jìn)行 40 個(gè) 2-步驟 PCR 循環(huán)，使所述樣本擴(kuò)增。使用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。使用的引物如下所示。SCCA-I 正向引物5' -GTGCTATCTGGAGTCCT-3‘(序列號(hào) 3)反向引物5' -CTGTTGTTGCCAGCAA-3‘(序列號(hào) 4)Taq Man 探針5' -CATCACCTACTTCAACT-3‘(序列號(hào) 5)SCCA-2 正向引物5' -CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3‘(序列號(hào) 6)反向引物5 ‘ -TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3 ‘(序列號(hào) 7)Taq Man 探針5' -AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3‘(序列號(hào) 8)
GAPDH 正向引物5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3‘(序列號(hào) 9)反向引物5' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3‘(序列號(hào) 10)Taq Man 探針5 ‘ -AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3 ‘(序列號(hào) 11)使報(bào)告色素(6-羧基-熒光素)與Taq Man探針序列的5’末端結(jié)合，然后使淬火色素(6-羧基-四甲基-羅丹明)整合入其3’末端。圖3中顯示了 UVB照射對(duì)培養(yǎng)的人角化細(xì)胞中SCCA表達(dá)的影響的結(jié)果。表明SCCA-I, SCCA-2均由于UVB照射而增強(qiáng)表達(dá)。因此，清楚了表皮細(xì)胞由于UV照射，在基因水平上SCCA-I，SCCA-2的表達(dá)增強(qiáng)。研究UV照射中SCCA的作用根據(jù)上述內(nèi)容，清楚了在表皮細(xì)胞中由于受到UV照射，SCCA-I和SCCA-2的表達(dá)增強(qiáng)。然后，研究了 SCCA-I和SCCA-2在受UV照射的表皮細(xì)胞中起什么作用。(1-iii) SCCA-I和2高表達(dá)細(xì)胞的建立3T3細(xì)胞(由ATCC獲得)是不表達(dá)SCCA-I和2的小鼠胎兒來(lái)源的細(xì)胞。以如下所述方式將編碼SCCA-I或2的基因?qū)氲竭@種細(xì)胞中。用Bam HI 和 Kpn I 雙重消化 SCCA-1 和 SCCA-2 的 cDNA (Takeda A 等人，J. Invest.Dermatol. 118,147-154(2002)) 將其亞克隆到 pTarget 載體中，然后用 LipofectaminePlus (GIBCO, Invitrogen Corp.)導(dǎo)入到3T3細(xì)胞中。簡(jiǎn)而言之，將675 μ 1無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基Qnvitrogen Corp.)中的20 μ g cDNA與75 μ 1的Plus試劑混合，于25°C放置15分鐘。向650 μ 1無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中添加Lipofectamine (100 μ 1)，然后將其加入到上述cDNA-Plus混合物中，然后于25°C放置15分鐘。將該cDNA混合物添加到IOml無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中，然后于37°C，5%C02環(huán)境下在其中培養(yǎng)3T3細(xì)胞4小時(shí)。將該培養(yǎng)基換成含有10% FCSdnvitrogen Corp.)的DMEM培養(yǎng)基，然后培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，以500 μ g/ml的終濃度添加G418 (Calbiochem)。培養(yǎng)期間G418保持在該濃度。每2_3天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)4周后，可以分離出若干G418抗性克隆，建立SCCA-I和SCCA-2表達(dá)細(xì)胞系。確認(rèn)導(dǎo)入了編碼SCCA-I的cDNA的細(xì)胞(SCCA-1導(dǎo)入細(xì)胞)特異且穩(wěn)定地表達(dá)SCCA-I,并確認(rèn)導(dǎo)入了編碼SCCA-2的cDNA的細(xì)胞(SCCA-2導(dǎo)入細(xì)胞)特異且穩(wěn)定地表達(dá)SCCA-2。此外，通過(guò)同樣的操作導(dǎo)入了非特異性序列的3T3細(xì)胞(對(duì)照細(xì)胞)既不表達(dá)SCCA-I，也不表達(dá) SCCA-2。采用上述SCCA-I導(dǎo)入細(xì)胞、SCCA-2導(dǎo)入細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，對(duì)表皮細(xì)胞施與UV照射時(shí)的SCCA-I、SCCA-2所產(chǎn)生的作用進(jìn)行研究。具體而言，研究了 SCCA-I、SCCA-2對(duì)于表皮細(xì)胞中UV誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡的作用。在含有10% FCS的DMEM培養(yǎng)基中，在高濕度、5% CO2環(huán)境下，于37°C培養(yǎng)上述各種細(xì)胞。對(duì)集密度為60-70%的細(xì)胞照射UVB 0-48小時(shí)。使用透射儀TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)，以 50mJ/cm2 的強(qiáng)度進(jìn)行 UVB 照射。對(duì)于這些細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡評(píng)價(jià)，使用FACS COULTER(EPIX XL-MCL，BeckmanCoulter)，通過(guò)以膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙錠(PI)雙重染色法(Armexin V-FITC試劑盒，Immunotech)作為指標(biāo)的FACS(熒光活性細(xì)胞分選儀)分析來(lái)進(jìn)行。結(jié)果如圖4所示。如圖4清楚所示，SCCA-I和SCCA-2導(dǎo)入細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)因UV照射引起的程序性細(xì)胞死亡顯著減少。因此，推定SCCA-I和SCCA-2均能夠抑制由UV誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡。為了確認(rèn)這一點(diǎn)，本發(fā)明人接下來(lái)通過(guò)RNA干擾法建立了 SCCA-I和SCCA-2敲低的細(xì)胞株，進(jìn)而對(duì)于表皮細(xì)胞內(nèi)的SCCA-I和SCCA-2在UV照射中的作用進(jìn)行研究。(1-iv)建立SCCA敲低的細(xì)胞HaCat 細(xì)胞(H. Hans.等人，Experimental Cell Research 239,399-410(1998))是高表達(dá)SCCA的人角化細(xì)胞。通過(guò)按照RNA干擾法，以pSilencer載體(Ambion)使siRNA(小干擾性RNA)在這種細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，建立SCCA-I和2敲低的細(xì)胞株。采用pSilencer載體，按照所附說(shuō)明書(shū)構(gòu)建siRNA。詳細(xì)的是，將這樣的雙鏈寡核苷酸克隆入pSilencer載體的HindIII部位和BamH I位點(diǎn)，所述雙鏈寡核苷酸由含有與編碼SCCA的基因中第46-66位核苷酸互補(bǔ)的21mer寡核苷酸(ACATGAACTT GGTGTTGGCT T 序列號(hào)1)的65mer有義寡核苷酸(序列號(hào)1 和含有與第46-66位核苷酸同源的21mer寡核苷酸(AAGCCAACAC CAAGTTCATG T 序列號(hào)2)的65mer反義寡核苷酸(序列號(hào)13)組成。使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，按照所附說(shuō)明書(shū)進(jìn)行對(duì)HaCat細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。使用這樣的雙鏈寡核苷酸制備對(duì)照細(xì)胞，所述雙鏈寡核苷酸由與哺乳動(dòng)物的基因序列不具有顯著同源性、互補(bǔ)性的兩條寡核苷酸組成。在潮霉素B選擇培養(yǎng)基中對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)4-6周，通過(guò)進(jìn)行選擇從而獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系。為了確認(rèn)SCCA的表達(dá)是否受到抑制，以上述方式，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定SCCA-I和SCCA-2的表達(dá)。有義寡核苷酸(序列號(hào)12)GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGAACATGAACTTGGTGTTGGCTT TTTTGGAAA(下劃線部分是同源區(qū)域)反義寡核苷酸(序列號(hào)13)AGCTTTTCCAAAA AAGCCAACACCAAGTTCATGTTCTCTTGAAACATGAACTTGGTGTTGGCCGG(下劃線部分是互補(bǔ)性區(qū)域)結(jié)果如圖5所示。確認(rèn)導(dǎo)入了上述siRNA的細(xì)胞中，與對(duì)照細(xì)胞相比，SCCA-I和2的表達(dá)均被抑制(敲低)90%以上。使用上述敲低細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，研究了 SCCA-I和2對(duì)表皮細(xì)胞中UV誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡的作用。在角質(zhì)形成細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基中(GIBCO，Invitrogen)，在L-谷氨酰胺和上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子存在下，在高濕度，5% CO2環(huán)境下，于37°C培養(yǎng)上述各種細(xì)胞。對(duì)集密度為60-70% 的細(xì)胞照射 UVB。使用透射儀 TOREX FL205-E-30/DMR (Toshiba Medical Supply),以50mJ/cm2的強(qiáng)度進(jìn)行UVB照射。使用FACS COULTER,通過(guò)以膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙錠(PI)雙重染色法作為指標(biāo)的FACS (熒光活性細(xì)胞分選儀)分析來(lái)進(jìn)行對(duì)于這些細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡評(píng)價(jià)。14/23 頁(yè)結(jié)果如圖6所示。對(duì)敲低細(xì)胞進(jìn)行UV照射，結(jié)果表明與對(duì)照細(xì)胞中38%的細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡相反，敲低細(xì)胞中約80%的細(xì)胞發(fā)生程序性細(xì)胞死亡。因此，認(rèn)為SCCA顯著抑制由UV照射誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡。因此，清楚了 SCCA承擔(dān)著表皮細(xì)胞的UV防御機(jī)制，另外，SCCA是具有程序性細(xì)胞死亡抑制作用的蛋白質(zhì)。(2)抑制角化不全的物質(zhì)的篩詵方法、通過(guò)該方法篩詵出的物質(zhì)和角化不全抑制方法(2-i)材料和方法材料Ac-WEHD-MCA, Ac-YVAD-MCA, Ac-VDVAD-MCA, Ac-DEVD-MCA, Ac-VEID-MCA,Ac-IETD-MCA、Ac-LEHD-MCA 購(gòu)自 P印tide Institute, Inc.(日本、大阪府)。芐氧羰基(X)-YVAD-FMK, Z-VDVSD-FMK、Z-DEVD-FMK, Z-VEID-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK 及 Z-VAD-FMK 購(gòu)自 BioVision (Mountain View, CA)。重組胱天蛋白酶 10購(gòu)自 BIOMOL Research Labs, Inc. (Plymouth Meeting, PA)。H-99抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc)用于胱天蛋白酶14的酶原形和大亞單位的檢測(cè)。H-99抗體是人胱天蛋白酶14中M-122位氨基酸所對(duì)應(yīng)肽產(chǎn)生的抗體，因此，可與胱天蛋白酶14酶原和其經(jīng)加工的形態(tài)即其大亞單位反應(yīng)。C-20抗體(Santa Cruz)用于胱天蛋白酶14小亞單位的檢測(cè)。開(kāi)裂部位特異性抗體(hl4D146)為使用對(duì)應(yīng)于人胱天蛋白酶14的推測(cè)加工部位的合成五肽TVGGD，通過(guò)對(duì)兔實(shí)施免疫而獲得的。(2-ii) WEHD-MCA水解活性的測(cè)定將Mikolajczyk J.等人，Biochemistry 43,10560-9(2004)所述的方法進(jìn)行或多或少的變更，以Ac-WEHD-MCA作為底物，測(cè)定胱天蛋白酶14的活性。簡(jiǎn)而言之，以45 μ L的0. IM HEPES 緩沖液(ρΗ 7. 5)、0· 06Μ NaCl、0. 01 % CHAPS、5mM DTT、1. 3M 檸檬酸鈉禾口 10 μ MTOHD-MCA制作測(cè)試混合物(全部以最終濃度表示)。向該混合物中加入酶樣品(5μ 1)，孵育10至30分鐘。加入150 μ 1的0. IM —氯代乙酸使反應(yīng)中止，然后，使用Fluoroskan AscentFL (Thermo Electron Co.，WoIsam, MA)于:355nm激發(fā)波長(zhǎng)和460nm發(fā)射波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。對(duì)抑制物進(jìn)行測(cè)試時(shí)，將胱天蛋白酶14和肽抑制物室溫下于測(cè)試緩沖液中孵育15分鐘，然后加入5 μ 1的100 μ M WEHD-MCA開(kāi)始測(cè)試。(2-iii)胱天蛋白酶14的純化從正常人的腳后跟部擦取的人角化細(xì)胞(約14g)于玻璃勻漿器中用含有0. 14MNaCl的0. IM Tris-HCKpH 8.0)進(jìn)行提取。15，OOOg離心60分鐘后，得上清液。用Amicon Ultra (Millipore, ΜΑ)進(jìn)行濃縮，經(jīng)快速脫鹽柱 HR10/10 (Amersham Biosciences)脫鹽后，將粗產(chǎn)物涂于Hift^p 16/10QXL柱。用20mM Tris-HCl (ρΗ 8.0)清洗柱子，經(jīng)0至IM線性NaCl梯度洗脫。通過(guò)使用抗胱天蛋白酶14抗體(H-99) (Santa CruzBiotechnology, CA)和hl4D146抗體的蛋白質(zhì)印跡分析對(duì)級(jí)分進(jìn)行追蹤。另外，測(cè)定各級(jí)分對(duì) Ac-Tyr-Glu-His-Asp-甲基-香豆酰胺(WEHD-MCA) (P印tide Institute, Inc.日本國(guó)大阪)的水解活性。將顯陽(yáng)性的級(jí)分上樣于經(jīng)同樣緩沖液平衡過(guò)的Mono Q柱，用最大IM的NaCl梯度進(jìn)行洗脫。胱天蛋白酶14級(jí)分進(jìn)一步地通過(guò)Mono S陽(yáng)離子交換層析分離。用20mM醋酸緩沖液(pH4. 5)對(duì)柱進(jìn)行平衡，然后用0至IM的NaCl梯度進(jìn)行洗脫。將顯陽(yáng)
16性的級(jí)分進(jìn)行濃縮，然后將其上樣于經(jīng)25mM乙醇氨(pH 8. 3)平衡的層析聚焦Mono P柱。使用46ml Polybuffer (pH 5. 0)，一邊形成pH 8至5的pH梯度，一邊進(jìn)行洗脫。胱天蛋白酶14使用Superdex 75凝膠層析進(jìn)行最終的純化。蛋白質(zhì)濃度由BioRad Protein AssayKit(BioRad Lab, Hercules, CA)確定。(2-iv)重組胱天蛋白酶14和SCCA-I的制備使用正向引物AAGGATCCAATCCGCGGTCTTTGGAAGAGGAG(序列號(hào)14)和反向引物TTTCTGCAGGTTGCAGATACAGCCGTTTCCGGAGGGTGC (序列號(hào) 1 通過(guò) PCR 將編碼胱天蛋白酶14的cDNA從角質(zhì)形成細(xì)胞cDNA中分離并擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物克隆入pQE_100DoubleTag載體Oliagen，Valencia, CA)中，隨后在大腸桿菌JM109中表達(dá)。從牛皮癬cDNA文庫(kù)(Takeda A等人，J. Invest. Dermatol. , 118,147-54(2002))中分離 SSCAl cDNA，然后克隆入 pQE30 載體(Quiagen)。通過(guò) Ni-NTA Agarose (Quiagen)和Mono Q層析純化重組蛋白質(zhì)。(2-v)免疫組織化學(xué)經(jīng)患者同意后，通過(guò)外科整形手術(shù)取得人頭皮試驗(yàn)片。將組織在磷酸緩沖液(PH7.4)中的4%低聚甲醛(PFA)固定，石蠟包埋。制備薄切片，于4°C放置一晚后與適宜的抗體一起孵育。使用連接有過(guò)氧化物酶的山羊抗兔IgG(Nichirei公司生產(chǎn))作為二次抗體，與作為顯色試劑的DAB反應(yīng)。進(jìn)行TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞和活性胱天蛋白酶的雙重免疫檢測(cè)時(shí)，使用連接有TexasRed(注冊(cè)商標(biāo))色素的抗兔IgG(驢)作為二次抗體。使用熒光素原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(Roche Diagnostics)，按照制備商提供的說(shuō)明書(shū)實(shí)施TUNEL反應(yīng)。進(jìn)行ICAD的蛋白質(zhì)印跡和免疫組織化學(xué)分析時(shí)，使用抗ICAD IgG(FL331，SantaCruz Biotechnology)禾口 DFF45/ICAD Ab_2(NeoMarkers, Fremont, CA)。有報(bào)道稱在活性特應(yīng)性皮炎(AD)患者的皮膚內(nèi)常常觀察到簇化的角化不全(Sakurai K.等人，J. Dermatol, ki. 30，37-42 (2002) ；Piloto Valdes, L.等人，Allergol.Immunopathol. (Madr) 18，321-4 (1990))。本實(shí)驗(yàn)中使用非侵入方法研究角化不全皮膚中ICAD和SCCA-I的定位。從AD或正常志愿者的皮膚收集表在性角化層，然后使用醫(yī)用粘著劑Aron Alpha A(Sankyo Co. ,Tokyo)使其附著于載玻片上。用3%低聚甲醛固定后，將樣品用0. 1% Triton X-100浸透，之后該樣品用抗ICAD或抗SCCA-I抗體于4°C免疫染色過(guò)夜。分別將Alexa Fluor 400接合型抗兔(ICAD)或抗小鼠IgG(SCCA-I)作為二次抗體，室溫孵育1小時(shí)。為了便于對(duì)核進(jìn)行視覺(jué)化觀察，將樣品在0. 碘化苯基偶氮二氨基吡啶溶液中浸潤(rùn)5分鐘，之后用PBS清洗3次。使用Leica DMLA顯微鏡進(jìn)行熒光觀察。(2-vi)蛋白質(zhì)印跡分析利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法，通過(guò)5至20%梯度的凝膠分離蛋白質(zhì)。電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚乙烯賴氨酸二氟化物膜(Immobilon-P、Millipore，Bedford, ΜΑ)上，之后與含有H-99，hl4D146或C20的抗胱天蛋白酶14抗體一起孵育。使用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG(Sigma)或抗山羊IgG作為二次抗體，之后使用ECL_pIus (Amersham)通過(guò)化學(xué)發(fā)光法使免疫反應(yīng)性蛋白可見(jiàn)。(2-vii)結(jié)果角化細(xì)胞中的胱天蛋白酶14為在Aspim處被加工
通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析，H-99抗體只能檢測(cè)出角化細(xì)胞提取物中的17KDa條帶(圖8)。該結(jié)果與含有未經(jīng)加工的30Kda結(jié)構(gòu)的來(lái)自全皮膚或皮膚等價(jià)模型的提取物的結(jié)果不一致。用hl4D146抗體也可識(shí)別該17KDa條帶(圖8B)，推測(cè)是活性胱天蛋白酶14(pl7)的大亞單位。這提示在終末分化的最終階段中通過(guò)Asp146的開(kāi)裂完成胱天蛋白酶14的成熟。進(jìn)一步地，在皮膚等價(jià)模型中，也可通過(guò)H-99和hl4D146抗體識(shí)別30KDa條帶，這提示在Asp146進(jìn)行了切割。(2-viii)自角化細(xì)胞提取物制備胱天蛋白酶14角化細(xì)胞中的胱天蛋白酶14的大部分是經(jīng)加工過(guò)的結(jié)構(gòu)，因此，推測(cè)以活性型存在(Eckhart L.等 A, ]. Invest. Dermatol. 115,1148-51 (2000) ；Lippens S.等人，Cell Death Differ. 7,1218-24(2000) ；Mikolajczyk, J.等人，Biochemistry 43，10560-W2004))，從而認(rèn)為人角化細(xì)胞是極好的胱天蛋白酶14純化源。但是，還知道人角化細(xì)胞含有胱天蛋白酶 1 樣酶(Takahashi T.，J. Invest. Dermatol. Ill, 367-72 (1998)) 胱天蛋白酶1的底物，例如WEHD-底物能夠被胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶14 二者水解。本發(fā)明人首先在有無(wú)1. 3M檸檬酸鈉和5mM 二硫蘇糖醇存在下，試驗(yàn)由胱天蛋白酶1引起的水解TOHD-MCA。明確了在標(biāo)準(zhǔn)胱天蛋白酶測(cè)試緩沖液中，盡管TOHD-MCA是胱天蛋白酶1的極好底物，但存在cosmotropic離子時(shí)，胱天蛋白酶1不能水解該底物(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，通過(guò)如下3種方法對(duì)各個(gè)級(jí)分進(jìn)行評(píng)價(jià)，即對(duì)TOHD-MCA的水解活性、對(duì)H-99的反應(yīng)性和hl4D146抗體。表1表示連續(xù)層析的結(jié)果。使用Hift~ep Q柱進(jìn)行最初的陰離子交換層析后，收率增加170%，比活性增加約10倍。認(rèn)為以上增加大概是由于將胱天蛋白酶14自內(nèi)源性抑制物隔離而造成的。蛋白質(zhì)印跡分析顯示級(jí)分No. 16至20是含有分子量為17Kda的H-99且14D146均陽(yáng)性的條帶。認(rèn)為這些級(jí)分也具有TOHD-MCA水解活性。后續(xù)的Mono Q陰離子交換層析中，如根據(jù)17Kda大小且H-99和hl4D146均陽(yáng)性的條帶進(jìn)行判斷，級(jí)分No. 25至No.四含有經(jīng)加工形式的胱天蛋白酶14。只有這些級(jí)分顯示有WEHD-MCA水解活性。Mono S陽(yáng)離子層析和Mono P層析聚焦對(duì)于去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)是有效的，從而使比活性分別增加3. 5倍和7倍。另外，只有H-99且hl4D146均陽(yáng)性的級(jí)分顯示TOHD-MCA水解活性。Superdex 75層析最后階段分離出分子量30Kda的峰，該峰與TOHD-MCA水解活性峰一致。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法顯示該制備物含有17Kda和IlKDa片段。前者對(duì)H-99抗體和hl4D146抗體均顯陽(yáng)性，后者被C20抗體識(shí)別。以上提示人胱天蛋白酶14作為由大亞單位(17KDa)和小亞單位(IlKDa)組成的異二聚體被純化。另外，Superdex 75凝膠層析顯示人角化細(xì)胞中的胱天蛋白酶14與其他胱天蛋白酶不同，是像粒酶B活化型那樣作為單體存在的。表1匯總了胱天蛋白酶14的純化率。以約IOOmg可溶性蛋白質(zhì)提取物為起始物，可得到11. 8μ g純化蛋白質(zhì)。比活性增加764倍，收率為9. 1%。
權(quán)利要求
1.水燭提取物、葡萄提取物、番茄提取物、黃瓜提取物、獼猴桃提取物和大棗提取物中的1種或幾種生藥的用途，用于作為活性成分制備抑制表皮角化不全的皮膚外用組合物。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述皮膚外用組合物含有水燭提取物。
3.權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述表皮角化不全是由牛皮癬引起的。
4.權(quán)利要求1或2所述的用途，其中所述表皮角化不全是由特應(yīng)性皮炎引起的。
全文摘要
在第一觀點(diǎn)中，本發(fā)明提供了通過(guò)抑制細(xì)胞的鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCCA)的表達(dá)，治療和/或預(yù)防選自牛皮癬和鱗狀上皮細(xì)胞癌的疾病的方法。在其它觀點(diǎn)中，本發(fā)明提供了抑制表皮角化不全的物質(zhì)的篩選方法，所述方法的特征在于以候選物質(zhì)抑制鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原-1(SCCA-1)所具有的半胱氨酸蛋白酶抑制活性的活性為指標(biāo)。
文檔編號(hào)A61K36/185GK102552564SQ20121003173
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2005年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月18日
發(fā)明者仲西城太郎, 日比野利彥, 片桐千華 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂