專利名稱：負(fù)載干細(xì)胞的心包膜、及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種醫(yī)用材料，尤其涉及一種用于盆底重建及腹壁疝氣修補(bǔ)的負(fù)載干細(xì)胞的脫細(xì)胞心包膜、及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
盆底損傷及功能退化造成的女性盆底器官脫垂(Pelvic Organ ftx)lapSe，P0P)和壓カ性尿失禁(Stress Urinary Incontinence, SUI)嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量，并已成為較為突出的社會生活問題。造成女性盆底器官脫垂的原因包括產(chǎn)傷、神經(jīng)肌肉的損傷、環(huán)境因素及遺傳因素等。治療盆底器官脫垂，除了功能訓(xùn)練外，手術(shù)重建是主要的治療方法。傳統(tǒng)的外科治療行陰道前后壁修補(bǔ)和子宮切除術(shù)，兩者均不能提高組織本身的強(qiáng)度，未能達(dá)到盆底解剖結(jié)構(gòu)重建的目的，故術(shù)后復(fù)發(fā)率高。近年來，合成網(wǎng)片材料在盆底重建手術(shù)中得到了廣泛應(yīng)用，隨機(jī)對照試驗(yàn)表明應(yīng)用網(wǎng)片的盆底重建手術(shù)的術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯低于傳統(tǒng)盆底修補(bǔ)木。盆底重建手術(shù)中使用的合成網(wǎng)片材料多為聚丙烯、聚乙烯網(wǎng)片，其孔隙率較高，組織融合較佳，具有良好的生物力學(xué)性能。如楊蘋等在《聚丙烯網(wǎng)片在治療女性盆底障礙性疾病手術(shù)中的應(yīng)用研究》(河北醫(yī)藥， 2010年第18期)一文中公開了使用人工合成聚丙烯網(wǎng)片進(jìn)行盆底修補(bǔ)和重建，具有經(jīng)濟(jì)， 微創(chuàng)，盆底整體修復(fù)可保留子宮，并發(fā)癥少，術(shù)后復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點(diǎn)，近期效果肯定；李懷芳等在《聚丙烯網(wǎng)片在女性全盆底功能重建中的應(yīng)用》(中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2007年第8 期)一文中探討了聚丙烯網(wǎng)片在保留子宮的同時進(jìn)行盆底重建的可行性和有效性，中、短期療效穩(wěn)定。但是人工合成網(wǎng)片仍存在較多并發(fā)癥，如侵蝕(Erosion)、暴露(Exposure)、感染(Infection)、疼痛(Pain)、性交不適(Dyspareunia)等影響患者術(shù)后生活質(zhì)量。Daniel Altman等人對比分析了傳統(tǒng)外科手術(shù)和使用聚乙烯補(bǔ)片手術(shù)的兩種患者，結(jié)果，使用聚乙烯補(bǔ)片與傳統(tǒng)修補(bǔ)術(shù)相比，短期改善效果更好，但是有更多的術(shù)后并發(fā)癥和返エ修補(bǔ)的需要。從目前盆底修復(fù)和重建外科的發(fā)展趨勢來看，網(wǎng)片修補(bǔ)比傳統(tǒng)修補(bǔ)術(shù)有更好的應(yīng)用前景，網(wǎng)片的材質(zhì)也在不斷的經(jīng)歷嘗試和革新，但是仍需要制備具有更高改善率和更少并發(fā)癥的網(wǎng)片，因此，制備新的盆底重建醫(yī)用材料是盆底重建領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前盆底重建材料存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種用于盆底重建的新的材料、以及所述材料的制備方法，以脫細(xì)胞心包膜為基材，負(fù)載干細(xì)胞，制成一種負(fù)載干細(xì)胞的心包膜補(bǔ)片。本發(fā)明的第一個目的是提供一種制備所述負(fù)載干細(xì)胞心包膜的方法，步驟包括 步驟1，將心包膜進(jìn)行脫細(xì)胞、化學(xué)交聯(lián)改性制備脫細(xì)胞心包膜；
步驟2，將脫細(xì)胞心包膜與干細(xì)胞共培養(yǎng)，得到負(fù)載干細(xì)胞脫的細(xì)胞心包膜。
其中，所述干細(xì)胞選自脂肪干細(xì)胞、骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞、羊膜干細(xì)胞。其中，所述心包膜可以是牛心包膜、羊心包膜、豬心包膜。本發(fā)明所述的制備負(fù)載干細(xì)胞的心包膜的方法，步驟2中所述共培養(yǎng)方法包括: 干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)；消化收集培養(yǎng)后的干細(xì)胞接種于脫細(xì)胞心包膜上，然后進(jìn)行培養(yǎng)。其中，干細(xì)胞接種于脫細(xì)胞心包膜時的接種濃度優(yōu)選為IX IO4個/cm2。其中，所述消化收集的培養(yǎng)后的干細(xì)胞優(yōu)選為第4代干細(xì)胞。其中，所述培養(yǎng)溫度為優(yōu)選為35 38 °C，更優(yōu)選為37で。本發(fā)明的第二個目的是提供ー種上述方法制備的負(fù)載干細(xì)胞的心包膜。本發(fā)明的第三個目的是提供ー種上述負(fù)載干細(xì)胞的心包膜的應(yīng)用，所述負(fù)載干細(xì)胞的心包膜用于制備盆底重建及腹壁疝氣修補(bǔ)材料。優(yōu)選地，所述盆底重建材料為負(fù)載干細(xì)胞的心包膜補(bǔ)片。所述負(fù)載干細(xì)胞的心包膜補(bǔ)片厚度優(yōu)選為(0. 5士0. 2)mm。本發(fā)明制備的負(fù)載干細(xì)胞的心包膜補(bǔ)片，干細(xì)胞與心包膜粘附性良好，細(xì)胞分泌基質(zhì)旺盛，通過增殖檢測，干細(xì)胞在心包膜上增值速度快，說明具有良好的生物相容性。本發(fā)明所述負(fù)載干細(xì)胞的心包膜補(bǔ)片，可用于臨床盆底重建及腹壁疝氣修補(bǔ)外科，能夠制作成一種新的重建材料，為減少重建術(shù)后并發(fā)癥提供有意義的參考。


圖1為HE染色觀察脫細(xì)胞牛心包膜照片； 圖2為掃描電鏡觀察脫細(xì)胞牛心包膜照片；
圖3為兔脂肪干細(xì)胞原代培養(yǎng)第二天倒置相差顯微鏡照片； 圖4為熒光倒置相差顯微鏡觀察兔脂肪干細(xì)胞在脫細(xì)胞牛心包膜； 圖5為掃描電鏡觀察兔脂肪干細(xì)胞在脫細(xì)胞牛心包膜上粘附生長情況照片； 圖6為兔脂肪干細(xì)胞牛心包膜體外復(fù)合培養(yǎng)增殖曲線圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種負(fù)載干細(xì)胞的心包膜、所述負(fù)載干細(xì)胞心包膜的制備方法和應(yīng)用，利用化學(xué)交聯(lián)的脫細(xì)胞心包膜與干細(xì)胞共培養(yǎng)，最終獲得負(fù)載干細(xì)胞的脫細(xì)胞心包膜。下面通過具體實(shí)施了對本發(fā)明負(fù)載干細(xì)胞的心包膜、及其制備方法和應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的介紹和描述，以使更好地理解本發(fā)明內(nèi)容，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1
步驟1，將牛心包膜進(jìn)行脫細(xì)胞、化學(xué)交聯(lián)改性制備脫細(xì)胞牛心包膜牛心包膜從正常小牛壁層心包膜中獲取，經(jīng)過脫細(xì)胞、清洗、抗病毒和環(huán)氧乙烷化學(xué)交聯(lián)改性處理后，凍干，電子束消毒備用。成品脫細(xì)胞牛心包膜材料為瓷白色膜狀物，柔軟，富有弾性。圖1為HE (蘇木精-伊紅)染色脫細(xì)胞牛心包膜在200倍放大倒置相差顯微鏡下觀察的照片，從圖中可以看出，脫細(xì)胞牛心包膜由呈波浪狀、染成紅色的膠原纖維組成，光滑面纖維排列緊密，粗糙面纖維排列疏松，無細(xì)胞殘留。
掃描電鏡100倍放大觀察脫細(xì)胞牛心包膜，電鏡照片見圖2，可見脫細(xì)胞牛心包膜纖維排列致密且方向較一致，纖維保存完好，無細(xì)胞殘留。步驟2，將脫細(xì)胞牛心包膜與干細(xì)胞共培養(yǎng)，得到負(fù)載干細(xì)胞脫細(xì)胞牛心包膜 2. 1.兔脂肪干細(xì)胞(rADSCs)的分離和培養(yǎng)
取兔腹股溝部皮下脂肪組織2. (Γ3. Og,充分剪碎后，加入0. 1% I型膠原酶溶液20mL， 在37°C恒溫?fù)u床消化60min后，2000r/min離心lOmin，除去上清液并獲得高密度的細(xì)胞沉淀物，加入培養(yǎng)液使細(xì)胞重懸，此即為脂肪干細(xì)胞。按IO6個/mL的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，加入培養(yǎng)液至8mL。將接種好細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%C02、100%飽和濕度的條件下，培養(yǎng)4 后首次換液。倒100倍放大置相差顯微鏡下觀察見大量的細(xì)胞貼壁和漂浮的血細(xì)胞(圖3)，細(xì)胞伸展呈成纖維細(xì)胞樣，生長有方向性。用PBS反復(fù)輕輕沖洗去除漂浮的細(xì)胞，加入培養(yǎng)液。隔天換液，細(xì)胞融合至80%傳代。本實(shí)施例中選用第4代rADSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2. 2. Dio標(biāo)記的rADSCs接種于脫細(xì)胞牛心包膜材料
消化收集第4代rADSCs后，用無血清的LG-DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至5 X IO5個/mL。每毫升細(xì)胞懸液加5μ 的DiO染液，混合均勻。放入培養(yǎng)箱孵育20min，1500r/min離心5min，棄上清。用含10%FBS的LG-DMEM液清洗2次后把標(biāo)記好的rADSCs按1 X IO4個/cm2接種在大小為IOmmX IOmmXO. 5mm的脫細(xì)胞牛心包膜材料上，置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時后加GM 液，以剛沒過材料為宜，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，掃面電鏡觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。100倍倒置熒光顯微鏡觀察(圖4和圖5) :DiO標(biāo)記的兔脂肪干細(xì)胞-脫細(xì)胞牛心包復(fù)合物體外培養(yǎng)5d吋，可見帶綠色熒光的細(xì)胞均勻黏附于脫細(xì)胞牛心包膜材料上；細(xì)胞形態(tài)呈纖維樣或卵圓形，以卵圓形為主(圖4)。100倍掃描電鏡觀察兔脂肪干細(xì)胞-脫細(xì)胞牛心包膜復(fù)合物體外培養(yǎng)5d時，細(xì)胞與材料黏附良好，細(xì)胞分泌基質(zhì)較旺盛，與脫細(xì)胞牛心包膜材料連成一體(圖5)。收集第4代rADSCs重懸后，以1 X IO4個/cm2的密度接種于脫細(xì)胞牛心包膜支架材料上，置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時后加培養(yǎng)液，以剛沒過材料為宜，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。接種后1，2，3，4，5，6，7，8天取樣本做DNA含量檢測各復(fù)合物碾碎后分別放入EP管中，加入 500 μ L蛋白酶K (0. 5mg/mL)溶液56°C水浴過夜，12000g離心10分鐘，收集上清液。各待測樣本40 μ L加入黑色96孔板，各孔加入160 μ L Hoechest 33258工作液，37°C避光孵育 20min,輕彈板孔后，酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長465nm，通過DNA含量計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。兔脂肪干細(xì)胞-脫細(xì)胞牛心包膜復(fù)合物的體外増殖檢測(圖6)兔脂肪干細(xì)胞在脫細(xì)胞牛心包上増殖良好，3、d時增勢速度最快，6d時兔脂肪干細(xì)胞在脫細(xì)胞牛心包上增殖達(dá)到頂峰，以后増殖基本趨緩，說明rADSCs與牛心包膜具有良好的生物相容性。實(shí)施例2
參照實(shí)施例1所述方法，采用豬心包膜作為基材，將小鼠骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞接種于脫細(xì)胞豬心包膜上共培養(yǎng)，DNA定量法測定顯示小鼠骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞在交聯(lián)脫細(xì)胞豬心包膜上増殖良好，DIO染色標(biāo)記跟蹤小鼠骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞在交聯(lián)脫細(xì)胞豬心包膜上生長良好，掃描電鏡觀察示小鼠骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞在交聯(lián)脫細(xì)胞豬心包膜上的形態(tài)正常，分泌細(xì)胞基質(zhì)旺盛。將本發(fā)明上述實(shí)施例制備的負(fù)載干細(xì)胞的心包膜制成用于盆底重建的補(bǔ)片，動物實(shí)驗(yàn)表明，相比于人工合成網(wǎng)片(聚乙烯和聚丙烯)，幾乎不會出現(xiàn)新的壓カ性尿失禁，并且沒有出現(xiàn)并發(fā)癥；此外還可以用于腹壁疝氣修補(bǔ)。以上對本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備負(fù)載干細(xì)胞的心包膜的方法，其特征在干，步驟包括 步驟1，將心包膜進(jìn)行脫細(xì)胞、化學(xué)交聯(lián)改性制備脫細(xì)胞心包膜；步驟2，將脫細(xì)胞心包膜與干細(xì)胞共培養(yǎng)，得到負(fù)載干細(xì)胞脫細(xì)胞心包膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在干，所述干細(xì)胞選自脂肪干細(xì)胞、骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞、羊膜干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在干，步驟2中所述共培養(yǎng)方法包括干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)；消化收集培養(yǎng)后的干細(xì)胞接種于脫細(xì)胞心包膜上，然后進(jìn)行共iロ養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在干，所述心包膜選自牛心包膜、羊心包膜、豬心包膜。
5.ー種上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述方法制備的負(fù)載干細(xì)胞的心包膜。
6.ー種包括權(quán)利要求5所述的負(fù)載干細(xì)胞的心包膜應(yīng)用，其特征在干，所述負(fù)載干細(xì)胞的心包膜用于制備盆底重建材料及腹壁疝氣修補(bǔ)材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在干，所述盆底重建及腹壁疝氣修材料為負(fù)載干細(xì)胞的心包膜補(bǔ)片。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種負(fù)載干細(xì)胞的心包膜的制備方法、將干細(xì)胞接種于脫細(xì)胞的心包膜上，制備出一種負(fù)載干細(xì)胞的心包膜、以及負(fù)載干細(xì)胞的心包膜補(bǔ)片。干細(xì)胞與脫細(xì)胞心包膜之間具有良好的生物相容性，制作過程簡單易行，不涉及任何有毒有害試劑，所制備的負(fù)載干細(xì)胞的心包膜及其補(bǔ)片可用于臨床盆底重建及腹壁疝修補(bǔ)外科。
文檔編號A61L27/38GK102552997SQ20121000570
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者馮潔, 吳氫凱, 崔磊, 楊軍, 滕銀成, 程慧 申請人:上海市第六人民醫(yī)院